黑眶蟾蜍抗菌肽及其基因和應用的製作方法

2023-07-04 07:21:06

黑眶蟾蜍抗菌肽及其基因和應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種黑眶蟾蜍抗菌肽及其基因，該黑眶蟾蜍抗菌肽的胺基酸序列如SEQIDNO：2所示，編碼黑眶蟾蜍抗菌肽的基因核苷酸序列如SEQIDNO：1所示，通過固相多肽合成手段獲得的黑眶蟾蜍抗菌肽對多種微生物包括臨床分離的多藥物耐受病原體具有強大的抗菌活性，並且抗菌作用迅速，無明顯溶血活性。黑眶蟾蜍抗菌肽具有體外生產方便、抗菌作用強大、迅速和安全等特點，可做為新型抗菌藥物進行應用。
【專利說明】黑眶蟾蜍抗菌肽及其基因和應用

【技術領域】
[0001] 本發明提供一種黑眶蟾蜍抗菌肽基因獲取、合成及應用，屬於生物醫學【技術領域】。

【背景技術】
[0002] 黑眶蟾蜍，無尾目，蟾蜍科，蟾蜍屬，是傳統蟾蜍類中藥材(蟾酥、幹蟾、蟾皮和蟾 衣)的主要來源之一。近年，大量的研究表明蟾酥藥理活性譜極廣，具有抗腫瘤、強心、升壓、 興奮呼吸、鎮咳平喘、利尿、興奮平滑肌、抗血小板聚集、抗炎、增強免疫力及局麻藥等作用。 20世紀80年代蟾酥應用於臨床，用於治療惡性腫瘤、各種感染性疾病、慢性肝炎、骨髓炎、 周圍性面神經麻痺、止痛麻醉等。目前對蟾蜍類藥物活性成分的研究主要集中在小分子化 合物上，主要發現的有蟾蜍留烯、環氧蟾蜍內酯類、蟾毒色胺類（bufotenines)和留醇類等。
[0003] 有實驗表明蟾酥對金黃色葡萄球菌和甲型溶血性鏈球菌感染的家兔，具有明顯的 治療效果；且抑菌效果迅速，對一些抗生素不敏感或耐受的化膿性感染病原體亦有抑制效 果，但其物質基礎不甚清晰。2010年，研究人員對黑眶蟾蜍皮膚分泌物進行了初步的分離純 化，得到一種耐熱、pH穩定和抗菌譜廣的抗菌物質。該抗菌物質經胰蛋白酶水解後，抑菌活 性完全喪失，說明該抑菌活性成分為蛋白多肽類物質。但該蛋白多肽成分的序列以及具體 功能現今未明。發明人通過基因工程手段獲得了黑眶蟾蜍抗菌肽的基因序列，並對其進行 了多肽合成與性質研究。
[0004] 發明人將本發明所述的黑眶蟾蜍抗菌肽胺基酸全序列及其編碼基因分別對蛋白 質資料庫和基因資料庫進行了比對搜索，均未發現有任何相同序列信息。


