一種製備高純度凝血酶的方法
2023-07-04 15:56:21
專利名稱：一種製備高純度凝血酶的方法
技術領域：
本發明涉及生物工程技術領域，尤其是以動物血液低純度凝血酶為原料製備高純度凝血酶的方法。
背景技術：
凝血酶是血漿凝血酶系統中的一種具有高度特異性的絲氨酸蛋白酶，它在纖維蛋白原上的酶切位點為Gly-Gly-Val-Arg-↓-Gly-Pro-Arg-↓-。因此它在基因工程所得到的融合蛋白產品的後續加工處理中具有獨特作用。為達到此用途，必須使用高純度的凝血酶。現有技術製備方法一般包括三個基本步驟，即提取、純化和凍幹(或製劑)。我國專利CN200410074753.3、CN92112188.1、CN93110426.2和CN96103650.8分別提出了從豬血、牛血、羊血等動物血液中提取凝血酶的方法，這些方法製備的凝血酶都是低純度凝血酶，也稱作低活性凝血酶，其凝血酶比活一般小於400IU/mg蛋白，低純度凝血酶無法滿足基因工程技術方面的需要。
發明內容
本發明的目的在於克服現有技術的不足，提供一種工藝流程簡單、生產周期短和收率高的製備高純度凝血酶的方法。
本發明製備凝血酶的方法包括以下幾個步驟(1)、將低純度凝血酶用緩衝劑溶解，離心分離，收集上清液；(2)、將上清凝血酶溶液上陽離子層析柱層析，對層析柱進行洗脫，收集凝血酶蛋白峰，得凝血酶溶液；
(3)、將步驟(2)中得到的凝血酶溶液上凝膠柱，對凝膠柱進行洗脫，收集凝血酶蛋白峰，得到高純度的凝血酶溶液；(4)、將高純度凝血酶溶液進行超濾脫鹽濃縮，得高純度凝血酶濃縮液；(5)、將高純度凝血酶濃縮液凍幹，即得白色的粉狀高純度凝血酶成品。
本發明製備高純度凝血酶的方法中，所述的低純度凝血酶來源於豬血、牛血、羊血等動物血液或人血液。
本發明的方法中，步驟(1)所使用的緩衝劑是檸檬酸-磷酸鹽緩衝劑或者磷酸鹽緩衝劑。緩衝劑的pH值為5～7。檸檬酸-磷酸鹽溶液或者磷酸鹽溶液的濃度是0.01～0.025mol/L。
本發明的方法中，步驟(2)對層析柱進行洗脫，所使用的洗脫劑是由基礎液和梯度液組成。所述的基礎液是調節pH值為5～7，檸檬酸-磷酸鹽溶液或者磷酸鹽溶液的濃度是0.01～0.025mol/L的緩衝劑。所述梯度液是調節pH值為5～7，以濃度是0.01～0.025mol/L的檸檬酸-磷酸鹽溶液或者磷酸鹽溶液為緩衝液，和0.5～1mol/L的氯化鈉或者其它無機鹽為離子增強劑組成的的混合液。
本發明的方法中，步驟(3)對凝膠柱進行洗脫，所使用的洗脫劑是調節pH值為5～7，檸檬酸-磷酸鹽溶液或者磷酸鹽溶液的濃度是0.01～0.025mol/L的緩衝劑。
本發明具有如下優點1、本發明提供的高純度凝血酶純化方法在常溫常壓下進行；2、凝血酶的收率高，其收率為80％以上；3、操作簡單。
4、工藝周期短，整個工藝生產僅需3天(包括凍幹)左右。
具體實施例方式
實施例1稱取豬低純度凝血酶6克，加入0.025mol/L，pH為5.8的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩衝劑400ml，充分溶解，高速離心，收集上清液A1。取上清凝血酶溶液A1上已平衡好的陽離子層析柱，用調節pH為5.8，濃度為0.025mol/L的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩衝劑作為基礎液；用調節pH為5.8，濃度為0.025mol/L的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩衝劑以及氯化鈉濃度為0.5mol/L組成的混合液作為梯度液；由上述基礎液和梯度液組成的梯度洗脫劑對層析柱進行梯度洗脫，收集凝血酶活性峰A2，得凝血酶洗脫液410ml。
將收集得來的凝血酶溶液A2上Sephadex G-100凝膠柱，對凝血酶溶液A2進行凝膠層析，洗脫並收集凝血酶活性峰A3，得到高純度凝血酶濃液200ml。
將凝血酶溶液A3進行超濾脫鹽，得到凝血酶溶液低鹽濃溶液50ml，標記為A4。凍幹上述凝血酶濃液，即得白色的粉狀高純度凝血酶。
實施例2稱取牛低純度凝血酶6.5克，加入0.025mol/L的磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉緩衝劑400ml，充分溶解，高速離心，收集上清液B1。取上清凝血酶溶液B1上已平衡好的陽離子層析柱，用調節pH為7.0，濃度為0.025mol/L的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩衝劑作為基礎液；用調節pH為7.0，濃度為0.025mol/L的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩衝劑以及氯化鈉濃度為1mol/L組成的混合液作為梯度液；由上述基礎液和梯度液組成的梯度洗脫劑對層析柱進行梯度洗脫，收集凝血酶活性峰B2，得凝血酶洗脫液360ml。
