一株產酸蠟樣芽孢桿菌及其應用的製作方法
2023-07-04 02:09:11
專利名稱：一株產酸蠟樣芽孢桿菌及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一株產酸蠟樣芽孢桿菌及其應用。
背景技術：
乳酸菌在發酵過程中產生有機酸、各種消化酶及乳酸菌素，畜禽飼料中添加乳酸菌類益生素能有效降低胃腸道內的PH，抑制病原菌的生長，提高飼料報酬，增強畜禽免疫力。近年來乳酸菌類益生素的研究越來越深入。但是，一般乳酸菌的營養要求較高，對不良環境的抵抗力差，特別是抗乾燥、抗高溫、抗胃酸和膽汁的能力較弱，因此，能活著進入腸道的乳酸菌種類和數量為數不多。普通的乳酸菌對環境耐受性差影響了乳酸菌的應用，它不耐高溫，在高溫制粒的過程中存活率極低，因此在飼餵顆粒料的生產應用中受到了很大的限制。產酸芽孢桿菌是優選出能產乳酸的芽孢菌，兼具乳酸菌和芽孢菌的優勢，可作為一種新型的微生物添加劑開發和應用。國內最早報導的產酸芽孢菌是1996年王豔萍等篩選的一株名為TQ33的菌株，後來鑑定TQ33為凝結芽孢桿菌，隨後對產酸芽孢菌的研究慢慢展開。蘇勇等O006)研究表明產酸芽孢菌Sl能提高斷奶後仔豬空腸和結腸食糜中乳酸菌與大腸桿菌的數量比值，而乳酸菌所佔比例的提高能夠預防仔豬腹瀉；研究發現產酸芽孢菌對哺乳仔豬黃白痢有良好的預防效果，連續灌服3d產酸芽孢菌製劑對乳豬黃白痢的預防率可達到99. 5% ；在仔豬出生時即投餵產酸芽孢菌TPY-211 口服液，對防治7日齡內仔豬腹瀉有明顯效果(P < 0. 01)。另外，產酸芽孢菌在肉雞上的試驗也取得了良好的效果，產酸芽孢菌製劑能提高AA肉雞生產性能，顯著提高21 42日齡黃羽肉雞平均日採食量、平均日增重和飼料轉化率，同時可增強試驗組肉雞的免疫性能。不僅如此，產酸芽孢菌在水產養殖中的應用越來越受歡迎，魚蝦顆粒料對制粒條件的要求更加嚴格，普通的乳酸菌製劑根本不可能成活，因此開發可以產乳酸的芽孢菌不僅能承受高溫高壓的制粒過程，發揮芽孢菌的優勢，並且被魚蝦採食後，可以發揮乳酸菌的優勢，起到調節胃腸PH，提高飼料報酬， 增強免疫力的作用。由上可見，篩選具有產酸能力的芽孢菌不僅具有乳酸菌的優勢，而且在發酵後期可以產生芽孢，可以很好地耐受高溫、高壓的制粒過程，提高存活率。目前所報導的產酸芽孢菌多為凝結芽孢桿菌，尚未見到有產酸蠟樣芽孢桿菌的報導。
發明內容
針對上述現有技術，本發明經篩選得到了一株產酸蠟樣芽孢桿菌及其應用，為開發肉禽及水產專用益生素提供了平臺。本發明是通過以下技術方案實現的一株產酸蠟樣芽孢桿菌，該菌株命名為蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)，已於 2011年10月16日保藏於中國典型培養物保藏中心，其保藏編號為CCTCC M 2011352。所述菌株的菌學特徵為菌落為圓形或近似圓形，呈無色素的白色，菌體細胞杆狀，成短或長鏈，培養48h，菌落不透明，直徑可達10mm，表面粗糙，邊緣不整齊，平鋪似毛玻璃狀。產芽孢，中生，革蘭氏陽性，無莢膜。所述菌株的最適培養條件為培養基酵母膏0.5%，蛋白腖0.6%，葡萄糖1.0%， 磷酸氫二鉀0.5%，硫酸鎂0.02%，硫酸錳0.08% (按質量百分數)，調pH至7. 5。最適溫度35°C，好氧。