肝癌相關蛋白及其編碼序列和用途的製作方法

2023-07-03 23:27:51 1

專利名稱：肝癌相關蛋白及其編碼序列和用途的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物技術和醫學領域，具體地說，本發明涉及新的人肝癌相關蛋白肝癌相關蛋白及其編碼序列。
背景技術：
肝癌是危害人類健康的主要疾病之一。為了有效地治療和預防肝癌，目前人們已越來越關注腫瘤的基因治療。因此，本領域迫切需要開發研究具有與肝癌有關的人蛋白及其激動劑/抑制劑。

發明內容
本發明的目的是提供一種新的人肝癌相關蛋白肝癌相關蛋白以及其片段、類似物和衍生物。
本發明的另一目的是提供編碼這些多肽的多核苷酸。
本發明的另一目的是提供生產這些多肽的方法以及該多肽和編碼序列的用途。
在本發明的第一方面，提供新穎的分離出的肝癌相關蛋白，它是含有SEQ IDNO1-75所示的胺基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。
較佳地，該多肽選自下組(a)具有SEQ ID NO1-75所示的胺基酸序列的多肽；(b)將SEQ ID NO1-75所示的胺基酸序列經過一個或多個胺基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有相同功能的由(a)衍生的多肽。
更佳地，該多肽是具有SEQ ID NO1-75所示的胺基酸序列的多肽。
在本發明的第二方面，提供編碼分離的這些多肽的多核苷酸，該多核苷酸包含一核苷酸序列，該核苷酸序列與選自下組的一種核苷酸序列有至少70％相同性(a)編碼上述人肝癌相關蛋白的多核苷酸；和(b)與多核苷酸(a)互補的多核苷酸。
在本發明的第三方面，提供了含有上述多核苷酸的載體，以及被該載體轉化或轉導的宿主細胞或者被上述多核苷酸直接轉化或轉導的宿主細胞。
在本發明的第四方面，提供了製備具有人肝癌相關蛋白活性的多肽的方法，該方法包含(a)在適合表達人肝癌相關蛋白的條件下，培養上述被轉化或轉導的宿主細胞；(b)從培養物中分離出具有人肝癌相關蛋白活性的多肽。
在本發明的第五方面，提供了與上述的人肝癌相關蛋白特異性結合的抗體。
在本發明的第六方面，提供了模擬、促進、拮抗人肝癌相關蛋白活性的化合物，以及抑制人肝癌相關蛋白的表達的化合物。還提供了篩選和/或製備這些化合物的方法。較佳地，該化合物是人肝癌相關蛋白的編碼序列或其片段的反義序列。
在本發明的第七方面，提供了檢測樣品中是否存在肝癌相關蛋白的方法，它包括將樣品與肝癌相關蛋白的特異性抗體接觸，觀察是否形成抗體複合物，形成了抗體複合物就表示樣品中存在肝癌相關蛋白。
本發明的其它方面由於本文的技術的公開，對本領域的技術人員而言是顯而易見的。
具體實施例方式
在本發明中，術語「肝癌相關蛋白」、「肝癌相關蛋白」或「肝癌相關蛋白肝癌相關蛋白」可互換使用，都指具有人肝癌相關蛋白肝癌相關蛋白胺基酸序列(SEQ ID NO1-75)的蛋白或多肽。它們包括含有或不含起始甲硫氨酸的肝癌相關蛋白肝癌相關蛋白。
如本文所用，「分離的」是指物質從其原始環境中分離出來(如果是天然的物質，原始環境即是天然環境)。如活體細胞內的天然狀態下的多聚核苷酸和多肽是沒有分離純化的，但同樣的多聚核苷酸或多肽如從天然狀態中同存在的其他物質中分開，則為分離純化的。
如本文所用，「分離的肝癌相關蛋白或多肽」是指肝癌相關蛋白基本上不含天然與其相關的其它蛋白、脂類、糖類或其它物質。本領域的技術人員能用標準的蛋白質純化技術純化肝癌相關蛋白。基本上純的多肽在非還原聚丙烯醯胺凝膠上能產生單一的主帶。肝癌相關蛋白的純度能用胺基酸序列分析。
本發明的多肽可以是重組多肽、天然多肽、合成多肽，優選重組多肽。本發明的多肽可以是天然純化的產物，或是化學合成的產物，或使用重組技術從原核或真核宿主(例如，細菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動物細胞)中產生。根據重組生產方案所用的宿主，本發明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本發明的多肽還可包括或不包括起始的甲硫氨酸殘基。
本發明還包括人肝癌相關蛋白的片段、衍生物和類似物。如本文所用，術語「片段」、「衍生物」和「類似物」是指基本上保持本發明的天然人肝癌相關蛋白相同的生物學功能或活性的多肽。本發明的多肽片段、衍生物或類似物可以是(i)有一個或多個保守或非保守性胺基酸殘基(優選保守性胺基酸殘基)被取代的多肽，而這樣的取代的胺基酸殘基可以是也可以不是由遺傳密碼編碼的，或(ii)在一個或多個胺基酸殘基中具有取代基團的多肽，或(iii)成熟多肽與另一個化合物(比如延長多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的胺基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前導序列或分泌序列或用來純化此多肽的序列或蛋白原序列，或與抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根據本文的教導，這些片段、衍生物和類似物屬於本領域熟練技術人員公知的範圍。
