用於腎移植排斥反應血清多肽檢測方法

2023-07-04 07:58:46

專利名稱：用於腎移植排斥反應血清多肽檢測方法
用於腎移植排斥反應血清多肽檢測方法
技術領域：
本發明涉及生物醫學檢驗領域，尤其涉及一種用於腎移植排斥反應的血清多肽檢測方法。
背景技術：
同種異體腎移植術是大多數終末期腎臟病人的首選治療方案。隨著外科手術和免 疫抑制療法的發展進步，接受移植手術後存活超過一年的病人存活率已大於90%，但在移 植後早期發生的移植物功能障礙仍是臨床上亟待解決的難題之一，需要與當前的處置排斥 反應的治療手段相結合進行有效的早期監測。目前，國際唯一公認的確診腎移植排斥反應 的方法是移植腎活組織檢查，該方法花費較高、操作不便，會給病人造成創傷、引起疼痛，同 時還會引發如出血、感染、移植物失功等一系列併發症。一些報導還指出該監測手段並不能 反映移植腎早期的變化，原因是腎功能並不總是與組織學的好轉相關聯。因此，急需開發一 種能夠替代腎活檢的非侵襲性的檢測方法，以降低因腎活檢引起的併發症的發生風險。此 夕卜，應用非侵襲性的手段來評價移植腎功能，尋找到一系列新的具有高度敏感性和特異性 的生物標記物，可以使更多的移植病人能及早監測到排斥反應發生，便於醫生採取及時有 效的治療方案。血清是生物醫學研究領域理想的生物學樣品，因為它最易受人體內環境的各種因 素影響，它的獲得是非侵襲性的，能夠進行廣泛收集。生物體的血清中約含有超過10，000 種的差異蛋白和多肽，這些蛋白和多肽來自機體各部的組織和細胞，它們在數量和質量上 的變化都是特異的，不僅受到疾病對組織的影響，還受到整個疾病過程的影響。血清蛋白主 要由白蛋白、免疫球蛋白、抗胰蛋白酶、轉鐵蛋白和低豐度蛋白在內的總蛋白量構成，能指 示人體內環境的複雜變化情況。在疾病診斷和藥物監測的研究領域，研究者們對人類和實 驗動物血清蛋白質圖譜的研究產生了極大的興趣，各種血清蛋白質組學技術的開發應用使 得疾病生物標記物的鑑定和藥品安全和治療監測成為現實。血清蛋白質組學分析技術不僅 在疾病診斷和治療監測方面較其他生物分析技術更具有優勢，而且新的分析技術應用於蛋 白質組學研究為從複雜的樣品中同步鑑定分析物提供了可能。譬如蛋白質組學的核心技術 之一質譜技術，就可以讓我們僅用數微升的血清便可獲得數以百計的小型或中等大小的多 肽。基質輔助雷射角軍吸電離法(matrix assisted laser desorption ionization, MALDI)是一種廣泛應用於蛋白質組學研究的質譜技術，是公認的用來分析蛋白質和多肽的 一種最強大的工具。該技術引領了蛋白功能研究的革命，改進了質譜分析的精確度和靈敏 度，使得對蛋白質的檢測和鑑定達到了前所未有的水平。該技術已被成功地用來從生物液 體中發現與疾病相關的生物標記物，研究蛋白間的相互作用，同時，MALDI-TOF MS(基質輔 助雷射解析電離飛行時間質譜)檢測法在免疫蛋白質組學研究領域的應用前景也不容忽 視。通過採用MALDI-TOF MS法聯合磁珠純化技術分離血清樣本，並分析血清多肽的生物學 信息，獲得移植排斥反應患者血清多肽的質譜圖，從而評估從小樣本量中得到的差異性多肽作為檢測腎移植排斥反應的潛在生物標記物的價值，將會為腎移植排斥反應的發病機制 及早期診斷提供新的思路和新的依據。

發明內容本發明的目的是提供一種用於腎移植排斥反應的血清多肽檢測方法，以評估從血 清樣本中得到的差異性多肽作為檢測腎移植排斥反應的潛在生物標記物的價值。為達到上述發明目的，本發明提出以下的技術方案—種用於腎移植排斥反應的血清多肽檢測方法，包含以下步驟Sl將事先收集的血清樣本按病患志願者腎活組織檢查病理分級進行分類，分為急 性移植腎排斥患者血清組、慢性移植腎排斥患者血清組、穩定移植腎功能對照血清組和健 康對照血清組；S2採用MB-WCX (弱陽離子交換磁珠)從上述血清樣本組中的血清中分別捕獲多肽 並濃縮在磁珠上形成結合分子；S3從磁珠上洗脫結合分子並進行MALDI-T0F質譜分析，將各個組別的樣本測量出 的差異多肽峰進行分類，建立分類預測模型，獲得差異多肽表達圖譜；S4將待檢測的腎移植排斥反應患者的血清樣本採用MB-WCX結合後，進行 MALDI-T0F質譜分析，並將分析結果與S3中獲得的圖譜進行比較，標定該血清樣本的多肽。