本發明還對產酸蠟樣芽孢桿菌的液體工業大規模生產的工藝及培養基做了摸索研究，經研究，其最佳培養基配方如下 種子培養基酵母膏0. 5 %，蛋白腖0. 6 %，葡萄糖1.0%，磷酸氫二鉀0. 5 %，硫酸鎂0.02%，硫酸錳0.08% (按質量百分數)。液體發酵培養基玉米粉3. 0 %，豆粉3. 2 %，麩皮2. 5 %，硫酸銨0. 8 %，硫酸鎂0. 01%，磷酸氫二鈉1%，磷酸二氫鈉0. 075%，檸檬三鈉0. 1% (按質量百分數)。其最佳生產工藝流程如下(1) 一級種子斜面接種，500mL三角瓶裝量lOOmL，35°C，220rpm搖床培養10 16h ；接入二級種子液擴大培養。(2) 二級種子5L三角瓶裝量1L，接種量6% (ν/ν)，35°C，220rpm搖床培養12 18h ；接入三級種子液擴大培養。(3)三級種子100L 發酵罐裝量 60L，4% (ν/ν)接種，35°C，220rpm 培養 10 16h ； 接入發酵罐進行工業化生產。(4)發酵罐培養條件2%接種(v/v)，35°C，220rpm培養沈 32h，鏡檢形成芽孢 90 %左右，放罐，噴幹，獲得芽孢菌粉。所述產酸蠟樣芽孢桿菌菌粉可以用於製備微生態製劑，應用時，產酸蠟樣芽孢桿菌菌粉可以單獨作為有效成分與玉米澱粉混合製成微生態製劑，或產酸蠟樣芽孢桿菌菌粉與其它至少一種有效成分或菌粉以及玉米澱粉混合製成複合微生態製劑。優選的，產酸蠟樣芽孢桿菌菌粉與枯草芽孢桿菌N9-1-35菌粉、丁酸梭菌Cb-2菌粉和玉米澱粉混合製成複合微生態製劑。本發明還提供了一種複合微生態製劑M3，其是以三大耐高溫菌種枯草芽孢桿菌 N9-1-35 (已於2011年08月31日保藏於中國典型培養物保藏中心，其保藏編號為=CCTCC M2011301)、丁酸梭菌Cb-2 (已於2011年11月09日保藏於中國典型培養物保藏中心，其保藏編號為CCTCC M 2011384)以及本發明的產酸芽孢菌GFl (10X 108cfu/g)及玉米澱粉混合製成，三種菌粉及玉米澱粉的質量比為1 :2:2: 5，各菌粉的活菌數分別大於或者等於 1. OX 109cfu/g、5. OX 108cfu/g、5. OX 108cfu/g。其功能及效果如下1、可以提高飼料報酬，降低料肉比，從而降低養殖成本。2、可以增強機體的總抗氧化水平，降低各種氧化應激所產生的副作用。3、可以提高脾臟、法氏囊器官指數。4、可以增加免疫器官指數，提高機體內IgG水平，增強機體產生抗體的能力，從而增強抵抗力。具體應用時，可以按照0. 5%。 2. 0%o (質量比)的比例添加於飼料中。本發明的產酸蠟樣芽孢桿菌，不僅具有良好的生長性能，而且在發酵終點能夠有效地形成芽孢。不僅具備乳酸菌的特點可以代謝產生有機酸，主要為乙酸和乳酸及少量丙酸和丁酸，而且可以形成芽孢，增強了其抗應激性，能夠耐熱、耐酸、耐膽鹽，可以耐受高溫制粒、低PH和高膽鹽環境，順利通過胃和十二指腸，進入腸道內發揮其益生菌的作用，因此，可以用於製備複合微生態製劑M3。實際應用時，可以與部分抗生素同時使用，但為了保證本發明的菌能夠充分發揮益生素的作用，應儘量避免與抗生素同時使用或使用時先做抑菌試驗。另外，通過小鼠的急性毒性試驗表明，本發明的產酸蠟樣芽孢桿菌安全無毒副作用，可以放心地作為益生素在飼料中添加使用。