將收集得來的凝血酶溶液B2上Sephadex G-100凝膠柱，對凝血酶溶液B2進行凝膠層析，洗脫並收集凝血酶活性峰B3，得到高純度凝血酶濃液220ml。
將凝血酶溶液B3進行超濾脫鹽，得到凝血酶溶液低鹽濃溶液50ml，標記為B4。凍幹上述凝血酶濃液，即得白色的粉狀高純度凝血酶。
實施例3稱取羊低純度凝血酶4.7克，加入0.01mol/L的磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉緩衝劑400ml，充分溶解，高速離心，收集上清液C1。取上清凝血酶溶液C1上已平衡好的陽離子層析柱，用調節pH為6.5，濃度為0.01mol/L的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩衝劑作為基礎液；用調節pH為6.5，濃度為0.01mol/L的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩衝劑以及氯化鈉濃度為1mol/L組成的混合液作為梯度液；由上述基礎液和梯度液組成的梯度洗脫劑對層析柱進行梯度洗脫，收集凝血酶活性峰C2，得凝血酶溶液320ml。
將收集得來的凝血酶溶液C2上Sephadex G-100凝膠柱，對凝血酶溶液C2進行凝膠層析，洗脫並收集凝血酶活性峰C3，得到高純度凝血酶濃液190ml。
將凝血酶溶液C3進行超濾脫鹽，得到凝血酶溶液低鹽濃溶液50ml，標記為C4。凍幹上述凝血酶濃液，即得白色的粉狀高純度凝血酶。
實施例4按照《中華人民共和國藥典》2000版二部第1056～1057頁的有關凝血酶效價標準檢測方法，作標準曲線，對上述凝血酶溶液Ai(A1、A2、A3、A4)，Bi(B1、B2、B3、B4)，Ci(C1、C2、C3、C4)進行效價檢測，檢測結果見表1；採用Bradord檢測法對上述溶液進行蛋白濃度檢測，檢測結果如表1所示。根據凝血酶效價檢測結果以及相應的蛋白濃度檢測結果，計算凝血酶比活和得率(％)，其結果如表2所示。
表1實驗檢測數據
表2凝血酶效價檢測及分析結果
權利要求
1.一種製備高純度凝血酶的方法，該方法包括以下幾個步驟(1)、將低純度凝血酶用緩衝劑溶解，離心分離，收集上清液；(2)、將上清凝血酶溶液上陽離子層析柱層析，對層析柱進行洗脫，收集凝血酶蛋白峰，得凝血酶溶液；(3)、將步驟(2)中得到的凝血酶溶液上凝膠柱，對凝膠柱進行洗脫，收集凝血酶蛋白峰，得到高純度的凝血酶溶液；(4)、將高純度凝血酶溶液進行超濾脫鹽濃縮，得高純度凝血酶濃縮液；(5)、將高純度凝血酶濃縮液凍幹，即得白色的粉狀高純度凝血酶成品。
2.根據權利要求1所述的製備高純度凝血酶的方法，其特徵在於所述的低純度凝血酶來源於豬血、牛血、羊血或人血液。
3.根據權利要求1所述的製備高純度凝血酶的方法，其特徵在於步驟(1)所使用的緩衝劑是檸檬酸-磷酸鹽緩衝劑或者磷酸鹽緩衝劑。
4.根據權利要求3所述的製備高純度凝血酶的方法，其特徵在於緩衝劑的pH值為5～7。
5.根據權利要求3或4所述的製備凝血酶的方法，其特徵在於檸檬酸-磷酸鹽溶液或者磷酸鹽溶液的濃度是0.01～0.025mol/L。
6.根據權利要求1所述的製備高純度凝血酶的方法，其特徵在於步驟(2)所使用的洗脫劑是由基礎液和梯度液組成。
7.根據權利要求6所述製備高純度凝血酶的方法，其特徵在於所述基礎液是調節pH值為5～7，檸檬酸-磷酸鹽溶液或者磷酸鹽溶液的濃度是0.01～0.025mol/L的緩衝劑。
8.根據權利要求6或7所述製備高純度凝血酶的方法，其特徵在於所述梯度液是調節pH值為5～7，以濃度是0.01～0.025mol/L的檸檬酸-磷酸鹽溶液或者磷酸鹽溶液為緩衝液，和0.5～1mol/L的氯化鈉或者其它無機鹽為離子增強劑組成的的混合液。
9.根據權利要求1所述的製備高純度凝血酶的方法，其特徵在於步驟(2)所使用的洗脫劑是是檸檬酸-磷酸鹽緩衝劑或者磷酸鹽緩衝劑。
10.根據權利要求9所述的製備凝血酶的方法，其特徵在於所使用的洗脫劑是調節pH值為5～7，檸檬酸-磷酸鹽溶液或者磷酸鹽溶液的濃度是0.01～0.025mol/L的緩衝劑。
全文摘要
本發明提供了一種從低純度凝血酶製備高純度凝血酶的方法。該方法是利用層析介質吸附低純度凝血酶溶液，對層析柱進行洗脫，收集凝血酶蛋白峰，再經凝膠層析，超濾脫鹽濃縮，最後凍幹得高純度凝血酶成品。該方法在常溫常壓下進行，工藝環保，生產周期短；凝血酶提取效率高，由本發明製備高純度凝血酶，其得率為80％以上；操作簡單，本發明僅需離心、離子交換層析、凝膠層析、超濾脫鹽濃縮和凍乾等幾個步驟，容易實現工業化生產。
文檔編號C12N9/74GK1844380SQ200610078799
公開日2006年10月11日 申請日期2006年5月12日 優先權日2006年5月12日
發明者黃耀江, 王永成, 裴靖 申請人:黃耀江