本發明所提供的用於腎移植排斥反應的血清多肽檢測方法中，所述步驟S2中 MB-WCX結合的方法是S2-1渦旋混勻磁珠，獲得均勻的磁珠混懸液；S2-2將WCX磁珠混懸液轉移到標準EP管中，吸打混勻；S2-3向EP管加入樣本血清，吸打混勻； S2-4將EP管放置在磁珠分離器中，反覆分離三次，收集貼在管壁的磁珠，並用移液管移去上清液，待用。本發明所提供的用於腎移植排斥反應的血清多肽檢測方法中，所述步驟S3中從 磁珠上洗脫結合分子的步驟包括1)向EP管加入磁珠洗液，在磁珠分離器中反覆分離，收集管壁上的磁珠，並移去 上清液；2)向EP管加入WCX磁珠洗脫液，並用反覆吸打，洗滌管壁上的磁珠；3)收集管壁上的磁珠和上清液，轉移到新的EP管內，並加入WCX磁珠固定液，吸打 混勻，待用。本發明所提供的用於腎移植排斥反應的血清多肽檢測方法中，所述步驟S3中 MALDI-T0F質譜分析的參數為m/z :1，000-10, 000，每一個質譜設置800個雷射點，在50Hz 頻率下將每50個雷射點作為一個組合，並定位在不同的位點表面。本發明所提供的用於腎移植排斥反應的血清多肽檢測方法中，所述步驟S3中對 差異多肽峰進行分類前，還需要先對各組別樣品的原始譜圖進行處理，包括基線消減，並進 行校正和歸一化，再對多肽峰數據進行統計學分析。從以上技術方案可以看出，本發明所提供的用於腎移植排斥反應的血清多肽檢測 方法檢測出了有價值的差異性多肽，獲得了可作為診斷腎移植排斥反應的潛在生物標記物，建立了有效區分移植排斥反應的診斷預測模型，有助於從蛋白質組學的層面更好地理解腎移植排斥反應的發病機理，為對腎移植排斥反應做出早期診斷提供了可能。

圖1所示是本發明實施例中MB-WCX純化後各實驗組的蛋白質譜圖；圖2所示是本發明實施例中四個組別的單個樣本重複四次的質譜圖。
具體實施方式1、材料和方法1. 1樣本資料樣本血清的收集都來自空腹抽取志願者，22位腎移植志願者為經腎活檢證明發生 了排斥反應的患病志願者、12例移植術後腎功能穩定患病志願者、13例門診體檢正常的志 願者全血3ml置於生化管，4°C靜置Ih後，3000r/min離心5min，取上清冰浴，每20 μ 1裝一 份，-80°C保存。排斥患者腎活檢樣本按照BanfT97分類法進行分類，其中有10例確診為急性排斥 反應，12例確診為慢性排斥反應。12例慢性移植性腎病約在移植術後1. 0 5. 5年內發 生，10例急性排斥約在移植術後1. 0 90. 0天內發生，並且都在用免疫抑制劑之前進行腎 活檢。另有12例年齡匹配的移植功能穩定患病志願者設置為對照組，13例健康人設置為健 康對照組。1. 2移植腎活組織檢杳樣本腎活檢樣本嚴格按照BanfT97分類法進行分類，10例急排和12例慢排病人的組織 標本經免疫組化顯微鏡檢查法進行檢測和確認。1. 3運用弱陽離子磁珠結合血清蛋白採用弱陽離子交換磁珠MB-WCX (Bruker Daltonics, Ettlingen, Germany)結合樣 本的血清蛋白。①渦旋混勻磁珠lmin，獲得均一的磁珠混懸液；②將10 μ IWCX磁珠混懸液 轉移到0. 5ml的標準EP管中，用吸液槍吸打混勻；③向EP管加入每例樣本的血清各5 μ 1， 吸打混勻；④將EP管放置在磁珠分離器中，反覆分離三次，Imin後收集貼管壁的磁珠；⑤用 移液管小心地移去上清液；⑥向EP管加入100 μ 1的磁珠洗液，在磁珠分離器中反覆分離十 次，收集管壁上的磁珠，用吸液槍小心移去上清液，重複步驟六兩次；⑦向EP管加入5μ 1的 WCX磁珠洗脫液，並用移液槍反覆吸打，洗滌管壁上的磁珠；⑧2min後收集管壁上的磁珠和 上清液，轉移到新的EP管內，並加入4 μ IffCX磁珠固定液，吸打混勻，預備在MALDI-TOF MS 上點樣並進行質譜分析。