一種新型隱球菌檢測試劑盒的製作方法
2023-07-03 23:52:01
一種新型隱球菌檢測試劑盒的製作方法
【專利摘要】本發明提供一種新型隱球菌（CN-DNA）檢測試劑盒，所述試劑盒中包括核酸釋放劑和PCR反應液，所述核酸釋放劑包含莎梵婷（surfactin）0.01～0.5mmol/L，氯化鉀20～300mmol/L，十二烷基磺酸鈉0.01～2%和乙醇0.05～1%；所述PCR反應液中包含用於CN-DNA檢測的引物和探針序列如下，CN-DNA上遊引物：TGGACTTGGATTTGGGTGTTT，CN-DNA下遊引物：GGTAATCACCTTCCCACTAACACAT，CN-DNA探針：CTGCAAAGGACGTCGGCTCGCC。使用本發明的試劑盒檢測新型隱球菌的靈敏度高，定量線性範圍寬；應用該試劑盒可以對全血、血清（血漿）、肺泡灌洗液等培養物中的CN-DNA進行快速準確的檢測，為診斷新型隱球菌感染提供可靠的實驗依據。
【專利說明】一種新型隱球菌檢測試劑盒
【技術領域】
[0001]本發明提供一種新型隱球菌檢測試劑盒，具體是一種基於螢光PCR的CN檢測試劑盒。
【背景技術】
[0002]新型隱球菌(Cryptococcus Neoformans, CN)是一種可引起人類嚴重感染的酵母樣病原真菌，主要引起細胞免疫功能低下者，如器官移植、長期應用激素及愛滋病(AIDS)患者並發隱球菌病。
[0003]新型隱球菌通常經呼吸道或皮膚黏膜破損處侵入人體，血行播散至腦、骨骼和皮膚。有80%病例中樞神經系統受損，引起慢性腦膜炎，此外，還可引起肺隱球菌病，以及其他感染，如侵害淋巴結、骨、皮膚等引起炎症、膿腫等。臨床檢測方法主要有墨汁染色、腦脊液細胞形態學檢驗、組織病理學方法等。墨汁染色和腦脊液細胞形態學檢驗、組織病理學方法均難以計數，且需進行創傷性操作，臨床應用具有局限性。
[0004]近年來以DNA為基礎的PCR分子生物學檢測方法因快速、準確而倍受關注，成為探索的熱點，主要包括巢式PCR (nest PCR)、實時突光定量PCR (real-time fluorescencequantify PCR)等。由於實時螢光定量PCR在速度、操作、特異性等多方面存在眾多優勢，因此臨床上其中新型隱球菌感染早期診斷領域的應用愈加廣泛，給臨床診斷和治療帶來了重要的指導意義。
[0005]運用螢光PCR技術檢測新型隱球菌DNA主要包括新型隱球菌核酸提取和核酸PCR擴增兩方面。
[0006]目前國內臨床上主要採用機械破碎法對新型隱球菌核酸進行提取:先將分泌物樣本濃縮、洗滌，再加裂解液，反覆高速震蕩和高速離心，再取上清為模板。該方法的優點在於對於樣本中的PCR抑制物去除較徹底，但存在步驟繁瑣，操作時間長，對於操作人員技術水平要求高和需添置專門的設備等不足之處。
[0007]臨床上檢測CN-DNA的方法目前主要是基於實時螢光定量PCR的技術及其改進，實時螢光定量PCR技術是近年來發展迅速的一種核酸檢測技術，使用一種帶有螢光檢測裝置的PCR擴增儀，螢光檢測裝置能夠按照一定的程序周期性地發出特定波長的激發光，收集檢測螢光信號，通過檢測螢光信號的動態變化實時反映PCR的每個循環的擴增水平，試驗結束後可通過軟體自動分析獲得擴增曲線，根據擴增曲線與螢光閾值線的交點(即Ct值)以及擴增曲線的形狀，可以判斷陰陽性結果；如果同一反應中有已知濃度的定量參考品或標準品，則可以通過軟體自動分析獲得標準曲線，由此實現對未知樣本的定值(即定量檢測)。與傳統的PCR相對比，其在反應體系中增加了一條兩端分別標記螢光報告基團和淬滅基團的探針。探針結構完整時，螢光報告基團發出的螢光能量被淬滅基團吸收，呈現淬滅效應；如果擴增過程中有靶序列的存在，隨著目標片段的延伸，探針分子逐漸被Taq酶水解切斷，螢光報告基團與淬滅基團相互解離，阻斷了二者間螢光能量轉移效應，螢光報告基團發出的螢光信號被螢光檢測裝置收集。隨著擴增的進行，螢光信號隨著目的片段的擴增而呈現線性增強。試驗結束後，可以通過螢光PCR儀自帶的軟體自動分析數據，可以獲得陰陽性結果和樣本濃度的定值結果，因此，該技術在靶多核苷酸樣品的檢測和定量分析中，已逐漸取代傳統的PCR方法，得到十分廣泛的應用。
