一種緩釋重組人骨形態發生蛋白-2聚l乳酸微球及其製備方法
2023-07-04 04:47:26
專利名稱：一種緩釋重組人骨形態發生蛋白-2聚l乳酸微球及其製備方法
技術領域：
本發明涉及一種藥物載體及其製備，尤其涉及一種緩釋重組人骨形態發生蛋白-2聚L乳酸微球及其製備方法。
背景技術：
外源性生長因子的開發和應用研究一直是再生醫學、腫瘤生物治療等領域最活 躍的課題之一。活性生長因子在體內的半衰期短，全身或局部應用很快被稀釋代謝，直接 應用不能滿足組織修復再生及治療的需要。利用合適的載體材料攜帶生長因子植入體內 時，可持續保持其生物活性並延長作用時間，正受到日益廣泛的重視和關注。隨著基因工 程和生物技術的發展，越來越多的多肽類藥物用於治療和預防疾病。骨形成蛋白是轉化生 長因子β (TGF-β)超家族中的一組多功能細胞因子，是已知效應最強的骨生長因子，具有 誘導間充質細胞遷徙、增殖、分化，最終促使軟骨、骨形成的作用。但重組人骨形態發生蛋 白-2(rhBMP-2)和其他細胞生長因子一樣，容易被酶降解，在局部和全身應用的生物利用 度低。將BMP與某種可作為其載體的材料複合後植入體內，可使BMP作用更持久，能生成 更多新骨。研究開發新的BMP載體是骨組織工程的一個熱點。所謂載體及緩釋系統，是指 骨形態發生蛋白(BMP)與之結合後植入體內時，可使BMP繼續保持其成骨活性，並因作用時 間更持久而使新骨生長量較單純應用BMP為多。這時載體及緩釋系統起到了三種作用1) 載負BMP，使之與周圍組織均勻接觸，利於誘導周圍間充質細胞分化為骨系細胞，形成新骨； 2)可作為骨生長支架促進骨生長；3)可控制地緩慢釋放BMP，使之作用時間更持久。因此， 製備具有緩釋特性的BMP-2給藥劑型是當今藥物開發的趨勢。另外，多種骨生長因子在體內促進成骨作用的發揮，都有賴於與適宜的載體緩釋 系統結合，否則骨生長因子(如純化bBMP)極易被體液稀釋轉運吸收，或被迅速降解。對固 體性載體(如同種或異種骨，高分子多聚體，經基磷灰石等)的研究較多，對可溶性載體的 研究很少。而可溶性載體對骨生長因子的實驗研究及臨床應用都有重要作用，特別是某些 水溶性較差的骨生長因子以混懸注射液方式給藥或進行體外研究時，適宜的載體更是必不 可少的。除了對載體的一般要求外，如緩釋作用，不引起炎症和排斥反應，易吸收等，還要求 這類載體有良好水溶性及助溶助懸作用，不降低骨生長因子活性。用於包封rhBMP-2的載 體材料可分為天然、半合成和合成的高分子材料。如明膠水凝膠，甲基纖維素等。這些材料 包裹rhBMP-2尚存在諸多問題，如材料的生物安全性，緩釋期太短，難以保存rhBMP-2的生 理活性等，因此其局部或全身應用的生物利用度低。另外，傳統工藝工序複雜、周期長、有機 溶劑難於去除、顆粒大且分布範圍寬，通常將生長因子複合進聚合物的方法和過程存在的 主要問題是這些方法和過程可能使得蛋白活性的喪失。通常的高溫、超聲、有機溶劑都有可 能使得蛋白失活變性。因此，為了最大化保持蛋白活性，用一種溫和工藝條件方法來製備載 蛋白聚合物載體是必要的。
發明內容