在本發明中，術語「人肝癌相關蛋白」指具有人肝癌相關蛋白活性的SEQ IDNO1-75序列的多肽。該術語還包括具有與人肝癌相關蛋白相同功能的、SEQ IDNO1-75序列的變異形式。這些變異形式包括(但並不限於)一個或多個(通常為1-50個，較佳地1-30個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)胺基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數個(通常為20個以內，較佳地為10個以內，更佳地為5個以內)胺基酸。例如，在本領域中，用性能相近或相似的胺基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數個胺基酸通常也不會改變蛋白質的功能。該術語還包括人肝癌相關蛋白的活性片段和活性衍生物。
該多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導突變體、在高或低的嚴緊度條件下能與人肝癌相關蛋白DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗人肝癌相關蛋白的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發明還提供了其他多肽，如包含人肝癌相關蛋白或其片段的融合蛋白(如SEQ ID NO3所示的融合蛋白)。除了幾乎全長的多肽外，本發明還包括了人肝癌相關蛋白的可溶性片段。通常，該片段具有人肝癌相關蛋白序列的至少約10個連續胺基酸，通常至少約30個連續胺基酸，較佳地至少約50個連續胺基酸，更佳地至少約80個連續胺基酸，最佳地至少約100個連續胺基酸。
發明還提供人肝癌相關蛋白或多肽的類似物。這些類似物與天然人肝癌相關蛋白的差別可以是胺基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導的遺傳變異體。誘導變異體可以通過各種技術得到，如通過輻射或暴露於誘變劑而產生隨機誘變，還可通過定點誘變法或其他已知分子生物學的技術。類似物還包括具有不同於天然L-胺基酸的殘基(如D-胺基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的胺基酸(如β、γ-胺基酸)的類似物。應理解，本發明的多肽並不限於上述例舉的代表性的多肽。
修飾(通常不改變一級結構)形式包括體內或體外的多肽的化學衍生形式如乙醯化或羧基化。修飾還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進一步加工步驟中進行糖基化修飾而產生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露於進行糖基化的酶(如哺乳動物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化胺基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優化了溶解性能的多肽。
在本發明中，「人肝癌相關蛋白保守性變異多肽」指與SEQ ID NO1-75中任一的胺基酸序列相比，有至多10個，較佳地至多8個，更佳地至多5個，最佳地至多3個胺基酸被性質相似或相近的胺基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據表1進行胺基酸替換而產生。
表1


本發明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組DNA或人工合成的DNA。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。編碼成熟多肽的編碼區序列可以與SEQ ID NO1-75蛋白的編碼區序列相同或者是簡併的變異體。
編碼SEQ ID NO1-75的成熟多肽的多核苷酸包括只編碼成熟多肽的編碼序列；成熟多肽的編碼序列和各種附加編碼序列；成熟多肽的編碼序列(和任選的附加編碼序列)以及非編碼序列。
術語「編碼多肽的多核苷酸」可以是包括編碼此多肽的多核苷酸，也可以是還包括附加編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。
本發明還涉及上述多核苷酸的變異體，其編碼與本發明有相同的胺基酸序列的多肽或多肽的片段、類似物和衍生物。此多核苷酸的變異體可以是天然發生的等位變異體或非天然發生的變異體。這些核苷酸變異體包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本領域所知的，等位變異體是一個多核苷酸的替換形式，它可能是一個或多個核苷酸的取代、缺失或插入，但不會從實質上改變其編碼的多肽的功能。