【發明內容】

[0005] 本發明的目的在於提供一種黑眶蟾蜍抗菌肽，該黑眶蟾蜍抗菌肽的胺基酸序列如 SEQ ID N0 :2所示，其是一種單鏈多肽，分子量4161. 268道爾頓，等電點11. 11。
[0006] 本發明另一目的是提供一種編碼所述黑眶蟾蜍抗菌肽的基因，其核苷酸序列如 SEQ ID N0 :1 所示。 黑眶蟾蜍抗菌肽基因的克隆方法如下： 黑眶蟾蜍皮膚總RNA提取、反轉錄及設計引物並利用PCR方法篩選黑眶蟾蜍抗菌肽基 因，其中正向擴增引物長度為24個核苷酸，其序列如SEQ ID N0 :3所示，反向擴增引物長度 為23個核苷酸，其序列如SEQ ID N0 :4所示；所獲陽性單克隆進行基因核苷酸序列測定， 基因測序結果表明編碼黑眶蟾蜍抗菌肽的基因由495個核苷酸組成，自5'端至3'端序列 為： atgaggagct ggaggctgtc tctgctgctg gtctctgcag tcacattaca cggctgtctc 60 tctgaccctg cagagcctga ggtccaagat ggaagatcta tagaagatgt catcgacctc 120 tacaaccaga gggagggggt cacatactta tataaatccc tggaccagct gccccctgtt 180 ccaatggagg aggatgagaa tccgaacaga agaggcttta tcatgaaaga gaccgtgtgc 240 ctcaaatccg agaatcctga tttaacccag tgtgatttca agcctgacgg agatgtgaag 300 atctgttctc tggatttggg ggatgaggat cctgaggata tcatgtgctt cagtctgaac 360 aaggaggtcc gtatgaagcg gtccagcaga aggaaaccat gcaaggggtg gctctgcaag 420 ctgaagctaa gaggaggtta tactcttatc ggcagtgcta caaacctaaa tagacctacc 480 tacgtgaggg cataa 495 編碼黑眶蟾蜍成熟抗菌肽為第382 - 492位核苷酸，其胺基酸序列為： Ser Ser Arg Arg Lys Pro Cys Lys Gly Trp Leu Cys Lys Leu Lys Leu 15 10 15 Arg Gly Gly Tyr Thr Leu lie Gly Ser Ala Thr Asn Leu Asn Arg Pro 20 25 30 Thr Tyr Val Arg Ala 35 黑眶蟾蜍抗菌肽的製備方法為多肽固相合成法，通過HPLC反相C18柱純化。該抗菌肽 具有強大的抗菌活性。
[0007] 本發明另一目的是將黑眶蟾蜍抗菌肽應用在製備新型抗菌藥物中。
[0008] 本發明中所用黑眶蟾蜍來源於雲南省西雙版納州，從農貿市場購得。
[0009] 本發明的有益效果在於： 由黑眶蟾蜍抗菌肽編碼基因推導其胺基酸結構，合成的黑眶蟾蜍抗菌肽具有廣譜抗菌 活性，尤其對臨床多藥物耐受病原體仍具有良好的生物活性，且無溶血作用。該黑眶蟾蜍抗 菌肽具有結構簡單、人工合成方便、抗菌活性強、抗菌譜廣和無明顯副作用的特點。
[0010] 本發明提供的黑眶蟾蜍抗菌肽在6 μ Μ-12 μ Μ濃度時可有效抑制多種病原體(包 括臨床分離的多藥物耐受病原體)，與微生物接觸後15分鐘內即可殺滅98%的細菌。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0011] 圖1是本發明中黑眶蟾蜍抗菌肽的殺菌動力學結果示意圖，圖中Wholehkcath代 表黑眶蟾蜍抗菌肽，Control為未加入抗菌肽的陰性對照。

