人膀胱癌細胞系的製作方法

2023-07-03 23:38:06

專利名稱：人膀胱癌細胞系的製作方法
技術領域：
本發明屬於動物細胞系領域，具體涉及人膀胱癌細胞系。
背景技術：
膀胱癌是最常見的泌尿系腫瘤之一，直接威脅患者的生存。世界範圍內，2008年膀胱癌新發病例386300，有150200例病人死於膀胱癌。在美國，2010年膀胱癌新發病病例 70530，其中膀胱癌導致死亡的病例為14683。在我國，男性膀胱癌發病率位居全身腫瘤的第八位，女性排在第十二位以後.雖然發病率遠低於西方國家，但是近年來，我國部分城市腫瘤發病率報告顯示膀胱癌發病率有增高趨勢。膀胱癌主要可以分為兩種類型肌層浸潤和非肌層浸潤。70% -80%新確診的膀胱癌患者為非肌層浸潤癌，即使及時給予相關治療也會有50% -70%的復發率和 10%-30%的患者進展為肌層浸潤癌。但是後者極易發生局部浸潤或者遠處轉移，雖然行全膀胱切除術和淋巴結清掃，病人也常常難以治癒，是導致病人死亡的主要原因。目前，對包括膀胱腫瘤在內的惡性腫瘤的器官轉移的機制不明確，晚期腫瘤病人往往不宜手術，導致器官轉移癌標本難以獲取，轉移性腫瘤診療和機制研究也因此相對滯後。為深入了解膀胱癌細胞的轉移機制，必須建立合適的研究模型。目前普遍應用的人癌轉移模型，是人癌細胞接種於免疫缺陷動物體內所形成的動物模型(例如接種於裸鼠形成人癌裸鼠轉移模型)，以及能在免疫缺陷動物體內發生轉移的人癌細胞系。目前在中國用於研究的膀胱癌細胞系存在以下問題膀胱癌細胞系多來源於國外人群，因為種族差異性的存在，其能否代表我國膀胱癌的類型和特點存在疑問。因此，發明人希望能夠建立一株來源於中國人的人膀胱癌細胞系，為研究膀胱癌轉移機制提供適宜的研究模型材料。

發明內容
本發明一方面提供了一種人膀胱癌細胞系，其保藏號為CCTCC NO. C201180。本發明另一方面提供了一種人膀胱癌轉移細胞系製備方法，該方法包括以下兩個步驟(1)將權利要求1所述的人膀胱癌細胞系接種於模式動物體內轉移擴增成瘤後，取所形成的轉移瘤進行細胞培養；( 再將步驟(1)培養後所得細胞接種於模式動物體內，轉移擴增後形成二次轉移瘤，取所形成的二次轉移瘤進行細胞培養來獲得所述的人膀胱癌轉移細胞系。在本發明的一個具體實施方案中，所述的模式動物為裸小鼠或裸大鼠，優選的，模式動物為裸小鼠。在本發明的另一個具體實施方案中，所述的步驟(1)和( 的接種部位都為膀胱。優選的，所述的人膀胱癌轉移細胞係為腹膜後淋巴結轉移細胞系、肺門淋巴結轉移細胞系、肝臟轉移細胞系、腎上腺轉移細胞系或腎臟轉移細胞系。本發明再一方面提供了一種人膀胱癌原位瘤細胞的製備方法，所述的人膀胱癌原位瘤細胞是通過將上述的保藏號為CCTCC NO. C201180的人膀胱癌細胞系接種於裸小鼠的膀胱後擴增形成原位瘤後，取所形成的原位瘤進行細胞培養而獲得的。


圖1顯示了右腎上極轉移灶；圖2顯示了髂淋巴結轉移灶；圖3顯示了腹膜後淋巴結轉移灶；圖4顯示了肝臟轉移灶。
具體實施例方式本發明的保藏號為CCTCC NO. C201180的人膀胱癌細胞系的建系過程原代細胞的獲得一名52歲女性患者，因血尿1月伴尿頻尿急來長海醫院就診，經檢查患有膀胱癌。 膀胱鏡檢提示膀胱右側壁2cmX2cm佔位，取活檢病理提示高級別尿路上皮癌(膀胱癌T2 期)。之後進行了膀胱癌根治術(術前同患者及其家屬籤署術後標本用於科研的知情同意書)。術後，取該患者的肌層浸潤癌組織約0. 5X0. 5cm，放入15ml離心管加入0. 5%膠原酶IV2-3ml震蕩後37°C消化15min ；充分消化後用Iml玻璃吸管反覆吹打至無明顯組織塊後放入離心機700g離心5min。