針對上述現有技術存在的問題，本發明目的之一在於提供一種生物安全性高，突釋期小，緩釋期長，更易保存rhBMP-2生理活性的緩釋重組人骨形態發生蛋白_2聚L乳酸 微球(rhBMP-PLLA)；本發明另一目的在於提供上述微球的製備方法，其不損傷蛋白活性、 工序簡單、周期短、有機溶劑易去除，且所得微球顆粒具有前述優點。本發明的技術方案是一種緩釋重組人骨形態發生蛋白_2聚L乳酸微球，微 球基質成分為聚L乳酸，包裹的藥物為重組人骨形態發生蛋白-2，聚L乳酸和重組人 骨形態發生蛋白_2的混合有機溶液經超臨界流體二氧化碳萃取溶劑後析出所述微球 結晶，該微球的粒徑範圍在825nm 1280nm，包封率和載藥量分別為(98. 7士 1.2) %和 [(24. 0士0. 1) X 10_3] %，體外釋藥平均濃度為(3. 1 士0.54) μ g/mL，突釋期內為4. 97 % 士 1. 8 %，26天後釋放度達92. 99 士 7. 01 %，所釋放出的重組人骨形態發生蛋白_2活性蛋白 結構完整，而且是同源二聚體形式存在。一種緩釋重組人骨形態發生蛋白_2聚L乳酸微球的製備方法，包括以下步驟1)將濃度為10mg/ml的重組人骨形態發生蛋白_2有機溶液和濃度為8. 16mg/ml 的聚L乳酸有機溶液混合得到混合溶液，其溶質含量比值為1 40;2)將冷卻液化的二氧化碳經加壓升溫後，通過同軸二流式噴嘴外側通道，泵入高 壓釜中，其流速為300ml/min，並維持高壓釜內壓力、溫度恆定，其壓力、溫度分別為12MPa、 33 °C ；3)將混合溶液由高效液相色譜泵通過同軸二流式噴嘴內側通道泵入高壓釜，其流 速為0. 5ml/min，使得溶質從溶液中以微球形式結晶析出，得到重組人骨形態發生蛋白-2 聚L乳酸微球；4)得到微球後，停止泵入混合溶液，維持高壓釜壓力及溫度不變，繼續通入二氧化 碳淋洗微球結晶去除有機溶劑殘留。作為優選，所述重組人骨形態發生蛋白-2有機溶液的溶劑為二甲亞碸，所述聚L 乳酸有機溶液的溶劑為二氯甲烷。本發明的有益效果是本方法相對於傳統方法更加潔淨、綠色環保、製備條件溫 和，因為整個過程中有機溶劑殘留很少，不使用高溫和機械剪切力。所製備的緩釋微球通 過測定，rhBMP-PLLA微球表面光滑，粒徑為825nm 1280nm，粒徑分布範圍較窄，完全達到 文獻報導微球粒徑所要求的標準。本申請製備的rhBMP-2-PLLA微球體外釋藥試驗檢測表 明突釋期僅為4. 97%，26d後釋放度達92. 99士7. 01 %，符合納米微球的一般規律。微球 在26d內不僅一直持續釋放rhBMP-2，而且所釋放出的rhBMP-2，平均濃度為(3. 1 士0. 54) μ g/mL,採用Western blot技術檢測rhBMP-2微球樣品顯示所釋放出的rhBMP-2活性蛋 白結構完整，而且是同源二聚體形式存在，製備過程並沒有破壞蛋白結構的完整性，可滿足 rhBMP-PLLA微球發揮促骨形成的生物活性的需要。目前認為緩釋微球中藥物的釋藥機制一 般認為有三種(1)擴散；(2)囊膜或材料的溶蝕；(3)囊膜及材料的降解。在釋放初期階段 藥物主要是在濃度梯度作用下釋放，隨著聚乳酸的降解和融蝕，藥物在濃度梯度作用下從 孔道擴散到組織，隨著聚乳酸完全降解，微球體系崩解，藥物完全釋放出來，以維持藥物的 持續作用濃度供組織修複利用。PLLA在體內以水解方式降解後，乳酸參加三羥酸循環，乙 醇酸經尿排出體外，多聚體降解後可被機體完全吸收。實驗證明，BMPs是以懸浮方式結合在條片狀多聚體之上的。本申請表明rhBMP-2-PLA納米微球在體外26d後仍能釋放有生物 活性的rhBMP-2，因而可以在以後臨床研究中採用PLLA作為該類蛋白質緩釋製劑的載體材 料。同時，實驗結果顯示微球模擬體外釋藥的26d時間內，不僅一直持續釋放rhBMP-2，而且 所釋放出的rhBMP-2濃度可以保持在一定的水平，因而有望使其在10 14d的骨創傷初期 修復階段以及1個月時間的骨重建階段，持續在組織局部釋放rhBMP-2，並維持在有效生理 濃度以上，以顯著促進骨創傷組織修復。