[0008]目前國外已有基於實時螢光定量PCR技術檢測CN-DNA的試劑盒，但這些試劑盒的核酸提取過程較複雜，樣本處理耗時長，且在處理樣本時，樣本中的DNA存在損耗，尤其對於高濃度的樣本，裂解不充分、富集不完全，會造成DNA的大量丟失導致樣本定量偏低。且其檢測靈敏度不高，某些弱陽性樣本經常無法擴增。這些試劑盒大多缺乏完善的質控體系，還需要進一步完善和提高技術水平，使此類產品更加滿足臨床準確診斷的需要。另外，受限於現有技術中針對CN-DNA檢測的引物探針序列，本領域還需要開發出一種檢測CN-DNA特異性好且綜合性能優良的PCR檢測試劑盒。
【發明內容】
[0009]本發明提供一種核酸釋放劑在新型隱球菌檢測中的應用，所述核酸釋放劑包含莎梵婦(surfactin)0.01 ~0.5mmol/L,氯化鉀 20 ~300mmol/L,十二烷基橫酸鈉 0.01 ~2%和乙醇0.05~1%。
[0010]在本發明所述核酸釋放劑中，其溶劑可以為本領域常用的，例如為無菌水或TE緩衝液。本發明首次披露在CN檢測中使用含強蛋白變性劑的核酸釋放劑，在很大程度上簡化了該核酸檢測的步驟，而且檢測靈敏度有了很大的提高。
[0011]本發明提供一種新型隱球菌(CN-DNA)檢測試劑盒，所述試劑盒中包括核酸釋放劑和PCR反應液，所述核酸釋放劑包含莎梵婦(surfactin) 0.01~0.5mmol/L,氯化鉀20~300mmol/L，十二烷基磺酸鈉0.01~2%和乙醇0.05~1% ;所述PCR反應液中包含用於CN-DNA檢測的引物和 探針序列如下，
[0012]CN-DNA 上遊引物:TGGACTTGGATTTGGGTGTTT，
[0013]CN-DNA 下遊引物:GGTAATCACCTTCCCACTAACACAT，
[0014]CN-DNA 探針:CTGCAAAGGACGTCGGCTCGCC。
[0015]使用本發明試劑盒中的核酸釋放劑釋放核酸的方法與煮沸法提取核酸的檢測結果沒有明顯差異，而本發明中提取核酸時採用強烈的蛋白變性劑，快速破壞病原體外殼蛋白結構，釋放出病原體核酸，無需加熱即可完成DNA的釋放和提取；本發明試劑盒檢測CN的靈敏度高，定量線性範圍寬。另外，本發明的試劑盒因採用用於檢測靶多核苷酸的上述引物和探針序列，具有很好的特異性。
[0016]本發明中，優選所述試劑盒中還包括內標，且所述PCR反應液中還包含用於檢測內標的引物和探針序列，
[0017]內標:AGTGAAGACTTACACAAGCCTGGGCAAGTTAGCGTACAACTACCCGGTACTAACTATGTTGGGCCTGGCAATGAGCTACAAGCTGGGCCCCCGCAAAGTGCTGTTGACAGTGCTGCAAGGATTCA ；
[0018]內標上遊引物:TGAAGACTTACACAAGCCTGGG,
[0019]內標下遊引物:TGAATCCTTGCAGCACTGTC，
[0020]內標探針:ACTACCCGGTACTAACTATGITGGGCCTG。
[0021]本發明中所述內標為插入pUC18T載體的一段長為125鹼基對的人工合成DNA序列的重組體，即質粒，它作為PCR擴增體系中的陽性內對照，預防由於樣本中可能存在的PCR幹擾物質導致的假陰性。
[0022]優選本發明所述試劑盒中還包括酶混合液，所述酶混合液中包含耐熱DNA聚合酶(Taq酶)和0.5~2U/ U I的尿嘧啶DNA糖基化酶(UNG酶)，同時在所述PCR反應液中還包含dUTP。其中UNG酶的功能是降解含有dU的PCR產物，利用UNG酶和PCR反應液中的dUTP可以起到預防PCR產物汙染的作用，從而防止樣本檢測假陽性。
[0023]在一個【具體實施方式】中，所述試劑盒中包括核酸釋放劑、內標、PCR反應液、酶混合液、CN定量參 考品、CN陽性對照、CN陰性對照和CN濃縮液。
[0024]本發明還提供一種新型隱球菌CN-DNA檢測試劑盒，所述試劑盒中包括PCR反應液，所述PCR反應液中包含用於CN-DNA檢測的引物和探針序列如下，
[0025]CN-DNA 上遊引物:TGGACTTGGATTTGGGTGTTT，
[0026]CN-DNA 下遊引物:GGTAATCACCTTCCCACTAACACAT，
[0027]CN-DNA 探針:CTGCAAAGGACGTCGGCTCGCC。
[0028]本發明提供的新型隱球菌螢光定量PCR檢測試劑盒操作快速、方法簡便、檢測靈敏度高、檢測範圍寬，應用該試劑盒可以對全血、血清(血漿)、肺泡灌洗液等培養物中的CN-DNA進行快速準確的檢測，為診斷新型隱球菌感染提供可靠的實驗依據。