【具體實施方式】
[0012] 下面通過實施例對本發明作進一步詳細說明，但本發明的內容並不局限於此，本 實施例中方法如無特殊說明的均按常規方法操作，所用試劑如無特殊說明的採用常規試劑 或按常規方法配置的試劑。
[0013] 實施例1 :黑眶蟾蜍抗菌肽基因的克隆 一、黑眶蟾蜍皮膚總RNA提取： A、 活體黑眶蟾蜍用水清洗乾淨，放入液氮中速凍4小時，取皮膚組織，稱重，取300 mg 皮膚組織，加入10 ml總RNA提取緩衝液（Trizol溶液，美國Invitrogen公司產品），於20 ml玻璃勻漿器中勻漿10分鐘； B、 加入等體積酚/氯仿溶液，振蕩混勻，室溫放置10分鐘，4°C，12000rpm離心10分鐘， 吸取上層水相液體； C、 上清加入1/2體積的異丙醇，室溫放置10分鐘，4°C下7500g離心10分鐘，沉澱用 75%乙醇洗一次，晾乾，管底沉澱物即為黑眶蟾蜍皮膚總RNA。
[0014] 二、黑眶蟾蜍皮膚cDNA文庫合成 米用 CL0NTECH 公司 Creator? SMART? cDNA Library Construction Kit cDNA 文庫 構建試劑盒，參照試劑盒說明書方法操作如下： A、 cDNA第一鏈合成（mRNA反轉錄）： 1、 在0. 5 ml無菌的離心管加入1 μ?黑眶蟾蜍皮膚總RNA、1 μ? SMART IV寡聚核 苷酸、1 μ 1 CDS 111/3' PCR引物與2 μ 1去離子水； 2、 混勻離心管中的試劑並短暫離心，72°C保溫2分鐘； 3、 將離心管在冰上孵育2分鐘； 4、 在離心管中加入2. 0 μ? 5X第一鏈緩衝液、1.0 μ? 20mM二硫蘇糖醇、Ι.ΟμΙ 10 mM dNTP混合物、Ι.ΟμΙ PowerScript反轉錄酶，混勻； 5、 短暫離心，在42°C保溫1小時； 6、 將離心管置於冰上中止第一鏈的合成； 7、 移取2 μ 1所合成的cDNA第一鏈備用； B、 採用長末端聚合酶鏈式反應（LD- PCR )方法擴增第二鏈 1、 951：預熱？0?儀； 2、 將2 μ? cDNA第一鏈產物、80 μ? 去離子水、10 μ? lOXAdvantage 2 PCR 緩衝、 2以150父(1階13混合物、2 415'？0?引物、2 410)5 111/3'？0?引物以及2 410嫩 聚合酶混合後，進行PCR擴增反應； 3、 在PCR儀中按以下程序擴增： (1) 預變性 95 °C 20秒鐘 (2) 22個循環： 95 °C 5秒鐘 68 °C 6分鐘 4、 循環結束後，將離心管中合成的cDNA雙鏈進行後續過程。
[0015] 三、黑眶蟾蜍抗菌肽編碼基因的擴增 1、 951：預熱？0?儀； 2、 將2 μ? cDNA雙鏈(上述產物)、75.5 μ?去離子水、10 μ? PCR緩衝液、 8 μ? dNTP混合物(各2.5 μΜ)、2 μ?正向擴增引物、2 μ?反向擴增引物以及 0.5 μι DNA聚合酶於離心管中進行反應。正向擴增引物長度為24個核苷酸，其序 列為5' -atgaggagctggaggctgtctctg-3'，反向擴增引物長度為23個核苷酸，序列為 -ttatgccctcacgtaggtaggtc -3、
[0016] 3、在PCR儀中按以下程序擴增： (1) 預變性 95 °C 5分鐘 (2) 25個循環： 95 °C 30秒鐘 56 °C 40秒鐘 72 °C 30秒鐘 (3)後擴增 72 °C 5分鐘 4、循環結束後，將PCR產物用TIANGEN公司的DNA產物純化試劑盒進行抽提回收，步 驟如下： (1) 將PCR產物與等體積的膜結合緩衝顛倒混勻，然後將其轉入離心純化柱，室溫靜 置5分鐘，使DNA充分與矽膠膜結合。12000 rpm離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液； (2) 加入700 μ?的漂洗液(含乙醇）於離心純化柱中，12000 rpm離心1分鐘，倒掉收 集管中的廢液； (3) 重複步驟2 ; (4) 12000 rpm 離心 3 分鐘； (5) 將離心純化柱置於新的離心管中； (6) 加入30 μ?洗脫緩衝液，在室溫下靜置5分鐘； (7) 12000 rpm離心1分鐘，管底溶液即為純化過的黑眶蟾蜍抗菌肽編碼基因 PCR產 物。
[0017] 四、大腸桿菌DH5a感受態細胞的製備 1、 挑取單個DH5a菌落，接種於3 ml不含氨苄青黴素的LB培養基中，37°C培養過夜， 次日取上述菌液按比例1:100再接種於50 ml LB培養基中，37°C振蕩約2小時。當0D600 值達到0. 35時，收穫細菌培養物； 2、 將細菌轉移到一個50 ml預冷的無菌聚丙烯管中，冰上放置10 min，使培養物冷卻； 3、 於4°C下8000 g離心10 min，吸出培養液； 4、 每 50 ml 初始培養液用 30 ml 預冷的 0· 1 M CaCl2-MgCl2 溶液（80 mM MgCl2,20 mM CaCl2)重懸細胞沉澱； 5、 於4°C下8000 g離心10 min，吸出上清液，並將管倒置1 min以使殘留的液體流盡； 6、 每50 ml初始培養物用2 ml預冷的0. 1 M CaCl2溶液重懸細胞沉澱，分裝後備用。