本發明還涉及與上述的序列雜交且兩個序列之間具有至少50％，較佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本發明特別涉及在嚴格條件下與本發明所述多核苷酸可雜交的多核苷酸。在本發明中，「嚴格條件」是指(1)在較低離子強度和較高溫度下的雜交和洗脫，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)雜交時加有變性劑，如50％(v/v)甲醯胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)僅在兩條序列之間的相同性至少在90％以上，更好是95％以上時才發生雜交。並且，可雜交的多核苷酸編碼的多肽與SEQ ID NO1-75所示的成熟多肽有相同的生物學功能和活性。
本發明還涉及與上述的序列雜交的核酸片段。如本文所用，「核酸片段」的長度至少含15個核苷酸，較好是至少30個核苷酸，更好是至少50個核苷酸，最好是至少100個核苷酸以上。核酸片段可用於核酸的擴增技術(如PCR)以確定和/或分離編碼肝癌相關蛋白的多聚核苷酸。
本發明中的多肽和多核苷酸優選以分離的形式提供，更佳地被純化至均質。
本發明的人肝癌相關蛋白核苷酸全長序列或其片段通常可以用PCR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。對於PCR擴增法，可根據本發明所公開的有關核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設計引物，並用市售的cDNA庫或按本領域技術人員已知的常規方法所製備的cDNA庫作為模板，擴增而得有關序列。當序列較長時，常常需要進行兩次或多次PCR擴增，然後再將各次擴增出的片段按正確次序拼接在一起。
一旦獲得了有關的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關序列。這通常是將其克隆入載體，再轉入細胞，然後通過常規方法從增殖後的宿主細胞中分離得到有關序列。
此外，還可用人工合成的方法來合成有關序列，尤其是片段長度較短時。通常，通過先合成多個小片段，然後再進行連接可獲得序列很長的片段。
目前，已經可以完全通過化學合成來得到編碼本發明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然後可將該DNA序列引入本領域中已知的各種現有的DNA分子(或如載體)和細胞中。此外，還可通過化學合成將突變引入本發明蛋白序列中。
應用PCR技術擴增DNA/RNA的方法(Saiki，et al.Science 1985；2301350-1354)被優選用於獲得本發明的基因。特別是很難從文庫中得到全長的cDNA時，可優選使用RACE法(RACE-cDNA末端快速擴增法)，用於PCR的引物可根據本文所公開的本發明的序列信息適當地選擇，並可用常規方法合成。可用常規方法如通過凝膠電泳分離和純化擴增的DNA/RNA片段。
本發明也涉及包含本發明的多核苷酸的載體，以及用本發明的載體或肝癌相關蛋白編碼序列經基因工程產生的宿主細胞，以及經重組技術產生本發明所述多肽的方法。
通過常規的重組DNA技術(Science，1984；2241431)，可利用本發明的多聚核苷酸序列可用來表達或生產重組的肝癌相關蛋白。一般來說有以下步驟(1).用本發明的編碼人肝癌相關蛋白的多核苷酸(或變異體)，或用含有該多核苷酸的重組表達載體轉化或轉導合適的宿主細胞；(2).在合適的培養基中培養的宿主細胞；(3).從培養基或細胞中分離、純化蛋白質。
本發明中，人肝癌相關蛋白多核苷酸序列可插入到重組表達載體中。術語「重組表達載體」指本領域熟知的細菌質粒、噬菌體、酵母質粒、植物細胞病毒、哺乳動物細胞病毒如腺病毒、逆轉錄病毒或其他載體。在本發明中適用的載體包括但不限於在細菌中表達的基於T7的表達載體(Rosenberg，et al.Gene，1987，56125)；在哺乳動物細胞中表達的pMSXND表達載體(Lee and Nathans，JBio Chem.2633521，1988)和在昆蟲細胞中表達的來源於杆狀病毒的載體。總之，只要能在宿主體內複製和穩定，任何質粒和載體都可以用。表達載體的一個重要特徵是通常含有複製起點、啟動子、標記基因和翻譯控制元件。
本領域的技術人員熟知的方法能用於構建含人肝癌相關蛋白編碼DNA序列和合適的轉錄/翻譯控制信號的表達載體。這些方法包括體外重組DNA技術、DNA合成技術、體內重組技術等(Sambroook，et al.Molecular Cloning，a LaboratoryManual，cold Spring Harbor Laboratory.New York，1989)。所述的DNA序列可有效連接到表達載體中的適當啟動子上，以指導mRNA合成。這些啟動子的代表性例子有大腸桿菌的lac或trp啟動子；λ噬菌體PL啟動子；真核啟動子包括CMV立即早期啟動子、HSV胸苷激酶啟動子、早期和晚期SV40啟動子、反轉錄病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核細胞或其病毒中表達的啟動子。表達載體還包括翻譯起始用的核糖體結合位點和轉錄終止子。