【具體實施方式】
[0029]以下僅為本發明的優選實施方式，本發明的保護範圍並不局限於此，任何本領域的技術人員在本發明公開的技術範圍內，可很容易進行的改變或變化都涵蓋在本發明的保護範圍之內。因此，本發明的保護範圍應以權利要求書的保護範圍為準。
[0030]另外，如未做特殊交待，則本發明中的百分含量指質量百分含量。
[0031]實施例1
[0032]本實施例提供一種具體的新型隱球菌檢測試劑盒，它包括如下組分:
[0033]①核酸釋放劑:包含莎梵婦(surfactin) 0.lmmol/L,氯化鉀100mmol/L,十二烷基磺酸鈉(SDS) 0.1%，0.1%的乙醇和溶劑TE緩衝液。
[0034]②內標(陽性內對照):為插入PUC18T載體的一段長為125鹼基對的人工合成DNA序列的重組體，即質粒，濃度為2.00E+05copies/ml, 125鹼基對的序列為:
[0035]5，-AGTGAAGACTTACACAAGCCTGGGCAAGTTAGCGTACAACTACCCGGTACTAACTATGTTGGGCCTGGCAATGAGCTACAAGCTGGGCCCCCGCAAAGTGCTGTTGACAGTGCTGCAAGGATTCA-3』 ；
[0036]③PCR反應液:包括10XPCR反應緩衝液5iU，0.2mmol/L的dNTP，用於靶多核苷酸擴增的上、下遊引物均為0.3i!m0l/L，用於靶多核苷酸檢測的探針為0.3i!m0l/L，用於內標片段擴增的上下遊引物均為0.lymol/L，用於檢測內標的探針為0.lymol/L。其中，所述10XPCR反應緩衝液為包括pH7.5的200mmol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽溶液、30mmol/L氯化鎂溶液、500mmol/L氯化鉀溶液、0.2%的曲拉通溶液和10%的甲醯胺溶液；所述dNTP包括dATP、dCTP、dUTP、dGTP和dTTP ;所述用於靶多核苷酸擴增的上下遊引物及用於靶多核苷酸檢測的探針是源於新型隱球菌核酸的保守區域的引物和探針，其鹼基序列分別為:
[0037]CN-DNA 上遊引物:5 』 -TGGACTTGGATTTGGGTGTTT-3，，
[0038]CN-DNA 下遊引物:5，-GGTAATCACCTTCCCACTAACACAT-3，，[0039]CN-DNA 探針:5』 -CTGCAAAGGACGTCGGCTCGCC-3』 ；
[0040]所述的用於檢測內標的引物探針序列分別為:
[0041 ]內標上遊引物:5 』 -TGAAGACTTACACAAGCCTGGG-3，，
[0042]內標下遊引物:5』 -TGAATCCTTGCAGCACTGTC-3，，
[0043]內標探針:5』 -ACTACCCGGTACTAACTATGTTGGGCCTG-3』。
[0044]④酶混合液:包含5U/ U I的耐熱DNA聚合酶(Taq酶)和0.3U/ U I的尿嘧啶DNA糖基化酶(UNG酶)。
[0045]⑤CN定量參考品:來源於使用CN企業定量線性參考品LI~L5定值後的CN強陽性質粒，該定量參考品包括A、B、C、D四個濃度組成的梯度參考品，其濃度分別為1.00~
.5.00E+06CFU/ml (A)、1.00 ~5.00E+05CFU/ml (B)、1.00 ~5.00E+04CFU/ml (C)、1.00 ~.5.00E+03CFU/ml (D)。
[0046]⑥CN陽性對照:為臨床醫院收集的CN強陽性樣本，其濃度為1.00~.5.00E+05CFU/ml。
[0047]⑦CN陰性對照:為滅菌生理鹽水。
[0048]⑧CN濃縮液:聚乙二醇6000 (PEG_6000)10~100mmol/L (質量/體積)，氯化鈉50~500mmol/L (質量/體積)。
[0049]實施例2
[0050]本實施例提供上述實施例1所述試劑盒用於檢測全血、血清(血漿)、肺泡灌洗培養物等未知樣本中CN-DNA的操作步驟:
[0051]一、試劑準備
[0052]根據待測樣本、CN陰性對照、CN陽性對照以及CN定量參考品A~D的數量，按比例取相應量的PCR反應液(38 iil/人份)、酶混合液(I iil/人份)及內標0.5 iil/人份，充分混勻成PCR-mix ;瞬時離心後備用。
