一種楠木脂素a的提純方法
2023-05-31 10:21:01 1
專利名稱：一種楠木脂素a的提純方法
技術領域：
本發明屬於植物提取技術領域，涉及一種從紅楠乾燥樹皮中提取純化楠木脂素A的方法。
背景技術：
紅楠thunbergii Sieb. et Zucc.系樟科植物，主要分布於我國山東、江蘇、浙江、安徽、江西、福建、臺灣、四川、廣東、廣西等省區。現代藥理研究表明，楠木脂素A具有免疫抑制活性，對分裂素(刀豆球蛋白A)誘導的人外周血液淋巴細胞增生有極強的抑制作用，其IC5tl為O. (^yg/ml，與強的松龍相當；另外還具有細胞毒活性，對人型白血病細 胞株HL-60和Molt-4細胞具有細胞毒活性，其IC5tl (ng/ml)分別為26和54。楠木脂素A (Machilin A),分子式為C2tlH22O4,分子量為326. 39,為無色針晶，是從紅楠的樹皮分離出的一種木脂素類化合物。
發明內容
本發明的目的是提供一種楠木脂素A的提純方法，該方法提率高、成本低，適合規模化生產。本發明的目的是通過以下技術方案實現的
一種楠木脂素A的提純方法，其特徵在於包括以下步驟
(1)酶解取原料紅楠乾燥樹皮，經粉碎處理，用酶溶液浸泡，水浴酶解2-5小時，並充分攪拌；
(2)提取將上述酶解液過濾，取濾渣用5-6倍藥材重量的乙醇水溶液提取2-3次，合併提取液，減壓濃縮得浸膏；
(3)富集將浸膏過大孔吸附樹脂柱，醇水洗脫，收集洗脫液；
(4)純化將上述洗脫液減壓回收乙醇，上矽膠柱(矽膠粒度為100-200目)，乙酸乙酯-乙醇梯度洗脫，TLC跟蹤監測，收集楠木脂素A流分，減壓濃縮，冷凍乾燥得粗品；
(5)高速逆流色譜分離粗品採用高速逆流色譜分離，以氯仿-甲醇-水為溶劑系統，比例為(1-5): (5-9) : (3-7)，收集目標成分，濃縮乾燥即得高純度楠木脂素A。步驟(I)中所述酶可選纖維素酶、葡聚糖酶和果膠酶中的一種或幾種，酶用量為2-3. 5%0，pH 為 4-4. 6，酶解溫度為 45-50°C。步驟(2)中所述乙醇水溶液中乙醇的體積百分比濃度為80-90%。步驟(3)中所述大孔樹脂選自AB-8、XAD-16、XDA-8或HZ806型中的一種。步驟(3)中所述醇水洗脫為3-4BV10%-20%乙醇水溶液一4_6BV80%-90%乙醇水溶液。步驟(4)中所述乙酸乙酯-乙醇體積比為3-10:1。本發明採用酶解提取，有效成分更容易溶出，提高了提取率；採用採用大孔樹脂和矽膠柱粗分，比萃取法處理量大、含量高，更容易操作；採用高速逆流色譜分離，操作簡單，製備周期短，產品無損失，可得到高含量的楠木脂素A，產品純度較高。
具體實施例方式 實施例I:
取紅楠乾燥樹皮粉碎過60目篩，稱取5kg，加15LpH4. 2的纖維素酶水溶液(每kg生藥加入2. 2g纖維素酶)進行浸泡半小時，然後在42°C下水浴酶解3小時，並充分攪拌，過濾，取濾渣用5倍藥材重量的80%乙醇加熱回流提取I小時，提取3次，合併提取液，減壓濃縮得浸膏，將浸膏加熱水分散，加入XAD-16大孔吸附樹脂柱，先取3BV10%乙醇洗脫雜質，再取4BV80%乙醇洗脫有效成分，減壓回收乙醇，上矽膠柱層析(矽膠粒度為100目)，用乙酸乙酯-乙醇按10:1、5:1、3:1梯度洗脫，TLC跟蹤監測，收集楠木脂素A流分，減壓濃縮，冷凍乾燥得楠木脂素A粗品；取氯仿、甲醇、水，按比例1:5:3在分液漏鬥中充分混合，靜置，取下相注滿高速逆流色譜柱，開啟主機，設置轉速900rpm，泵入上相做流動相，建立動態平衡後，調整流速為3ml/min，用流動相溶解粗提物，由進樣閥進樣，紫外檢測器檢測，收集目標成分，連續製備合併流分，得楠木脂素Al. 3g，經HPLC檢測，含量98. 2%。 實施例2:
取紅楠乾燥樹皮粉碎過60目篩，稱取5kg，加12LpH4. 2的纖維素酶水溶液(每kg生藥加入3. Ig纖維素酶)進行浸泡半小時，然後在44°C下水浴酶解2小時，並充分攪拌，過濾，取濾渣用6倍藥材重量的90%乙醇加熱回流提取I小時，提取2次，合併提取液，減壓濃縮得浸膏，將浸膏加熱水分散，加入AB-8大孔吸附樹脂柱，先取4BV20%乙醇洗脫雜質，再取4BV90%乙醇洗脫有效成分，減壓回收乙醇，上矽膠柱層析(矽膠粒度為200目)，用乙酸乙酯-乙醇按10:1、5:1、3:1梯度洗脫，TLC跟蹤監測，收集楠木脂素A流分，減壓濃縮，冷凍乾燥得得楠木脂素A粗品；取氯仿、甲醇、水，按比例5:9:7在分液漏鬥中充分混合，靜置，取下相注滿高速逆流色譜柱，開啟主機，設置轉速850rpm，泵入上相做流動相，建立動態平衡後，調整流速為3ml/min，用流動相溶解粗提物，由進樣閥進樣，紫外檢測器檢測，收集目標成分，連續製備合併流分，得楠木脂素Al. 6g，經HPLC檢測，含量98. 1%。實施例3
取紅楠乾燥樹皮粉碎過60目篩,稱取5kg,加15LpH4. 2的纖維素酶水溶液(每kg生藥加入2g纖維素酶和果膠酶混合複合酶，纖維素酶和果膠酶的質量比為I: I)進行浸泡半小時，然後在50°C下水浴酶解5小時，並充分攪拌，過濾，取濾渣用5倍藥材重量的90%乙醇加熱回流提取I小時，提取2次，合併提取液，減壓濃縮得浸膏，將浸膏加熱水分散，加入XDA-8大孔吸附樹脂柱，先取3BV15%乙醇洗脫雜質，再取6BV90%乙醇洗脫有效成分，減壓回收乙醇，上矽膠柱層析(矽膠粒度為200目)，用乙酸乙酯-乙醇按10:1、5:1、3:1梯度洗脫，TLC跟蹤監測，收集楠木脂素A流分，減壓濃縮，冷凍乾燥得得楠木脂素A粗品；取氯仿、甲醇、水，按比例4:7:3在分液漏鬥中充分混合，靜置，取下相注滿高速逆流色譜柱，開啟主機，設置轉速800rpm，泵入上相做流動相，建立動態平衡後，調整流速為3ml/min，用流動相溶解粗提物，由進樣閥進樣，紫外檢測器檢測，收集目標成分，連續製備合併流分，得楠木脂素Al. 5g，經HPLC檢測，含量98. 3%。實施例4:
取紅楠乾燥樹皮粉碎過60目篩,稱取5kg,加12LpH4. 6的纖維素酶水溶液(每kg生藥加入3. 5g果膠酶)進行浸泡半小時，然後在45°C下水浴酶解4小時,並充分攪拌,過濾，取濾渣用10倍藥材重量的80%乙醇加熱回流提取I小時，提取3次，合併提取液，減壓濃縮得浸膏，將浸膏加熱水分散，加入HZ806大孔吸附樹脂柱，先取4BV15%乙醇洗脫雜質，再取6BV85%乙醇洗脫有效成分，減壓回收乙醇，上矽膠柱層析(矽膠粒度為100目)，用乙酸乙酯-乙醇按10:1、5:1、3:1梯度洗脫，TLC跟蹤監測，收集楠木脂素A流分，減壓濃縮，冷凍乾燥得得楠木脂素A粗品；取氯仿、甲醇、水，按比例3:7:6在分液漏鬥中充分混合，靜置，取下相注滿高速逆流色譜柱，開啟主機，設置轉速900rpm，泵入上相做流動相，建立動態平衡後，調整流速為3ml/min，用流動相溶解粗提物，由進樣閥進樣，紫外檢測器檢測，收集目標成分，連續製備合併流分，得楠木脂素Al. 5g，經HPLC檢測，含量98. 7%。實施例5:
取紅楠乾燥樹皮粉碎過60目篩,稱取5kg,加13LpH4的纖維素酶水溶液(每kg生藥加入2. 6g葡聚糖酶和果膠酶的混合複合酶，葡聚糖酶和果膠酶的質量比為1:3)進行浸泡半小時，然後在48°C下水浴酶解2小時，並充分攪拌，過濾，取濾渣用8倍藥材重量的85%乙醇加熱回流提取I小時，提取2次，合併提取液，減壓濃縮得浸膏，將浸膏加熱水分散，加入 AB-8大孔吸附樹脂柱，先取3BV20%乙醇洗脫雜質，再取5BV80%乙醇洗脫有效成分，減壓回收乙醇，上矽膠柱層析(矽膠粒度為200目)，用乙酸乙酯-乙醇按10:1、5:1、3:1梯度洗脫，TLC跟蹤監測，收集楠木脂素A流分，減壓濃縮，冷凍乾燥得得楠木脂素A粗品；取氯仿、甲醇、水，按比例3:9:7在分液漏鬥中充分混合，靜置，取下相注滿高速逆流色譜柱，開啟主機，設置轉速900rpm，泵入上相做流動相，建立動態平衡後，調整流速為3ml/min，用流動相溶解粗提物，由進樣閥進樣，紫外檢測器檢測，收集目標成分，連續製備合併流分，得楠木脂素Al. 3g，經HPLC檢測，含量98. 5%。實施例6:
取紅楠乾燥樹皮粉碎過60目篩，稱取5kg，加12LpH4. 5的纖維素酶水溶液(每kg生藥加入3. 3g纖維素酶)進行浸泡半小時，然後在40°C下水浴酶解5小時，並充分攪拌，過濾，取濾渣用8倍藥材重量的85%乙醇加熱回流提取I小時，提取3次，合併提取液，減壓濃縮得浸膏，將浸膏加熱水分散，加入HZ806大孔吸附樹脂柱，先取4BV20%乙醇洗脫雜質，再取5BV85%乙醇洗脫有效成分，減壓回收乙醇，上矽膠柱層析(矽膠粒度為100目)，用乙酸乙酯-乙醇按10:1、5:1、3:1梯度洗脫，TLC跟蹤監測，收集楠木脂素A流分，減壓濃縮，冷凍乾燥得得楠木脂素A粗品；取氯仿、甲醇、水，按比例2:5:3在分液漏鬥中充分混合，靜置，取下相注滿高速逆流色譜柱，開啟主機，設置轉速850rpm，泵入上相做流動相，建立動態平衡後，調整流速為3ml/min，用流動相溶解粗提物，由進樣閥進樣，紫外檢測器檢測，收集目標成分，連續製備合併流分，得楠木脂素Al. Ig,經HPLC檢測，含量98. 6%。
權利要求
1.一種楠木脂素A的提純方法，其特徵在於包括以下步驟 (1)酶解取原料紅楠乾燥樹皮，經粉碎處理，用酶溶液浸泡，水浴酶解2-5小時，並充分攪拌； (2)提取將上述酶解液過濾，取濾渣用5-6倍藥材重量的乙醇水溶液提取2-3次，合併提取液，減壓濃縮得浸膏； (3)富集將浸膏過大孔吸附樹脂柱，醇水洗脫，收集洗脫液； (4)純化將上述洗脫液減壓回收乙醇，上矽膠柱(矽膠粒度為100-200目)，乙酸乙酯-乙醇梯度洗脫，TLC跟蹤監測，收集楠木脂素A流分，減壓濃縮，冷凍乾燥得粗品； (5)高速逆流色譜分離粗品採用高速逆流色譜分離，以氯仿-甲醇-水為溶劑系統，比例為(1-5): (5-9) : (3-7)，收集目標成分，濃縮乾燥即得高純度楠木脂素A。
2.根據權利要求I所述的提純方法，其特徵在於步驟(I)中所述酶可選纖維素酶、葡聚糖酶和果膠酶中的一種或幾種，酶用量為2-3. 5%。，pH為4-4. 6，酶解溫度為45_50°C。
3.根據權利要求I所述的提純方法，其特徵在於步驟(2)中所述乙醇水溶液中乙醇的體積百分比濃度為80-90%。
4.根據權利要求I所述的提純方法，其特徵在於步驟(3)中所述大孔樹脂選自AB-8、XAD-16、XDA-8 或 HZ806 型中的一種。
5.根據權利要求I所述的提純方法，其特徵在於步驟(3)中所述醇水洗脫為3-4BV10%-20%乙醇水溶液一4-6BV80%-90%乙醇水溶液。
6.根據權利要求I所述的提純方法，其特徵在於步驟(4)中所述乙酸乙酯-乙醇體積比為 3-10:1。
全文摘要
本發明公開了一種楠木脂素A的提純方法，方法包括(1)取原料紅楠乾燥樹皮，經粉碎處理，用酶溶液浸泡，水浴酶解；(2)將酶解液過濾，取濾渣用5-10倍量的乙醇水溶液提取2-3次，合併提取液，減壓濃縮得浸膏；(3)將浸膏過大孔吸附樹脂柱，醇水混合溶液洗脫，收集洗脫液；(4)將洗脫液減壓回收乙醇，上矽膠柱，乙酸乙酯-乙醇梯度洗脫，TLC跟蹤監測，收集楠木脂素A流分，減壓濃縮，冷凍乾燥即得粗品；(5)粗品採用高速逆流色譜分離，收集目標成分，濃縮乾燥即得高純度楠木脂素A。本發明操作簡單、所得產品收率高、成本低，適合規模化生產。
文檔編號C07D317/50GK102827137SQ20121037188
公開日2012年12月19日 申請日期2012年9月29日 優先權日2012年9月29日
發明者劉東鋒, 萬冬梅 申請人:南京澤朗醫藥科技有限公司