此外，表達載體優選地包含一個或多個選擇性標記基因，以提供用於選擇轉化的宿主細胞的表型性狀，如真核細胞培養用的二氫葉酸還原酶、新黴素抗性以及綠色螢光蛋白(GFP)，或用於大腸桿菌的四環素或氨苄青黴素抗性。
包含上述的適當DNA序列以及適當啟動子或者控制序列的載體，可以用於轉化適當的宿主細胞，以使其能夠表達蛋白質。
宿主細胞可以是原核細胞，如細菌細胞；或是低等真核細胞，如酵母細胞；或是高等真核細胞，如哺乳動物細胞。代表性例子有大腸桿菌，鏈黴菌屬；鼠傷寒沙門氏菌的細菌細胞；真菌細胞如酵母；植物細胞；果蠅S2或Sf9的昆蟲細胞；CHO、COS、293細胞、或Bowes黑素瘤細胞的動物細胞等。
本發明的多核苷酸在高等真核細胞中表達時，如果在載體中插入增強子序列時將會使轉錄得到增強。增強子是DNA的順式作用因子，通常大約有10到300個鹼基對，作用於啟動子以增強基因的轉錄。可舉的例子包括在複製起始點晚期一側的100到270個鹼基對的SV40增強子、在複製起始點晚期一側的多瘤增強子以及腺病毒增強子等。
本領域一般技術人員都清楚如何選擇適當的載體、啟動子、增強子和宿主細胞。
用重組DNA轉化宿主細胞可用本領域技術人員熟知的常規技術進行。當宿主為原核生物如大腸桿菌時，能吸收DNA的感受態細胞可在指數生長期後收穫，用CaCl2法處理，所用的步驟在本領域眾所周知。另一種方法是使用MgCl2。如果需要，轉化也可用電穿孔的方法進行。當宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉染方法磷酸鈣共沉澱法，常規機械方法如顯微注射、電穿孔、脂質體包裝等。
獲得的轉化子可以用常規方法培養，表達本發明的基因所編碼的多肽。根據所用的宿主細胞，培養中所用的培養基可選自各種常規培養基。在適於宿主細胞生長的條件下進行培養。當宿主細胞生長到適當的細胞密度後，用合適的方法(如溫度轉換或化學誘導)誘導選擇的啟動子，將細胞再培養一段時間。
在上面的方法中的重組多肽可在細胞內、或在細胞膜上表達、或分泌到細胞外。如果需要，可利用其物理的、化學的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些方法是本領域技術人員所熟知的。這些方法的例子包括但並不限於常規的復性處理、用蛋白沉澱劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超處理、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術及這些方法的結合。
重組的人肝癌相關蛋白或多肽有多方面的用途。這些用途包括(但不限於)直接做為藥物治療肝癌相關蛋白功能低下或喪失所致的疾病，和用於篩選促進或對抗肝癌相關蛋白功能的抗體、多肽或其它配體。用表達的重組人肝癌相關蛋白篩選多肽庫可用於尋找有治療價值的能抑制或刺激人肝癌相關蛋白功能的多肽分子。
另一方面，本發明還包括對人肝癌相關蛋白DNA或是其片段編碼的多肽具有特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，尤其是單克隆抗體。這裡，「特異性」是指抗體能結合於人肝癌相關蛋白基因產物或片段。較佳地，指那些能與人肝癌相關蛋白基因產物或片段結合但不識別和結合於其它非相關抗原分子的抗體。本發明中抗體包括那些能夠結合併抑制人肝癌相關蛋白的分子，也包括那些並不影響人肝癌相關蛋白功能的抗體。本發明還包括那些能與修飾或未經修飾形式的人肝癌相關蛋白基因產物結合的抗體。
本發明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab』或(Fab)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子(Ladner等人，美國專利No.4,946,778)；或嵌合抗體，如具有鼠抗體結合特異性但仍保留來自人的抗體部分的抗體。
本發明的抗體可以通過本領域內技術人員已知的各種技術進行製備。例如，純化的人肝癌相關蛋白基因產物或者其具有抗原性的片段，可被施用於動物以誘導多克隆抗體的產生。與之相似的，表達人肝癌相關蛋白或其具有抗原性的片段的細胞可用來免疫動物來生產抗體。本發明的抗體也可以是單克隆抗體。此類單克隆抗體可以利用雜交瘤技術來製備(見Kohler等人，Nature256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6292，1976；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodies and T CellHybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。本發明的抗體包括能阻斷人肝癌相關蛋白功能的抗體以及不影響人肝癌相關蛋白功能的抗體。本發明的各類抗體可以利用人肝癌相關蛋白基因產物的片段或功能區，通過常規免疫技術獲得。這些片段或功能區可以利用重組方法製備或利用多肽合成儀合成。與人肝癌相關蛋白基因產物的未修飾形式結合的抗體可以用原核細胞(例如E. Coli)中生產的基因產物來免疫動物而產生；與翻譯後修飾形式結合的抗體(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核細胞(例如酵母或昆蟲細胞)中產生的基因產物來免疫動物而獲得。