圖1為本發明方法的裝置示意圖；圖2為本發明實施例1的微球的5000倍SEM圖；圖3為本發明實施例1的微球的10000倍SEM圖；圖4為本發明實施例1的微球的粒徑分布；圖5為本發明實施例1的微球的rhBMP的體外釋放特性曲線；圖6為本發明實施例1的微球釋放的蛋白印跡檢測結果；
具體實施例方式作為本發明的一種實施方式，一種緩釋重組人骨形態發生蛋白_2聚L乳酸微 球，微球基質成分為聚L乳酸，包裹的藥物為重組人骨形態發生蛋白-2，聚L乳酸和重組 人骨形態發生蛋白_2的混合有機溶液經超臨界流體二氧化碳萃取溶劑後析出所述微球 結晶，該微球的粒徑範圍在825nm 1280nm，包封率和載藥量分別為(98. 7士 1.2)%和 [(24. 0士0. 1) X 10_3] %，體外釋藥平均濃度為(3. 1 士0.54) μ g/mL，突釋期內為4. 97 % 士 1. 8 %，26天後釋放度達92. 99 士 7. 01 %，所釋放出的重組人骨形態發生蛋白_2活性蛋白 結構完整，而且是同源二聚體形式存在。一種緩釋重組人骨形態發生蛋白_2聚L乳酸微球的製備方法，包括以下步驟1)將濃度為10mg/ml的重組人骨形態發生蛋白_2有機溶液和濃度為8. 16mg/ml 的聚L乳酸有機溶液混合得到混合溶液，其溶質含量比值為1 40;作為優選，所述重組人 骨形態發生蛋白_2有機溶液的溶劑為二甲亞碸，所述聚L乳酸有機溶液的溶劑為二氯甲 烷；2)將冷卻液化的二氧化碳經加壓升溫後，通過同軸二流式噴嘴外側通道，泵入高 壓釜中，其流速為300ml/min，並維持高壓釜內壓力、溫度恆定，其壓力、溫度分別為12MPa、 33 °C ；3)將混合溶液由高效液相色譜泵通過同軸二流式噴嘴內側通道泵入高壓釜，其流 速為0. 5ml/min，使得溶質從溶液中以微球形式結晶析出，得到重組人骨形態發生蛋白-2 聚L乳酸微球；4)得到微球後，停止泵入混合溶液，維持高壓釜壓力及溫度不變，繼續通入二氧化 碳淋洗微球結晶去除有機溶劑殘留。實施例1(如圖1所示)1)來自於鋼瓶中的CO2經製冷系統液化後，由高壓柱塞泵加壓，再由管路中的恆溫 水浴升溫後，通過高壓釜頂部同軸二流式噴嘴外側通道，被泵入體積為500ml的高壓釜中。待釜內達到要求的壓力，維持CO2泵入速率300ml/min，開啟放氣閥以一定速率放氣，維持釜內壓力恆定為12MPa。調節高壓釜外部乾燥箱及管路水浴溫度，以保持釜內溫度恆定為 33°C。當達到實驗所需溫度33°C後，12mg重組人骨形態發生蛋白-2 (recombinant human BMP-2, rhBMP-2)溶於1. 2ml的二甲亞碸，480mg聚L乳酸(PLLA)溶於58. 8ml的二氯甲烷 (DCM)中，當兩種溶液都完全溶解後，將兩者完全混合得到混合溶液。混合溶液由高效液相 色譜(HPLC)泵通過噴嘴內側通道以流速為0. 5ml/min泵入高壓釜。當混合溶液一接觸到超 臨界流體二氧化碳(SCCO2)，溶劑被SCCO2萃取，使得試驗溶液變成溶質的過飽和溶液，溶質 從溶液中以微球形式結晶析出。結束泵樣後，維持壓力及溫度不變，繼續通入CO2淋洗30min 以去除有機溶劑殘留。結束清洗後，緩慢卸壓，待釜內壓力降為常壓時，打開沉積釜收集樣