[0053]二、核酸提取
[0054]1.待測樣本:取100 U I待測樣本，加入CN濃縮液100 U 1，振蕩混勻後12，OOOrpm離心5min，棄上清，沉澱中加入50 U I核酸釋放劑，震蕩或移液槍吸打混勻，100°C處理IOmin, 12000r/min離心3min,作為待測樣本備用。
[0055]2.CN陰性對照、CN陽性對照、CN定量參考品:CN陰性對照、CN陽性對照、CN定量參考品A~D分別取10 iil與10 iil核酸釋放劑混勻待用。
[0056]三、向PCR反應管中加樣
[0057]每個PCR反應管中加入上述第二步驟中處理後的待測樣本、CN陰性對照、CN陽性對照以及CN定量參考品A~D各IOiU ;靜置10分鐘後，每管加入步驟一中的PCR-mix40 u 1，吸打混勻2-3次，去除氣泡後蓋上管蓋，2000rpm離心30秒。
[0058]四、螢光PCR反應與結果分析(在螢光定量PCR擴增儀上進行)
[0059]1)將PCR反應管放入擴增儀樣品槽，按對應順序設置待測樣本名稱及定量參考品濃度。
[0060]2)突光檢測通道選擇:選擇FAM通道(Reporter: FAM, Quencher: None )檢測CN ;選擇 HEX 或 VIC 通道(Reporter: VIC, Quencher:None)檢測內標；參比突光(PassiveReference)設置為 none。[0061]3)螢光定量PCR反應條件見表1:
[0062]表1
[0063]
【權利要求】
1.一種核酸釋放劑在新型隱球菌檢測中的應用，所述核酸釋放劑包含莎梵婷(surfactin)0.01 ~0.5mmol/L,氯化鉀 20 ~300mmol/L,十二烷基橫酸鈉 0.01 ~2% 和乙醇 0.05 ~1%。
2.一種新型隱球菌CN-DNA檢測試劑盒，所述試劑盒中包括核酸釋放劑和PCR反應液，所述核酸釋放劑包含莎梵婦(surfactin)0.01~0.Smmol /I,,氯化鉀20~300mmol/L,十二烷基磺酸鈉0.01~2%和乙醇0.05~1% ;所述PCR反應液中包含用於CN-DNA檢測的引物和探針序列如下， CN-DNA 上遊引物:TGGACTTGGATTTGGGTGTTT， CN-DNA 下遊引物:GGTAATCACCTTCCCACTAACACAT，
CN-DNA 探針:CTGCAAAGGACGTCGGCTCGCC。
3.根據權利要求2所述的檢測試劑盒，其特徵在於，所述試劑盒中還包括內標，且所述PCR反應液中還包含用於檢測內標的引物和探針序列，
內標:AGTGAAGACTTACACAAGCCTGGGCAAGTTAGCGTACAACTACCCGGTACTAACTATGTTGGGCCTGGCAATGAGCTACAAGCTGGGCCCCCGCAAAGTGCTGTTGACAGTGCTGCAAGGATTCA ； 內標上遊引物:TGAAGACTTACACAAGCCTGGG， 內標下遊引物:TGAATCCTTGCAGCACTGTC， 內標探針:ACTACCCGGTACTAACTATGITGGGCCTG。`
4.根據權利要求2所述的檢測試劑盒，其特徵在於，所述試劑盒中還包括酶混合液，所述酶混合液中包含耐熱DNA聚合酶(Taq酶)和0.5~2U/ U I的尿嘧啶DNA糖基化酶(UNG酶)，同時在所述PCR反應液中還包含dUTP。
5.根據權利要求2~4中任意一項所述的試劑盒，其特徵在於，所述試劑盒中包括核酸釋放劑、內標、PCR反應液、酶混合液、CN定量參考品、CN陽性對照、CN陰性對照和CN濃縮液。
6.一種新型隱球菌CN-DNA檢測試劑盒，所述試劑盒中包括PCR反應液，所述PCR反應液中包含用於CN-DNA檢測的引物和探針序列如下， CN-DNA 上遊引物:TGGACTTGGAITTGGGTGITT， CN-DNA 下遊引物:GGTAATCACCTTCCCACTAACACAT，
CN-DNA 探針:CTGCAAAGGACGTCGGCTCGCC。
【文檔編號】C12Q1/04GK103740832SQ201410017251
【公開日】2014年4月23日 申請日期:2014年1月15日 優先權日:2014年1月15日
【發明者】戴立忠, 張操昊, 鄧中平 申請人:湖南聖維爾醫學檢驗所有限公司