抗人肝癌相關蛋白的抗體可用於免疫組織化學技術中，檢測活檢標本中的人肝癌相關蛋白。
本發明中的抗體可用於治療或預防與人肝癌相關蛋白相關的疾病。給予適當劑量的抗體可以刺激或阻斷人肝癌相關蛋白的產生或活性。
抗體也可用於設計成針對體內某一特殊部位的免疫毒素。如人肝癌相關蛋白高親和性的單克隆抗體可與細菌或植物毒素(如白喉毒素，蓖麻蛋白，紅豆鹼等)共價結合。一種通常的方法是用巰基交聯劑如SPDP，攻擊抗體的氨基，通過二硫鍵的交換，將毒素結合於抗體上，這種雜交抗體可用於殺滅人肝癌相關蛋白陽性的細胞。
多克隆抗體的生產可用人肝癌相關蛋白或多肽免疫動物，如家兔，小鼠，大鼠等。多種佐劑可用於增強免疫反應，包括但不限於弗氏佐劑等。
利用本發明蛋白，通過各種常規篩選方法，可篩選出與肝癌相關蛋白發生相互作用的物質，如受體、抑制劑、激動劑或拮抗劑等。
本發明蛋白及其抗體、抑制劑、激動劑、拮抗劑或受體等，當在治療上進行施用(給藥)時，可提供不同的效果。通常，可將這些物質配製於無毒的、惰性的和藥學上可接受的水性載體介質中，其中pH通常約為5-8，較佳地pH約為6-8，儘管pH值可隨被配製物質的性質以及待治療的病症而有所變化。配製好的藥物組合物可以通過常規途徑進行給藥，其中包括(但並不限於)肌內、腹膜內、靜脈內、皮下、皮內、或局部給藥。
本發明的多肽可直接用於疾病治療，例如，用於肝癌方面的治療。在使用本發明肝癌相關蛋白時，還可同時使用其他治療劑。
本發明還提供了一種藥物組合物，它含有安全有效量的本發明肝癌相關蛋白或其激動劑、拮抗劑以及藥學上可接受的載體或賦形劑。這類載體包括(但並不限於)鹽水、緩衝液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。藥物製劑應與給藥方式相匹配。本發明的藥物組合物可以被製成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規方法進行製備。諸如片劑和膠囊之類的藥物組合物，可通過常規方法進行製備。藥物組合物如針劑、溶液、片劑和膠囊宜在無菌條件下製造。活性成分的給藥量是治療有效量，例如每天約1微克/千克體重-約5毫克/千克體重。此外，本發明的多肽還可與其他治療劑一起使用。
使用藥物組合物時，是將安全有效量的肝癌相關蛋白或其拮抗劑、激動劑施用於哺乳動物，其中該安全有效量通常至少約10微克/千克體重，而且在大多數情況下不超過約8毫克/千克體重，較佳地該劑量是約10微克/千克體重-約1毫克/千克體重。當然，具體劑量還應考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫師技能範圍之內的。
人肝癌相關蛋白的多聚核苷酸也可用於多種治療目的。基因治療技術可用於治療由於肝癌相關蛋白的無表達或異常/無活性的肝癌相關蛋白的表達所致的細胞增殖、發育或代謝異常。重組的基因治療載體(如病毒載體)可設計成表達變異的肝癌相關蛋白，以抑制內源性的肝癌相關蛋白活性。來源於病毒的表達載體如逆轉錄病毒、腺病毒、腺病毒相關病毒、單純皰疹病毒、細小病毒等可用於將肝癌相關蛋白基因轉移至細胞內。構建攜帶肝癌相關蛋白基因的重組病毒載體的方法可見於已有文獻(Sambrook，et al.)。另外重組人肝癌相關蛋白基因可包裝到脂質體中，然後再轉移至細胞內。
抑制人肝癌相關蛋白mRNA的寡聚核苷酸(包括反義RNA和DNA)以及核酶也在本發明的範圍之內。核酶是一種能特異性分解特定RNA的酶樣RNA分子，其作用機制是核酶分子與互補的靶RNA特異性雜交後進行核酸內切作用。反義的RNA和DNA及核酶可用已有的任何RNA或DNA合成技術獲得，如固相磷酸醯胺化學合成法合成寡核苷酸的技術已廣泛應用。反義RNA分子可通過編碼該RNA的DNA序列在體外或體內轉錄獲得。這種DNA序列已整合到載體的RNA聚合酶啟動子的下遊。為了增加核酸分子的穩定性，可用多種方法對其進行修飾，如增加兩側的序列長度，核糖核苷之間的連接應用磷酸硫酯鍵或肽鍵而非磷酸二酯鍵。
多聚核苷酸導入組織或細胞內的方法包括將多聚核苷酸直接注入到體內組織中；或在體外通過載體(如病毒、噬菌體或質粒等)先將多聚核苷酸導入細胞中，再將細胞移植到體內等。
能與人肝癌相關蛋白結合的多肽分子可通過篩選由各種可能組合的胺基酸結合於固相物組成的隨機多肽庫而獲得。篩選時，必須對人肝癌相關蛋白分子進行標記。
本發明還涉及定量和定位檢測人肝癌相關蛋白水平的診斷試驗方法。這些試驗是本領域所熟知的，且包括FISH測定和放射免疫測定。試驗中所檢測的人肝癌相關蛋白水平，可以用作解釋人肝癌相關蛋白在各種疾病中的重要性和用於診斷肝癌相關蛋白起作用的疾病。
一種檢測檢測樣品中是否存在肝癌相關蛋白的方法是利用肝癌相關蛋白的特異性抗體進行檢測，它包括將樣品與肝癌相關蛋白特異性抗體接觸；觀察是否形成抗體複合物，形成了抗體複合物就表示樣品中存在肝癌相關蛋白。