1. 4MALDI-T0F 質譜分析質譜在ClinProt系統下執行，血清多肽的數據分析由Autofiex MALDI-T0F/T0F 質譜(Bruker Daltonik, Bremen, Germany)完成。設備包括 355-nm Nd-YAG 雷射、網格離 子源、延遲提取電子設備(DE)、高解析度的同步離子選擇器(TIS)、2-GHz數字轉換器。質 譜設置在m/z 1，000-10, 000的最佳化狀態，每一個質譜有800個雷射點，在50_Hz頻率下 把每50個雷射點作為一個組合，可得到16個組合，並定位在不同的位點表面。所得譜圖均 由flexAnalysis軟體(Bruker Daltonik)自動獲得，設置關鍵儀器模糊調節控制程序，以產生最佳品質的原始數據。1. 5統斤腎移棺的差異蛋白表汰譜應用ClinProTools 2. 2軟體(Bruker，Daltonik)分析所有從血清樣本中得到的各個實驗組和對照組的數據之前，應對樣品原始譜圖進行處理，包括基線消減，並進行校正 和歸一化。隨後，選擇軟體內嵌的統計算法進行統計學分析，獲得移植排斥組的差異表達蛋 白質。顯著的差異多肽峰由軟體中的Welch' s T檢驗確定，分類預測模型由快速分類算 法(Quick Classifier Algorithm, QC)建立。為了解分類預測的準確性，採用分類預測算 法隨機挑選一個樣本作為實驗樣本，其餘樣本作為驗證樣本對建立的模型進行交叉驗證。2、結果為了分析全部樣本的血清蛋白生物學信息，本實施例成功地使用MB-WCX試劑盒 對血清蛋白進行富集和純化(結果如圖1所示，圖1所示的A到C是47例樣本經WCX磁 珠純化後的分析圖譜；A中是13例正常人、12例移植功能穩定患者、10例急排反應患者的 聯合分析圖譜；B中是13例正常人、12例移植功能穩定患者、12例慢排反應患者的聯合分 析圖譜；C中是12例慢排反應患者、10例急排反應患者的聯合分析圖譜。純化後的樣品經 MALDI-T0F質譜上樣後由ClinProTools軟體分析生物學信息。圖中的(N)代表健康對照組， (S)代表移植功能穩定組，(A)代表急排組，(C)代表慢排組，每個血清樣本的生物學信息由 密度曲線表示。X軸，分子質量(m/z) ；y軸，特定的樣本；水平線表示將健康對照組、移植功 能穩定組、急排組、慢排組的樣本區分開來。4組沿X軸所展示的密度差異代表將樣本顯著 區分開的特異性多肽。樣本經MALDI-T0F MS獲得高解析度的圖譜，並經ClinPro Tools軟 件2. 2分析，經由組間的密度差異顯著區分各個樣本的差異性多肽。通過比較急排組和健康對照組的質譜圖，篩選出18個有表達差異的多肽峰作為 鑑別急排反應的潛在生物標記，各個峰m/z分別為2102. 53，2756. 02，2919. 75,2991.01, 3095. 5, 3884. 65,4056. 31,4093. 64,4212. 62,4251. 74,4647. 07,4894. 62,4919. 21, 5739. 17，5799. 75，5812. 07，5826. 5，7968. 44 ；其中 8 個在急排組高表達，分別是 m/z 2756. 02,2919. 75,4894. 62,4919. 21,5739. 17,5799. 75,5812. 07,5826. 5。在急排組和移植 功能穩定組的比較中，篩選出m/z為2079. 24，2090. 9，3229. 03，5344. 85共4個有表達差異 的多肽峰，這4個多肽峰在急排組低表達，可作為鑑別急排反應的潛在生物標記。