棄上清，加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培養液IOml和雙抗(青黴素和鏈黴素)IOOul後吹打均勻放入兩個25cm2培養瓶中於37°C CO2濃度為5%的美國Thermo 二氧化碳孵養箱內培養二4小時後換液繼續培養。2-3天換液一次，並用相差顯微鏡觀察上皮細胞和間質細胞生長狀態；(兩培養瓶中的上皮細胞呈不規則的多邊形和梭形，間質細胞呈長條形或繩索狀，二者均貼壁生長)； 5天後相差顯微鏡下觀察時，發現細胞培養瓶底即出現大量細胞克隆(此時可見間質細胞和上皮細胞混雜生長)。再採用選擇消化法去除間質細胞(0. 25%胰酶用PBS稀釋10倍，加入培養瓶顯微鏡下觀察間質細胞由條索狀變為圓球時輕輕吹打，吹打下來的細胞為間質細胞)；再按常規細胞消化法獲得剩下的細胞，繼續培養。採用選擇消化法3次後可基本清除間質細胞，剩下的細胞即原代細胞。細胞系的獲得將原代細胞轉入75cm2培養瓶中，按常規傳代方法繼續培養(1、培養基含10%胎牛血清的RPMI-1640培養液IOml和雙抗(青黴素和鏈黴素)IOOul ；2、培養環境條件37°C， CO2濃度為5%的美國Thermo 二氧化碳孵養箱內)三周後獲得穩定傳代的細胞系，即本發明的保藏號為CCTCC N0.C201180的人膀胱癌細胞系。經觀察，該細胞系的細胞形態和生長速度不變，凍存後復甦良好，是為穩定的細胞系。
保藏號為CCTCC NO. C201180的細胞系的生物學特性結果本細胞系經過檢測，其一般生物學特性表明該細胞係為不規則的多邊形和梭形上皮樣細胞，貼壁生長。細胞活性檢測用CCK-8試劑檢測了該細胞系的增殖活性，其倍增時間區間為 48-72小時。染色體核型分析結果表明該細胞系的核型有著明顯異常，如1號染色體長臂缺失，2號染色體斷臂缺失，5號染色體長臂與8號染色體斷臂出現轉位。免疫組化檢測結果表明該細胞系高表達人CKaei蛋白(提示該細胞系來源於尿路上皮)，低表達P53蛋白，幾乎不表達Ki-67。人膀胱癌動物轉移模型的建立將保藏號為CCTCC NO. C201180的細胞系傳至第20代時用胰酶消化離心用 RPMI-1640培養液配成每IOOul含1_5X IO6的個細胞的懸液IOOOul備用。選取生長狀態良好的4-6周雌性裸鼠用於建立動物模型。待裸鼠麻醉後，腹部及會陰部消毒，有24G靜脈留置針為導尿管插裸鼠膀胱內排空膀胱後注入胰酶lOOul，用1號線結紮裸鼠尿道並同時退出導管。胰酶消化膀胱30min後抽出胰酶並用IOOul PBS衝洗膀胱一次，注入準備好的細胞懸液lOOul，同樣結紮尿道。兩小時後去除結紮線，獲得人膀胱癌動物轉移模型。(A)觀察處理後裸鼠的生長狀態，獲得該細胞系的成瘤性情況接種了 10隻裸鼠， 平均成瘤時間為13-14天，成瘤率為90%。(B)將荷瘤鼠五周後處死，處死後解剖。人膀胱癌原位瘤細胞系取膀胱部位形成的原位瘤進行細胞培養，建立人膀胱癌原位瘤細胞系，其建系操作參見上述本發明的CCTCC NO. C201180的細胞系的建系過程，以下細胞系的建系過程皆同。人膀胱癌轉移細胞系(1)對解剖後的荷瘤鼠，由下向上按系統仔細分析觀察各臟器有無異常或腫瘤轉移。經解剖發現發生了右腎上極轉移，參見圖1，線條標識處為右腎上極轉移灶(具體來說接種了 10隻雌性裸鼠，有1隻在種植後一周死亡。另外9隻於種植後35天處死，解剖發現有1隻右側腎臟上極轉移，另1隻左側輸尿管浸潤。)。雙側腎盂及輸尿管未見異常(提示CCTCC NO. C201180細胞可能是通過血液循環轉移到雙側腎臟，而不是通過輸尿管逆行而上)。(2)取出右腎上極轉移瘤進行細胞培養，建系。穩定傳代至少10代後，再將一次轉移瘤的細胞系原位接種於裸鼠(接種操作參見上述CCTCC N0.C201180的細胞系的接種過程)。