品 O主要試劑聚L乳酸(PLLA，IOOKDa) 化學純 山東省醫療器械研究所重組人骨形態發生蛋白_2珠海安進生物技術有限(recombinant human BMP—2，注射級公司rhBMP-2) *成都長聯化工試劑有限二氯甲烷分析純公司乙醇分析純 成都市科龍化工試劑廠二甲亞碸分析純 成都市科龍化工試劑廠二氧化碳(含量≥ 99.9% ) 醫用級 成都拓展氣有限公司Antibody sampler kitCell Signaling 公司(rabbit polyclonal IgG)PVDF 膜PMillipore 公司蛋白質分子量MarkerFermentas公司過硫酸銨GIBCO BRL公司女注rhBMP-2的一般理化特性酸性蛋白，可耐受55_75°C，對胰蛋白酶敏感，酸 性條件下穩定，PH > 8. 5則失活，溶於中性鹽溶液(pH7. 2)，溶於6M尿素或4M鹽酸胍和 0.1%醋酸。不溶於氯仿/甲醇、純酒精和丙酮。利用基因工程技術在大腸桿菌系統中重組 表達BMP-2，經分離、純化、復性後得到高純度和活性的rhBMP-2。分子量單體約12110Da， 同二聚體約24. 24kDa，等電點約6. 56。N-端胺基酸序列BMP_2總共有115個胺基酸組 成，前五個胺基酸序列為Met-Gln-Ala-LyS-HiS。產品形式凍乾粉(冷凍乾燥)；比活 lOOOUnits/mg，活性單位定義為rhBMP-2植入小鼠股部肌間隙14天時，植入區鈣生成1 μ g 為一個生物活性單位。純度①RP-HPLC分析≥ 95% ；②SEC-HPLC分析≥ 95% ；③reducing and non-reducing SDS-PAGE分析≥ 95%。保存條件凍乾粉在_2(TC下可長期保存。液 體狀態在4°C下可保存數周，在-20-7(TC下長期保存。主要儀器
電子分析天平上海上平儀器公司85-IC磁力攪拌器上海閔行虹浦儀器廠JSM-5900LV型掃描電鏡日本電子公司RS-2008雷射粒度儀山東濟南潤之公司
傅立葉紅外光譜儀NEXUS670 美國尼高力公司耐弛差示量熱掃描儀STA449C 德國NetzchX射線衍射儀X，Pert MDP 荷蘭飛利浦浙江省杭州市石化器械有限2J-X8/32 高壓泵公司DHG-9070A加熱乾燥烘箱上海景洪實驗儀器有限公司HPLC 泵德國 Knauer 公司超細微球裝置江蘇南通石油公司螢光光譜儀F-7000日立科技紫外分光光譜儀F-3010日立科技倒置螢光顯微鏡1X71日本奧林巴斯微球表面形貌(如圖2、3所示)PLLA和rhBMP_2_PLLA載藥微球的形貌在掃描電 鏡上觀測。樣品採用無水乙醇分散，分散懸浮液滴在載物臺後真空乾燥後進行電鏡觀測。粒徑及粒徑分布(如圖4所示)微球的粒徑和粒度分布通過雷射粒度儀檢測。粒 徑分布採用跨度(Span)表徵=Span = (D90-D10)/D50.在這裡，Dltl，D5tl和D9tl，代表累積體積在 10%，50%和90%時的直徑大小。載藥量和包封率rhBMP-2含量的測定採用BCA(bicinchoninic acid)法蛋白濃 度定量試劑盒。載藥量二 ^ χ 100%;包封率二 ^ X 100% W1為微球內的藥量;w2為
微球的總量;w3為微球內藥量及介質中的藥量。體外藥物釋放研究(如圖5所示)30mg rhBMP-2-PLLA微球被放入茶包袋，然後 懸掛在裝有IOml釋放介質的離心管中，並放在37°C的恆溫搖床裡。在這個研究中，釋放介 質為磷酸緩衝液(PBS，pH = 6. 8)。在預定的釋放時間，IOml的釋放液被取出來，所取溶液 使用上述rhBMP-2含量測試方法測試濃度。用標準曲線求出藥物濃度並換算成不同時間的 累積溶出百分率，繪製時間_累積釋放率的釋藥曲線圖。以累計釋放量和時間擬合方程，作 出緩釋rhBMP-2微球體外釋藥曲線圖。釋藥數據用三種常用數學模型擬合，即零級方程、一 級方程及Higuchi方程擬合，擬合時以相關係數(r)最大而均方誤差(MSE)最小的為擬合 結果最好。