肝癌相關蛋白的多聚核苷酸可用於肝癌相關蛋白相關疾病的診斷和治療。在診斷方面，肝癌相關蛋白的多聚核苷酸可用於檢測肝癌相關蛋白的表達與否或在疾病狀態下肝癌相關蛋白的異常表達。如肝癌相關蛋白DNA序列可用於對活檢標本的雜交以判斷肝癌相關蛋白的表達異常。雜交技術包括Southern印跡法，Northern印跡法、原位雜交等。這些技術方法都是公開的成熟技術，相關的試劑盒都可從商業途徑得到。本發明的多核苷酸的一部分或全部可作為探針固定在微陣列(microarray)或DNA晶片(又稱為「基因晶片」)上，用於分析組織中基因的差異表達分析和基因診斷。用肝癌相關蛋白特異的引物進行RNA-聚合酶鏈反應(RT-PCR)體外擴增也可檢測肝癌相關蛋白的轉錄產物。
檢測肝癌相關蛋白基因的突變也可用於診斷肝癌相關蛋白相關的疾病。肝癌相關蛋白突變的形式包括與正常野生型肝癌相關蛋白DNA序列相比的點突變、易位、缺失、重組和其它任何異常等。可用已有的技術如Southern印跡法、DNA序列分析、PCR和原位雜交檢測突變。另外，突變有可能影響蛋白的表達，因此用Northern印跡法、Western印跡法可間接判斷基因有無突變。
本發明的序列對染色體鑑定也是有價值的。簡而言之，根據本發明肝癌相關蛋白的cDNA製備PCR引物(優選15-35bp)，可以將序列定位於染色體上。然後，將這些引物用於PCR篩選含各條人染色體的體細胞雜合細胞。只有那些含有相應於引物的人基因的雜合細胞會產生擴增的片段。
一旦序列被定位到準確的染色體位置，此序列在染色體上的物理位置就可以與基因圖數據相關聯。這些數據可見於例如，V.Mckusick，MendelianInheritance in Man(可通過與Johns Hopkins University Welch MedicalLibrary聯機獲得)。然後可通過連鎖分析，確定基因與業已定位到染色體區域上的疾病之間的關係。
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New YorkColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。
實施例1人肝癌相關基因的克隆1.組織分離(Tissue isolation)肝臟來源於5個成年男性肝癌患者，在肝癌切除手術後，將肝癌組織和癌旁組織立即置於液氮中冷凍保存。
2.mRNA的分離(mRNA isolation)取出組織，用研缽研碎，加入盛有裂解液的50ml管，充分振蕩後，再移入玻璃勻漿器內。勻漿後移至50ml新管，抽提總RNA(TRIzol Reagents，Gibco，NY，USA)。用甲醛變性膠電泳鑑定總RNA質量。用帶Oligo d(T)的纖維素柱分離總RNA中的mRNA，定量。
3.cDNA文庫的構建(Construction of cDNA library)以mRNA為模板，合成雙鏈cDNA，反轉錄引物見SEQ ID NO1。補平末端後，加含EcoRI切點的接頭，接頭序列分別見SEQ ID NO1-75和3。磷酸化EcoRI末端後，用XhoI限制性內切酶消化1.5小時，再進行片段分離。過柱篩選長度＞500bp的片段，用酚-氯仿抽提，乙醇沉澱，無菌水溶解，連接至Uni-ZAP XR載體(Stratagene，CA9203，USA)，以Zap-cDNA Gigapack III Gold CloningKit(Stratagene，CA9203，USA)進行包裝，宿主菌使用XL 1-Blue MRF』(Stratagene，CA9203，USA)細菌。塗板並測定滴度。
4.測序及資料庫建立(Seqencing and Database Constructing)挑選文庫中有外源片段插入的克隆，擴增後抽提質粒(Qiagen，Germany)，用T3和T7作為3』端和5』端的通用引物，採用終止物螢光標記(Big-Dye，Perkin-Elmer，USA)的方法，在ABI 377測序儀(Perkin-Elmer，USA)上進行EST大規模測序。測序結果用FACTURA軟體去除載體序列，傳輸到SUN Ultra 450 Server上進行下一步的處理。所有的序列信息再用GCG軟體包(Wisconsin group，USA)中的BLAST和FASTA軟體搜索已有的資料庫(Genebank+EMBL)，將無同源性或同源性低於95％的序列視為新基因建立資料庫。
5.基因的全長克隆(Cloning of Full-length cDNA)在得到的新基因片段序列信息基礎上，進行cDNA全長克隆，分兩階段進行(1)「電子克隆」(Electronic Cloning)以新基因片段序列作為探針搜尋dbEST資料庫，將重疊序列＞50bp，同源性在98％以上的表達序列標籤(Expressed Sequence Tag，簡稱「EST」)序列認為同一序列(consensus sequence)，取出並用AUTOASSEMBLER軟體進行拼接，部分EST可以延伸探針序列。再用STRIDER軟體分析被延伸的序列是否具有完整的開放閱讀框架(Open Reading Frame，ORF)，用BLAST搜尋Genbank或SwissProt以確定該序列在核苷酸和胺基酸水平上是否與其他物種有同源性，以幫助判別所得到的基因全長完整性如何。通過電子克隆的方法，通常可獲取人肝癌相關基因的全長序列。