本發明提供的菌株命名為蠟樣芽孢桿菌GF-IBacillus cereus GF-1，已於2011年 10月16日保藏於中國典型培養物保藏中心，其保藏編號為CCTCC NO =M 2011352，保藏地址為中國武漢武漢大學。菌株枯草芽孢桿菌N9-l-35Bacillus subtilis N9-1-35，已於 2011 年 08 月 31 日保藏於中國典型培養物保藏中心，其保藏編號為CCTCC NO =M 2011301，保藏地址為中國武漢武漢大學。菌株丁酸梭菌Cb-2Clostridium butyricum Cb_2，已於 2011 年 11 月 09 日保藏於中國典型培養物保藏中心，其保藏編號為CCTCC NO =M 2011384，保藏地址為中國武漢武漢大學。圖1為GFl菌落融鈣圖，圖中菌落周圍透明的部分即為融鈣圈，表示產酸。圖2為16srDNA的PCR擴增產物電泳圖，其中，M代表marker，1禾Π 2為16S rDNA 序列的兩個重複。圖 3 為 GFl 與 GU056812. 1，GU250444. 1，FJ665379. 1 序列對比結果示意圖。圖4為LYN3發酵液pH變化曲線圖。圖5為GFl抗生素藥敏圖，圖中，數字代表1、鹽酸林可黴素；2、硫酸粘桿菌素；3、 鹽酸土黴素；4、酒石酸泰樂菌素；5、多西環素。圖6為GFl生長曲線。圖7為各試驗組料重比對照圖。圖8為血清總抗氧化能力T-AOC測定結果示意圖。圖9為各試驗組IgG水平比較。
具體實施例方式下面結合實施例對本發明作進一步的說明。實施例一產酸芽孢桿菌的篩選及其它研究一、產酸芽孢桿菌的篩選1試驗材料1. 1分離源雞腸道、雞糞便、豬糞便、牛糞便1. 2 培養基1. 2. 1菌種分離用培養基基礎培養基酵母膏0. 5 %，蛋白腖0. 5 %，葡萄糖0.5%，磷酸氫二鉀0. 5 %，硫酸鎂0. 02%,硫酸錳0. 08%,碳酸鈣1. 5%，瓊脂1. 5%。
1. 2. 2菌種培養用培養基種子培養基酵母膏0. 1%，蛋白腖0. 1%，葡萄糖0. 1%，磷酸二氫鉀0. 1%，硫酸鎂 0.02%，硫酸錳 0.02%，pH 7.0 7. 5。發酵培養基(基礎)酵母膏0.5%，蛋白腖0.5%，葡萄糖0.5%，磷酸氫二鉀 0.5%，硫酸鎂0.02%，硫酸錳0. 08 %。2菌種篩選2. 1產酸芽孢菌分離純化方法採用菌種分離培養基，塗布分離，40°C培養48h，挑選生長速度快、周圍產生融鈣圈的單個菌落作為分離菌株，取一環分離菌使其分散於生理鹽水中，90°C水浴15min，再按上述方法進行分離，選取單一菌落劃線培養。2. 2鑑定方法菌種鑑定採用16S rDNA保守序列的PCR鑑定法和常規生理生化檢測試驗，16S rDNA保守序列的PCR鑑定法具體方法如下細菌16S rDNA擴增的引物序列為上遊5』 -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，，下遊5』 -AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3，， 序列由上海生物工程技術服務有限公司合成。PCR反應體系為dNTP Mixture 4yL, 5XPrimeSTARBuffer 10 μ L，上下遊引物各 0. 6 μ L，基因組模板 0. 8 μ L, PrimeSTAR HS DNA Polymerase 0. 6 μ L，用無菌去離子水補充至50 μ L。