[0018] 五、連接及連接產物的轉化 1、 在微量離心管中加入1 μ? Takara PMD19-T simple載體、4 μι黑眶蟾蜍抗菌肽編 碼基因 PCR產物及5 μ 1的連接酶緩衝混合物； 2、 16°C反應3小時； 3、 全量（10 μ 1)加入至100 μ 1 DH5a感受態細胞中，冰中放置30分鐘； 4、 42 C加熱90秒鐘後，再在冰中放直1分鐘； 5、 加入37°C溫浴過的LB培養基890 μ 1，37°C緩慢振蕩培養60分鐘； 6、 取200 μ 1塗布於含有X-Gal、IPTG、氨苄青黴素的LB培養基上，37°C培養16小時 以形成單菌落。
[0019] 六、黑眶蟾蜍抗菌肽編碼基因克隆篩選及鑑定 挑取上述單菌落於含氨苄青黴素的LB培養基中，37°C緩慢振蕩培養4小時，進行 PCR擴增。擴增引物及擴增條件同前述黑眶蟾蜍抗菌肽編碼基因的擴增；將經PCR確證 的陽性克隆進行質粒提取後，以美國Applied Biosystems3730A全自動核苷酸序列測定 儀進行核苷酸序列的測定；測序引物為BcaBESTTM Sequencing Primer M13-47 (5，-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC -3'），基因測序結果自5'端至3'端序列如SEQ ID NO :1所 /_J、1 ο
[0020] 黑眶蟾蜍抗菌肽基因核苷酸序列長度為495個鹼基，序列類型：核酸，鏈數：單鏈， 拓撲學：直鏈狀，序列種類：cDNA，來源：黑眶蟾蜍皮膚。
[0021] 編碼黑眶蟾蜍成熟抗菌肽為第382 - 492位，其胺基酸序列如SEQ ID N0 :2所示。 其中包含兩個半胱氨酸殘基，形成一對二硫鍵。
[0022] 實施例2 :黑眶蟾蜍抗菌肽的應用 一、黑眶蟾蜍抗菌肽的製備方法 根據編碼黑眶蟾蜍抗菌肽的基因推導出黑眶蟾蜍抗菌肽的胺基酸序列，用自動多肽合 成儀合成其全序列，通過HPLC反相C18柱層析脫鹽、純化。
[0023] 二、黑眶蟾蜍抗菌肽的質量評價與分子量測定 純化的黑眶蟾蜍抗菌肽用高效液相色譜HPLC方法鑑定其純度，並採用基質輔助雷射 解析電離飛行時間質譜（MALDI-T0F-MS )測定其精確分子量，最後用自動胺基酸測序儀測定 胺基酸序列結構以進行確證。
[0024] 三、黑眶蟾蜍抗菌肽藥理活性檢測 1、抗菌活性檢測 採用二倍稀釋法進行最小抑制濃度（minimal inhibitory concentration, MIC) 的檢測，受試菌株為溶血葡萄球菌)、表皮葡萄球菌 (成r/ococciAs )、大腸埃希菌 r&cAericAia co/i )、甲型副傷寒沙門氏 菌(/kraijpAi 4)、奠腸球菌（/?ierococcws /aeca/is)、弗勞地枸橡酸杆 菌(CYiroAacier />·(9?/7￡/?)、肺炎克雷伯菌(Z/e/wieBa 金黃色葡萄球菌 {Staphylococcus aureus、。
[0025] 以上菌株接種於LB固體培養基上，37°C培養箱中倒置培養。待菌落長出後，用接 種環挑取單菌落轉接到LB液體培養基中，37°C培養箱震蕩培養至對數生長期。在紫外分 光光度計上檢測菌液0D600,根據1 0D600=1 X 109 CFU/ml將菌液用液體LB培養基稀釋至 2X105 CFU/ml。在無菌96孔板各孔中預先加入100 μ? LB液體培養基，然後在第一孔中 加入100 μ 1稀釋到一定濃度的經0. 22 Mm微孔濾膜過濾除菌的黑眶蟾蜍抗菌肽樣品，混 勻後取100 μ 1加入第2孔，依次倍比稀釋，從第10孔吸出100 μ 1棄去，至此二倍濃度梯 度樣品即製備好，各孔的濃度分別為48 μ Μ、24 μ Μ、12 μ Μ、6 μ Μ和3 μ Μ，同時設立陰性 對照和陽性對照。
[0026] 以肉眼觀察未見微生物生長濃度為最小抑制濃度。
[0027] 結果如表1所示，黑眶蟾蜍抗菌肽對多種受試菌株均具有良好的抗菌活性，最小 抑菌濃度不超過12 μΜ。值得注意的是，敏感菌株中，大腸埃希菌13Α10022、大腸埃希菌 13U1780和肺炎克雷伯菌13Α13361為臨床分離的多藥物耐受病原體。
[0028] 表1黑眶蟾蜍抗菌肽的最小抑菌濃度

【權利要求】
1. 一種黑眶蟾蜍抗菌肽，其特徵在於：所述黑眶蟾蜍抗菌肽的胺基酸序列如SEQ ID NO :2所示。
2. 編碼權利要求1所述黑眶蟾蜍抗菌肽的基因，其特徵在於：核苷酸序列如SEQ ID NO :1所示。
3. 權利要求1所述的黑眶蟾蜍抗菌肽在製備抗菌藥物中的應用。
【文檔編號】A61P31/04GK104119434SQ201410307750
【公開日】2014年10月29日 申請日期:2014年7月1日 優先權日:2014年7月1日
【發明者】宋玉竹, 王梅, 孫鷖, 劉娃, 張阿梅, 韓芹芹, 張金陽 申請人:昆明理工大學