(2)cDNA末端快速擴增(Rapid Amplification of cDNA Ends，RACE)如果通過「電子克隆」方法仍未得到完整的cDNA全長，則在已有序列的5』或3』端設計引物，在人類肝臟Marathon-Ready cDNA文庫(Clontech Lab，Inc，USA)中進行長距離PCR反應。然後對PCR產物克隆、測序。用AUTOASSEMBLER及STRIDER軟體分析被延長的序列有無完整的ORF，如無，重複上述過程直至獲得全長。
(3)RT-PCR對於5』和3』端已知的序列，如果中間尚有一段間隙(gap)無法從已有的公共資料庫或自身資料庫獲得，可考慮採用RT-PCR的方法。在序列5』端設計引物，3』端引物採用Oligo-dT，在肝臟總RNA庫中進行擴增。然後對產物進行克隆、測序。最後拼接並獲得全長。
通過組合使用上述3種方法，獲得了75種人肝癌相關蛋白的全長編碼序列，它們編碼的肝癌相關蛋白如表2所示
表2




添加真菌澱粉酶0.8升，轉移葡萄糖苷酶0.8升，保溫糖化14小時後添加移葡萄糖苷酶0.6升，再保溫22小時，煮沸30分鐘滅酶，降溫至30℃；在糖化液中添加6公斤面白酵母自然發酵3天；將發酵液煮沸30分鐘；調節發酵液的pH值4.8-4.9，溫度78℃-82℃，加活性碳，保溫30分鐘；用陰、陽離子樹脂除鹽；用蒸發器將淨化好的液體濃縮至50-55％，形成液體產品；將濃縮後的液體噴霧於燥至含水量5％以下，形成固體粉末產品，包裝入庫。
一次添加糖化酶與二次添加糖化酶的產品質量指標比較

例2高麥芽糖漿的生產。
(1)一次添加糖化酶的生產工藝將40噸玉米澱粉用水稀釋至30％，調節pH值6.0，添加α澱粉酶16升，用噴射液化氣在105℃-107℃下噴射，保溫4-6分鐘；閃蒸，降溫96℃-98℃，保溫120分鐘；降溫60℃，調節pH值5.2-5.5，添加真菌澱粉酶15升，普魯蘭酶10升，保溫48小時，煮沸30分鐘滅酶，降溫至30℃；將絮凝液用活性碳脫色；用陰、陽離子樹脂除鹽；用蒸發器將淨化好的液體濃縮至75％的液體；灌裝。
(2)三次添加糖化酶的生產工藝將40噸玉米澱粉用水稀釋至30％，調節pH值6.0，添加α澱粉酶16升，用噴射液化氣在105℃-107℃下噴射，保溫4-6




實施例2人肝癌相關蛋白的製備和提純在該實施例中，將全長的人肝癌相關編碼序列或片段構建入商品化的蛋白質融合表達載體之中，以表達和提純重組蛋白。
1.將人肝癌相關蛋白以GST融合蛋白的形式在大腸桿菌中進行原核表達。
原核表達載體的構建，以及轉化大腸桿菌根據人肝癌相關的全長編碼序列，設計擴增出完整編碼閱讀框的引物(分別對應於編碼序列5』和3』端的約20個以上核苷酸)，並在正反引物上分別引入限制性內切酶位點(這根據選用的pGEX-2T載體而定)，以便構建表達載體。以實施例1中獲得的擴增產物為模板，經PCR擴增後，將人肝癌相關基因在保證閱讀框正確的前提下克隆至pGEX-2T載體(Pharmacia，Piscataway，NJ)。鑑定好的表達載體利用CaCl2方法轉入大腸桿菌DH5α，篩選鑑定得到含有pGEX-2T-肝癌相關表達載體的工程菌DH5α-pGEX-2T-肝癌相關。
表達GST-肝癌相關重組蛋白的工程菌的分離鑑定挑取單菌落的DH5α-pGEX-2T-肝癌相關工程菌於3ml含100μg/ml氨苄青黴素的LB培養基中振搖培養過夜，按1∶100的濃度吸取培養液於新的LB培養基(含100μg/ml氨苄青黴素)中培養約3小時，至OD600達0.5後，加入IPTG至終濃度1mmol/L繼續於37℃分別培養0，1，2，3小時。取培養時間不同的1ml菌液離心，在細菌沉澱物中加入裂解液(2×SDS上樣緩衝液50μl，蒸餾水45μl，二巰基乙醇5μl)，混懸細菌沉澱，沸水浴中煮5分鐘，10000rpm離心1分鐘，上清加入12％SDS-PAGE膠中電泳。染色後觀察預期分子量大小的蛋白量隨IPTG誘導時間增加而增加的菌株即為表達GST-肝癌相關融合蛋白的工程菌。
GST-肝癌相關融合蛋白的提取純化按上述方法誘導表達GST-肝癌相關融合表達蛋白的工程菌DH5α-pGEX-2T-肝癌相關。誘導後的細菌離心沉澱，按每400ml菌加入20ml PBS重懸細菌，超聲破碎細菌。破菌完全的超聲液按每毫升加入20微升的量加入PBS飽和的50％穀胱苷肽Sepharose 4B，37℃振搖結合30分鐘，10000rpm離心10分鐘沉澱結合了GST-肝癌相關的穀胱苷肽Sepharose 4B，棄上清。按每毫升超聲液所得沉澱加入100μl PBS的量清洗兩次，而後按每毫升超聲液所得沉澱加入10μl還原型穀胱苷肽洗脫液，室溫置10分鐘，10000rpm離心10分鐘，上清即為洗脫的融合蛋白。重複洗脫兩次。洗脫的上清保存於-80℃，並進行SDS-PAGE電泳，檢測純化效果。獲得人肝癌相關蛋白(SEQ ID NO1-75)。