(見下表 1)表1排斥組和對照組有顯著差異的多肽峰 Mass 質荷比；Dave 組間最大和最小的峰平均值之間的差；PTTA =Wilcoxon或 Kruskal-Wallis檢驗的P值；PAD Anderson-darling正態檢驗的P值；Ave，組間峰差的算 術平均值。在慢排組和健康對照組的比較中，篩選6個有表達差異的多肽峰，分別是m/z 2023.77,2043.16,2756. 71,2869. 99,3180. 95,5900. 5，其中 m/z 為 2023.77 和 2043.16 的多肽峰在慢排組低表達。同時，通過比較慢排組和移植功能穩定組多肽差異，發現有 16 個存在表達差異的多肽峰，分別是 m/z 2079. 01,2090. 81,2540. 69,2850. 09,2919. 88， 2939. 63,2946. 84,5329. 97,5383. 73,5951. 77,5992. 85,6043. 93,6382. 12,7835. 65， 7876. 8，9291. 89，其中 m/z 為 6382. 12，7835. 65，7876. 8 和 9291. 89 的多肽峰在慢排組高表 達。(見表1)比較分析急排組和慢排組的多肽差異，發現有6個存在表達差異的多肽峰，分 別是 m/z 1433. 88，1676. 36，3180. 75,4255. 83,4359. 83,4806. 47，其中 m/z 為 1433. 88， 1676. 36，4359. 83,4806. 47的4個多肽峰在急排組高表達，將急排組與慢排組顯著區分開 來，結果如表1所示。急排組、移植功能穩定組和健康組的比較中，篩選了 m/z為2043. 35,2647. 74， 2919. 88，2939. 82，3228. 91,8690. 67共6個有表達差異的多肽峰；慢排組、移植功能穩定 組和健康組的比較中，篩選了 m/z 為 2043. 05,2647. 56，2850，2868. 63,2919. 98,2939. 72， 3083. 95，3180. 71，3228. 98共9個有表達差異的多肽峰。另外，通過比較移植功能穩定組和 健康組的多肽差異，也篩選出了 7個有表達差異的多肽峰，分別是m/z 2043. 58,2647. 37, 2917. 8，2939. 68，3180. 59，3228. 96，5899. 34，結果如表 1 所示。本實施例採用ClinPro Tools 2. 2軟體對上述實驗結果進行統計分析，並用QC算 法對樣本進行分類以及建立診斷預測模型。該模型對於區分急排組和移植功能穩定組的 識別率為90. 28%，交叉驗證能力為83. 83% ；對區分急排組和健康組的識別率為82. 64%, 交叉驗證能力為77. 03%。建立的診斷模型對區分慢排組和移植功能穩定組的識別率為87. 85%，交叉驗證能力為86. 50% ；對區分慢排組和健康組的識別率為98. 96%，交叉 驗證能力為97. 58% ；模型對區分急排組和慢排組的識別率為88. 69%，交叉驗證能力為 84. 00%。3、結論 本發明採用了一種簡便、高效的蛋白質組學技術MB-WCX純化聯合MALDI-T0F質譜 分析作為鑑定新的生物標記物的方法。經過MB-WCX純化，組間峰值差異顯著，組內多肽峰 則保持一致(見圖2，A(急排組)、C(慢排組)、S(移植功能穩定組)、N(健康對照組)四 個實驗組的單個樣本重複四次的質譜圖，表明經WCX磁珠純化後樣品重複性好。)。在本實施例中，把血清樣本分為4組，包括急排組10例、慢排組12例、移植功能穩 定組12例、健康組13例，並比較了各組間的多肽差異。移植排斥反應是移植術後發生的一種複雜的生物學現象，臨床上的腎移植排斥反 應是各種免疫因素共同作用的結果，而特異性的免疫反應又是排斥發生的關鍵。另外，各種 併發症如糖尿病、高血壓、心血管疾病、感染及惡性腫瘤等危險因子也是直接或間接影響移 植病人移植腎排斥反應、移植腎失功以及存活的主要原因。