PCR循環參數為95 °C 5min ； 94°C lmin，58°C 15s，72°C 2min，30個循環；72°C IOmin0將PCR反應產物送上海桑尼生物科技有限公司測序，測序結果應用DNAMar軟體下的MegAlign子軟體進行分析。3產酸蠟樣芽孢菌的性能檢測3. 1菌株芽孢形成率測定發酵液中芽孢百分數的測定將篩選得到的菌株GFl在發酵培養基中37°C， 220rpm培養48h。處理一取ImL菌液梯度稀釋法計發酵液中活菌總數；處理二 取部分菌液在沸水中加熱lOmin，然後取ImL菌液梯度稀釋法計熱處理後活菌數。計算芽孢形成率。 芽孢形成率=熱處理後活菌數/發酵液中活菌總數X 100%。3. 2菌株代謝產物(有機酸)分析菌株經搖瓶液體發酵培養，每隔池取發酵液5mL，直至發酵培養48h，繪製pH變化曲線，根據檢測結果選取發酵初期PH迅速下降的6 12h，發酵液5000rpm離心lOmin，所得上清進行液相色譜分析有機酸的含量及組成成分。3. 3菌株應用穩定性的研究菌株的耐酸、耐膽鹽和耐熱性能檢測分別將GFl菌株液體發酵培養48h，鏡檢至大部分菌體形成芽孢，未形成芽孢的菌體80°C水浴15min滅活，平板培養計數，作為待測菌株耐受性試驗的起始濃度，經熱處理(80°C水浴15min)的發酵液作為待測液，備用。3. 3. 1酸耐受試驗將液體發酵培養基的起始pH分別調節為2. 0,3. 0,4. 0,5. 0，接種lh、2h、;3h後取樣，平板培養計數。3. 3. 2膽鹽耐受試驗液體發酵培養基高壓滅菌後，加入膽鹽母液(10% )，使其膽鹽濃度分別為0. 2%, 0. 3%,0. 4%，接種0. 5h、l. 5h,2h後取樣，平板培養計數。3. 3. 3熱穩定性試驗菌株液體發酵培養48h，殘留菌體80°C水浴15min滅活處理後，設定溫度梯度為85°C、90°C、95°C，水浴15min後取樣，平板培養計數。3. 3. 4產酶性能檢測分別取不同生長階段對數生長前期他、中期16h、後期24h和^h以及發酵終點 48h的發酵液，進行酶活檢測。採用Folin福林酚法測定中性蛋白酶和酸性蛋白酶，採用 CMC糖化力法測定發酵液纖維素酶活力。3. 4對抗生素的敏感性試驗選取鹽酸林可黴素、硫酸粘桿菌素、鹽酸土黴素、酒石酸泰樂菌素、多西環素五種抗生素，按推薦用量配成不同梯度溶液，管碟法測定抑菌圈直徑，其中指示菌為所分離菌株，濃度為 1. 8X108cfu/mL。4產酸芽孢菌液體發酵條件優化研究產酸芽孢菌液體發酵中的發酵溫度、初始pH值、通風量、發酵時間和接種量等各項因素對菌體產量和芽孢形成的影響。4.1發酵溫度的確定溫度通過影響微生物膜液晶結構、酶和蛋白質的合成和活性，以及RNA的結構及轉錄等影響微生物的生理活動，對微生物的生長直接產生影響。分別在^°C、30°C、33°C、 35°C、37°C、40°C不同溫度下，對所篩選的菌進行發酵培養48h，於不同時段測定活菌數。4. 2發酵最佳初始pH測定微生物需要在一定的酸鹼度的環境中才能正常的生長繁殖，pH過高或過低都會抑制微生物的生長。本試驗分別在PH為6. 0,6. 5,7. 0,7. 5,8. 0下培養至發酵終點48h，於不同時段測定活菌數。4. 3通風量的確定供氧量的多少會直接影響菌株的生長或代謝作用。