具體來說，將穩定傳代至少10代後的右腎上極轉移瘤細胞系原位接種於10隻雌性裸鼠膀胱，同樣35天後處死10隻裸鼠，解剖後發現，10隻裸鼠均發生不同數目的遠處轉移。解剖後發現了髂淋巴結、腹膜後淋巴結以及肝臟等多處轉移，參見附圖2、3、4的線條標識處，分別為髂淋巴結轉移灶、腹膜後淋巴結轉移灶以及肝臟轉移灶。取所形成的二次轉移瘤進行細胞培養，並建系，獲得了腹膜後淋巴結轉移細胞系、肺門淋巴結轉移細胞系、肝臟轉移細胞系、腎上腺轉移細胞系或腎臟轉移細胞系。這些轉移細胞系經過檢測，其一般生物學特性表明這些細胞係為不規則的多邊形或圓餅狀，貼壁生長。這些轉移細胞系的細胞活性檢測、染色體核型分析結果、免疫組化檢測結果基本上同保藏號為CCTCC NO. C201180的細胞系，無明顯差異。Westen blot 檢測結果表明N_cadherin、β -catenin、Slug、Snail 顯示發生淋巴結轉移的細胞中有顯著高表達；肝臟轉移、第二次腎臟轉移和輸尿管浸潤細胞與原位瘤比 Fibronectin表達量未見升高。細胞周期相關蛋白P27在各個轉移灶的表達量較保藏號為 CCTCC NO. C201180的細胞系均有不同成程度降低。Real-time PCR檢測惡性腫瘤常見轉移相關通路關鍵蛋白在mRNA水平的表達量在各個轉移細胞系中不完全相同。流式細胞儀檢測腫瘤幹細胞標記物CD47在轉移後的細胞系中表達量明顯升高。從上述結果可以看出，本發明的保藏號為CCTCC NO. C201180的人膀胱癌細胞系成功建立了人膀胱癌裸鼠轉移模型，即將其原位接種於裸鼠膀胱發生了右腎上極轉移。取獲得的轉移瘤細胞再次原位接種於裸鼠膀胱獲得了人膀胱癌裸鼠多器官轉移模型，並篩選出多種高器官轉移性細胞系。可以對這些細胞系和裸鼠轉移模型進行膀胱癌基因和轉移相關的機制研究。總之，本發明的人膀胱癌細胞系，以及轉移細胞系，對膀胱癌轉移機制和診療的研究有著重要意義，為實驗研究提供了合適的研究材料。細胞保藏本發明的人膀胱癌細胞系(T921)已於2011年8月31日保藏於中國典型培養物保藏中心(CCTCC，中國武漢)，保藏登記號為CCTCC NO. C201180。
權利要求
1.一種人膀胱癌細胞系，其保藏號為CCTCC N0.C201180。
2.一種人膀胱癌轉移細胞系的製備方法，其特徵在於該方法包括以下兩個步驟(1) 將權利要求1所述的人膀胱癌細胞系接種於模式動物體內轉移擴增成瘤後，取所形成的轉移瘤進行細胞培養；( 再將步驟(1)培養後所得細胞接種於模式動物體內，轉移擴增後形成二次轉移瘤，取所形成的二次轉移瘤進行細胞培養來獲得所述的人膀胱癌轉移細胞系。
3.如權利要求2所述的製備方法，其特徵在於所述的模式動物為裸小鼠或裸大鼠。
4.如權利要求3所述的製備方法，其特徵在於所述的步驟(1)和(2)的接種部位都為膀胱。
5.如權利要求4所述的製備方法，其特徵在於所述的人膀胱癌轉移細胞係為腹膜後淋巴結轉移細胞系、肺門淋巴結轉移細胞系、肝臟轉移細胞系、腎上腺轉移細胞系和腎臟轉移細胞系。
6.一種人膀胱癌原位瘤細胞的製備方法，其特徵在於所述的人膀胱癌原位瘤細胞是通過將權利要求1所述的人膀胱癌細胞系接種於裸小鼠的膀胱後擴增形成原位瘤後，取所形成的原位瘤進行細胞培養而獲得的。
全文摘要
本發明涉及一種人膀胱癌細胞系(其保藏號為CCTCC NO.C201180)及其轉移細胞系。其對膀胱癌轉移機制和診療的研究有著重要意義，為實驗研究提供了合適的研究材料。
文檔編號C12N5/09GK102344910SQ201110315910
公開日2012年2月8日 申請日期2011年10月18日 優先權日2011年10月18日
發明者任善成, 孫穎浩, 徐偉東, 許傳亮 申請人:任善成, 孫穎浩, 徐偉東, 許傳亮