通過健康對照組和移植各組的比較，篩選出18個有表達差異的可用於鑑別急排 組和健康組的多肽峰，其中的8個在急排組高表達；篩選出的6個有表達差異的多肽峰可用 於鑑別慢排組和健康組，其中有2個在慢排組低表達；7個有表達差異的多肽峰可用於鑑別 移植功能穩定組和健康組。上述結果表明，移植病人的血清多肽生物學信息與健康人相比 存在顯著差異。在急排組與慢排組的比較中，篩選6個有表達差異的多肽峰，4個在急排組 高表達。另外，在多個組的比較中，也獲得了有顯著差異的多肽峰，表明本實施例的4組血 清樣本的生物學信息存在顯著差異。以上所述實施例僅表達了本發明的幾種實施方式，其描述較為具體和詳細，但並 不能因此而理解為對本發明專利範圍的限制。應當指出的是，對於本領域的普通技術人員 來說，在不脫離本發明構思的前提下，還可以做出若干變形和改進，這些都屬於本發明的保 護範圍。因此，本發明專利的保護範圍應以所附權利要求為準。
權利要求
一種用於腎移植排斥反應的血清多肽檢測方法，其特徵在於，包含以下步驟S1將事先收集的血清樣本按病患志願者腎活組織檢查病理分級進行分類，分為急性移植腎排斥患者血清組、慢性移植腎排斥患者血清組、穩定移植腎功能對照血清組和健康對照血清組；S2採用MB-WCX從上述血清樣本組中的血清中分別捕獲多肽並濃縮在磁珠上形成結合分子；S3從磁珠上洗脫結合分子並進行MALDI-TOF質譜分析，將各個組別的樣本測量出的差異多肽峰進行分類，建立分類預測模型，獲得差異多肽表達圖譜；S4將待檢測的腎移植排斥反應患者的血清樣本採用MB-WCX結合後，進行MALDI-TOF質譜分析，並將分析結果與S3中獲得的圖譜進行比較，標定該血清樣本的多肽。
2.根據權利要求1所述的檢測方法，其特徵在於，所述步驟S2中MB-WCX結合的方法是S2-1渦旋混勻磁珠，獲得均勻的磁珠混懸液；S2-2將WCX磁珠混懸液轉移到標準EP管中，吸打混勻；S2-3向EP管加入樣本血清，吸打混勻；S2-4將EP管放置在磁珠分離器中，反覆分離三次，收集貼在管壁的磁珠，並用移液管 移去上清液，待用。
3.根據權利要求2所述的檢測方法，其特徵在於，所述步驟S3中從磁珠上洗脫結合分 子的步驟包括1)向EP管加入磁珠洗液，在磁珠分離器中反覆分離，收集管壁上的磁珠，並移去上清液；2)向EP管加入WCX磁珠洗脫液，並用反覆吸打，洗滌管壁上的磁珠；3)收集管壁上的磁珠和上清液，轉移到新的EP管內，並加入WCX磁珠固定液，吸打混 勻，待用。
4.根據權利要求1或3所述的檢測方法，其特徵在於，所述步驟S3中MALDI-TOF質譜 分析的參數為m/z 1, 000-10，000，每一個質譜設置800個雷射點，在50Hz頻率下將每50 個雷射點作為一個組合，並定位在不同的位點表面。
5.根據權利要求1所述的檢測方法，其特徵在於，所述步驟S3中對差異多肽峰進行分 類前，還需要先對各組別樣品的原始譜圖進行處理，包括基線消減，並進行校正和歸一化， 再對多肽峰數據進行統計學分析。
全文摘要
一種用於腎移植排斥反應的血清多肽檢測方法，包含步驟S1、將事先收集的血清樣本按供體病患程度進行分類；S2、採用MB-WCX從血清樣本組中的血清中分別捕獲多肽並濃縮在磁珠上形成結合分子；S3、從磁珠上洗脫結合分子並進行MALDI-TOF質譜分析，將各個組別的樣本測量出的差異多肽峰進行分類，建立分類預測模型，獲得差異多肽表達圖譜；S4、將待檢測的腎移植排斥反應患者的血清樣本採用MB-WCX結合後，進行MALDI-TOF質譜分析，並將分析結果與S3中獲得的圖譜進行比較，標定該血清樣本的多肽。該方法有助於從蛋白質組學的層面更好地理解腎移植排斥反應的發病機理，為對腎移植排斥反應做出早期診斷提供了可能。
文檔編號G01N33/68GK101839890SQ200910106218
公開日2010年9月22日 申請日期2009年3月20日 優先權日2009年3月20日
發明者戴勇, 晏強, 眭維國, 陳潔精, 黃禮玲 申請人:眭維國