因此發酵過程中通風量的大小直接影響菌體的生成，試驗以裝樣量和搖床轉速為通風量大小的代表，研究了芽孢菌在不同裝樣量(500mL三角瓶裝樣50mL、100mL、150mL、200mL)和搖床轉速(160rpm、180rpm、 200rpm、220rpm)下菌體生成量的變化。分別在35°C培養3 後測定菌體含量。4. 4培養基碳源和氮源組成配比優化將發酵培養基中碳源和氮源的含量上下適當調整，將作為主要碳源的葡萄糖含量為別設為0. 75 %、1. 0 %、1. 25 %，氮源蛋白腖的含量分別設為0. 4 %、0. 6 %、0. 8 %，進行兩因素三水平的正交試驗，在發酵20h取發酵液測定發酵4 平板計數法記錄活菌數，同時 95°C煮15min滅活菌體，計芽孢數，確定碳源和氮源的最佳配比。5生長曲線的繪製按照發酵優化結果，將GFl經500mL搖瓶液體發酵培養，每隔池取發酵液lmL，平板梯度稀釋法，35°C培養24h計菌落總數，繪製生長曲線。6動物安全性試驗6. 1試驗動物昆明種小鼠，動物級別二級，雌雄各半共50隻，體重18 22g。6. 2試驗動物分組與飼餵基礎日糧預飼1周後隨機分為5組，其中1組為對照組，其餘4組為試驗組。根據人每天大約需要5 X IO8個活菌，設定試驗組小鼠每天服用活菌數為人每天需要量的1/5倍、1倍、5倍和10倍。將噴幹菌粉稀釋後拌料、重新制粒，連續飼餵30天。試驗區封閉、清潔級，試驗期間觀察小鼠體態，試驗結束時解剖小鼠心臟、肝臟、腎臟和脾臟，觀察有無病變。二、結果與分析2. 1菌株的分離與鑑定2. 1. 1產酸芽孢菌的分離從雞腸道內容物以及雞、豬和牛新鮮糞便中分離得到25株目標菌株，使得平板內菌落周圍的培養基顏色由白色不透明變為透明淡黃色，說明所選菌株產酸並將培養基中的碳酸鈣融解，其中菌株GFl較其它菌株發酵液生物量高，融鈣圈大(如圖1所示)，因此選擇 GFl為試驗備選菌株。2. 1. 2產酸芽孢菌的分子生物學和生理生化鑑定產酸芽孢菌的分子生物學檢測取GFl發酵液lmL，提取總DNA，PCR擴增16S rDNA 序列，PCR產物電泳結果顯示，在分子量大小為1400bp左右得到一條特異性好的條帶，與預期結果一致(如圖2所示)。將GFl菌株的16S rDNA目的片段切膠回收(TAKARA膠回收試劑盒)，送TAKARA測序，將序列測定結果(如序列表1所示)輸入GeneBank中與已知序列進行比較，測定結果表明GFl與編號為GU056812. 1,GU250444. 1,FJ665379. 1菌株同源性為99. 4% (如圖3所示)°GFl生理生化檢測結果(如表1所示)在選擇性培養基上，35°C，培養Mh，可形成圓形或近似圓形、無色素的白色菌落，菌體細胞杆狀，成短或長鏈，培養48h，菌落不透明， 直徑可達10mm，表面粗糙，邊緣不整齊，平鋪似毛玻璃狀。產芽孢，中生，革蘭氏陽性，無莢膜。表1分離菌株的生理生化特徵
權利要求
1.一株產酸蠟樣芽孢桿菌，其特徵在於該菌株命名為蠟樣芽孢桿菌Bacillus cereus,已於2011年10月16日保藏於中國典型培養物保藏中心，其保藏編號為CCTCC M 2011352。
2.根據權利要求1所述的產酸蠟樣芽孢桿菌，其特徵在於所述菌株的特徵為菌落為圓形或近似圓形，呈無色素的白色，菌體細胞杆狀，成短或長鏈，培養48h，菌落不透明，直徑可達10mm，表面粗糙，邊緣不整齊，平鋪似毛玻璃狀。產芽孢，中生，革蘭氏陽性，無莢膜。
3.權利要求1所述的產酸蠟樣芽孢桿菌在製備微生態製劑中的應用。