實施例3人肝癌相關蛋白或多肽在人胚腎293細胞中進行真核細胞表達1.人肝癌相關杆狀病毒表達載體的構建及轉染293細胞株根據人肝癌相關的全長編碼序列，設計擴增出完整編碼閱讀框的引物，並在正反引物上分別引入限制性內切酶位點(這可視選用的載體而定)，以便構建表達載體。以實施例1中獲得的擴增產物為模板，經PCR擴增後，將人肝癌相關cDNA在保證閱讀框架的前提下克隆至pcDNA3.1A載體(Invitrogen，Carlsbad，CA)。鑑定好的表達載體3μg，pcDNA3.1A DNA(BaculoGoldTMACMNPVDNA，Pharmingen，San Diego，CA)1μg和Lipofection(Gibco-BRL，NY)25μl，加入1ml無血清的DMEM培養基中，振蕩15秒混勻，室溫孵育15分鐘備用。取1ml(2×106)293細胞懸液於60mm組織培養板中，貼壁1小時後換轉染培養基，室溫孵育15分鐘後棄培養基，加入前面製備好的DNA載體轉染混合物，Parafilm密封培養板，於室溫27℃振搖培養4小時，而後換完全培養基培養3天，收集上清備用。
2.轉入重組表達載體的293細胞株的篩選鑑定轉染3天後的293細胞進行Western鑑定。將細胞裂解後進行SDS-PAGE電泳，電泳後的膠於Pharmacia的Multiphor II半乾電轉移儀中將蛋白質轉印到硝酸纖維膜上，將硝酸纖維膜置於封閉液中封閉1小時，而後於抗人肝癌相關的抗體溶液中封閉1小時，TBS液振搖清洗5分鐘共2次，而後將膜置於生物素標記的抗人肝癌相關一抗的第二抗體溶液中振搖1小時，TBS清洗，加入親和素-鹼性磷酸酶複合物反應30分鐘，TBS清洗2次，加入新鮮配製的顯色液顯色觀察蛋白條帶。
挑取高表達人肝癌相關的293細胞克隆。
3.人肝癌相關蛋白的提取純化用高表達人肝癌相關的Sf9細胞克隆收集細胞，PBS洗滌。每2×108細胞加入20ml細胞裂解液(0.5％Triton X-100，20mM Na3PO4(磷酸鈉，pH7.8)，500mMNaCl，1mM Na3VO4(釩酸鈉)，1mM Pefabloc，1μg/ml胃蛋白酶抑制劑，亮抑蛋白酶肽和抑蛋白酶肽)破細胞，12000×g離心20min去除細胞碎片，上清按每2×108的細胞加入2ml NTA-瓊脂糖(Qiagen，Germany)，4℃吸附1小時。而後用含100nM咪唑的His緩衝液洗滌兩次，用含20mM N，N』-二哌嗪，500mM NaCl，300mM咪唑的緩衝液洗脫以得到純化的蛋白。洗脫液保存於4℃，並進行SDS-PAGE電泳檢測提取的人肝癌相關蛋白的純度。得到各人肝癌相關蛋白(SEQ IDNO1-75)。
實施例4抗人肝癌相關抗體的製備1.免疫小鼠和脾細胞的製備將實施例2和3製備的本發明SEQ ID NO1-75所示的肝癌相關蛋白用層析法進行分離後備用，也可以用SDS-PAGE凝膠電泳法進行分離，將電泳條帶從凝膠中割下，並用等體積的完全Freund’s佐劑乳化。取6-8周齡Balb/C雌鼠，用50-100μg/0.2ml乳化過的蛋白，對小鼠進行腹膜內注射。14天後，用非完全Freund’s佐劑乳化的同樣抗原對小鼠以50-100μg/0.2ml的劑量再加強免疫一次，3-5天後用於融合。其中，脾細胞製備見鄂徵主編，《組織培養和分子細胞學技術》，北京出版社，第210頁。
2.按《組織培養和分子細胞學技術》(同上)，第371頁中的方法，製備飼養細胞。
3.按《組織培養和分子細胞學技術》(同上)，第213頁中的方法，進行細胞融合。
4.抗體的檢測在細胞融合10-15天後，需逐孔進行檢查，一旦發現旺盛的雜交細胞集落生長，就應用人肝癌相關蛋白做抗體活性的初步篩選，常用的方法有免疫螢光試驗、發射免疫試驗(RIA)、酶聯免疫吸附試驗(ELISA)。檢查出抗體活性的孔後，立刻進行克隆培養，並分離出抗體。
獲得的抗體的特異反應活性用它在體外沉澱對應肝癌相關蛋白的能力加以評估。結果發現，抗體可特異性地與本發明蛋白發生結合。
在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之後，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落於本申請所附權利要求書所限定的範圍。
權利要求
1.一種分離的人肝癌相關蛋白，其特徵在於，該多肽含有SEQ ID NO1-75所示的胺基酸序列的多肽。
2.如權利要求1所述的多肽，其特徵在於，該多肽的胺基酸序列如SEQ ID NO1-75所示。
3.一種分離的多核苷酸，其特徵在於，它包含一核苷酸序列，該核苷酸序列選自下組(a)編碼如權利要求1所述多肽的多核苷酸；(b)與多核苷酸(a)互補的多核苷酸。
4.一種載體，其特徵在於，它含有權利要求3所述的多核苷酸。
5.一種遺傳工程化的宿主細胞，其特徵在於，它含有權利要求4所述的載體。
6.一種多肽的製備方法，其特徵在於，該方法包含(a)在適合表達的條件下，培養權利要求5所述的宿主細胞；(b)從培養物中分離出人肝癌相關蛋白。
7.一種能與權利要求1所述的人肝癌相關蛋白特異性結合的抗體。
全文摘要
本發明提供了新的肝癌相關蛋白，編碼肝癌相關蛋白的多核苷酸和經重組技術產生所述肝癌相關蛋白的方法。本發明還公開了編碼這種肝癌相關蛋白的多核苷酸的用途。
文檔編號C12N15/12GK1618808SQ20031010876
公開日2005年5月25日 申請日期2003年11月21日 優先權日2003年11月21日
發明者朱智東, 韓澤廣 申請人:上海人類基因組研究中心