BMP-2蛋白的完整性和時相性(如圖6所示)體外釋放BMP-2蛋白的完整性和時 相性通過Western blot方法測定；本實施例製備的rhBMP-PLLA緩釋微球，微球表面光滑，有一定的黏連，包封率和 載藥量分別為(98. 7 士 1. 2) %和[(24. 0 士0. 1) X IO"3] %，粒徑為825nm 1280nm，粒徑分 布範圍較窄，完全達到文獻報導微球粒徑所要求的標準。體外釋藥試驗檢測表明突釋期釋 放僅為4. 97%,26d後釋放度達92. 99士7. 01 %，符合納米微球的一般規律。微球在26d內不僅一直持續釋放rhBMP-2，而且所釋放出的rhBMP-2平均濃度為(3. 1 士0.54) μ g/mL ；採 用Western blot技術檢測rhBMP-2微球樣品顯示所釋放出的rhBMP-2活性蛋白結構完整， 而且是同源二聚體形式存在，可滿足rhBMP-PLLA微球發揮促骨形成的生物活性的需要。
權利要求
一種緩釋重組人骨形態發生蛋白-2聚L乳酸微球，其特徵在於微球基質成分為聚L乳酸，包裹的藥物為重組人骨形態發生蛋白-2，聚L乳酸和重組人骨形態發生蛋白-2的混合有機溶液經超臨界流體二氧化碳萃取溶劑後析出所述微球結晶，該微球的粒徑範圍在825nm～1280nm，包封率和載藥量分別為(98.7±1.2)％和[(24.0±0.1)×10-3]％，體外釋藥平均濃度為(3.1±0.54)μg/mL，突釋期內為4.97％±1.8％，26天後釋放度達92.99±7.01％，所釋放出的重組人骨形態發生蛋白-2活性蛋白結構完整，而且是同源二聚體形式存在。
2.—種權利要求1所述的緩釋重組人骨形態發生蛋白_2聚L乳酸微球的製備方法，其 特徵在於包括以下步驟1)將濃度為10mg/ml的重組人骨形態發生蛋白_2有機溶液和濃度為8.16mg/ml的聚 L乳酸有機溶液混合得到混合溶液，其溶質含量比值為1 40;2)將冷卻液化的二氧化碳經加壓升溫後，通過同軸二流式噴嘴外側通道，泵入高壓 釜中，其流速為300ml/min，並維持高壓釜內壓力、溫度恆定，其壓力、溫度分別為12MPa、 33 °C ；3)將混合溶液由高效液相色譜泵通過同軸二流式噴嘴內側通道泵入高壓釜，其流速為 0. 5ml/min,使得溶質從溶液中以微球形式結晶析出，得到重組人骨形態發生蛋白_2聚L乳 酸微球；4)得到微球後，停止泵入混合溶液，維持高壓釜壓力及溫度不變，繼續通入二氧化碳淋 洗微球結晶去除有機溶劑殘留。
3.根據權利要求2所述的緩釋重組人骨形態發生蛋白_2聚L乳酸微球的製備方法，其 特徵在於所述重組人骨形態發生蛋白_2有機溶液的溶劑為二甲亞碸，所述聚L乳酸有機 溶液的溶劑為二氯甲烷。
全文摘要
本發明公開了一種緩釋重組人骨形態發生蛋白-2聚L乳酸微球及其製備方法，涉及一種藥物載體及其製備，微球基質成分為PLLA，包裹的藥物為rhBMP-2，所釋放出的rhBMP-2活性蛋白結構完整，而且是同源二聚體形式存在；製備方法包括步驟rhBMP-2有機溶液和PLLA有機溶液混合得到混合溶液；混合有機溶液經超臨界流體CO2萃取溶劑後析出所述微球結晶；得到微球後，停止泵入混合溶液，維持高壓釜壓力及溫度不變，繼續通入CO2淋洗微球結晶去除有機溶劑殘留。本發明方法工序簡單、周期短、有機溶劑易去除，且所得微球顆粒生物安全性高，突釋期小，緩釋期長，更易保存rhBMP-2生理活性。
文檔編號A61K9/16GK101822645SQ20101016003
公開日2010年9月8日 申請日期2010年4月28日 優先權日2010年4月28日
發明者何學令, 吳江, 尹光福, 康雲清, 郭應強, 陳槐卿 申請人:吳江