4.一株產酸蠟樣芽孢桿菌菌粉，其特徵在於是通過培養權利要求1所述的產酸蠟樣芽孢桿菌製備得到的。
5.權利要求4所述的產酸蠟樣芽孢桿菌菌粉的製備方法，其特徵在於，步驟如下(1)一級種子斜面接種，500mL三角瓶裝量100mL，35°C，220rpm搖床培養10 16h ； 接入二級種子液擴大培養；(2)二級種子5L三角瓶裝量1L，接種量6%，35°C，220rpm搖床培養12 18h ；接入三級種子液擴大培養；(3)三級種子100L發酵罐裝量60L，4%接種，35°C，220rpm培養10 16h；接入發酵罐進行工業化生產；(4)發酵罐培養條件2%接種，351，220印111培養沈 3211，鏡檢形成芽孢90(%，放罐， 噴幹，獲得芽孢桿菌菌粉。
6.根據權利要求5所述的製備方法，其特徵在於所述步驟(1)中種子培養基的配方為酵母膏0. 5 %，蛋白腖0. 6 %，葡萄糖1.0%，磷酸氫二鉀0.5%，硫酸鎂0.02%，硫酸錳 0. 08% ；所述步驟( (3) (4)中液體發酵培養基的配方為玉米粉3.0%，豆粉3.2%，麩皮2. 5 %，硫酸銨0. 8 %，硫酸鎂0. 01 %，磷酸氫二鈉1 %，磷酸二氫鈉0. 075 %，檸檬三鈉0. 1%ο
7.權利要求4所述的產酸蠟樣芽孢桿菌菌粉在製備微生態製劑中的應用。
8.根據權利要求7所述的應用，其特徵在於應用時，產酸蠟樣芽孢桿菌菌粉單獨作為有效成分與玉米澱粉混合製成微生態製劑，或產酸蠟樣芽孢桿菌菌粉與其它至少一種有效成分或菌粉以及玉米澱粉混合製成複合微生態製劑。
9.根據權利要求7所述的應用，其特徵在於應用時，產酸蠟樣芽孢桿菌菌粉與枯草芽孢桿菌N9-1-35菌粉、丁酸梭菌Cb-2菌粉和玉米澱粉混合製成複合微生態製劑。
10.一種複合微生態製劑，其特徵在於由產酸蠟樣芽孢桿菌菌粉、枯草芽孢桿菌 N9-1-35菌粉、丁酸梭菌Cb-2菌粉及玉米澱粉混合製成，其中，三種菌粉及玉米澱粉的質量比為1 2 2 5，各菌粉的活菌數分別大於或者等於1.0X109CfU/g、5.0X108CfU/g、 5. 0X108cfu/g。
全文摘要
本發明公開了一株產酸蠟樣芽孢桿菌，該菌株命名為蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)，已於2011年10月16日保藏於中國典型培養物保藏中心，其保藏編號為CCTCC M 2011352。本發明的菌株可以用於製備微生態製劑，應用時，產酸蠟樣芽孢桿菌菌粉可以單獨作為有效成分與玉米澱粉混合製成微生態製劑，或產酸蠟樣芽孢桿菌菌粉與其它至少一種有效成分或菌粉以及玉米澱粉混合製成複合微生態製劑。本發明還提供了一種複合微生態製劑M3，其是以三大耐高溫菌種枯草芽孢桿菌N9-1-35、丁酸梭菌Cb-2以及本發明的產酸芽孢菌GF1及玉米澱粉混合製成，三種菌粉及玉米澱粉的質量比為1∶2∶2∶5，各菌粉的活菌數分別大於或者等於1.0×109cfu/g、5.0×108cfu/g、5.0×108cfu/g。
文檔編號C12N1/20GK102517238SQ20111045528
公開日2012年6月27日 申請日期2011年12月30日 優先權日2011年12月30日
發明者劉巧利, 單寶龍, 張建梅, 穆熙軍, 翟延慶, 胡順珍, 謝全喜, 谷巍 申請人:山東寶來利來生物工程股份有限公司