提高多肽固相合成效率的二甲苯溶劑配方及應用的製作方法
2023-05-31 17:42:26
專利名稱：提高多肽固相合成效率的二甲苯溶劑配方及應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種提高多肽固相合成效率的二甲苯溶劑配方及應用，屬於多肽固相 合成領域。
背景技術：
多肽固相合成常用的是活化酯法接肽反應，其反應機理為親核加成-消除反應， 脫保護的氨基親核進攻胺基酸活化酯的羰基碳，形成帶電荷的四面體過渡態，隨著羥基苯 駢三氮唑的消除，形成醯胺鍵。由於過渡態帶電荷，根據溶劑化效應，極性大的溶劑有利過 渡態的穩定。溶劑的極性越大反應速度就越快，弱極性溶劑不利於此反應發生，所以在肽合 成中通常採用強極性的N，N-二甲基甲醯胺(DMF)為的溶劑，但是隨著肽鏈的增長，鏈中氨 基酸疏水性的側鏈及側鏈保護基(如絲氨酸的羥基保護基叔丁基、組氨酸咪唑基的保護基 三苯甲基)在強極性溶劑中必然會發生鏈內聚集，使肽鏈捲曲產生強大的空間阻礙效應， 導致肽鏈上已脫保護的氨基很難與已活化的胺基酸羧基接觸，兩個反應基團無法接觸就無 法發生反應。在這種情況下，有效地降低空間阻礙效應就成了多肽固相合成成功的關鍵。 解決此問題通常採用混合溶劑的方法，就是往強極性溶劑反應體系中加入一些弱極性的溶 劑，以打開鏈中聚集的疏水性基團，降低接肽反應中的空間阻礙效應。目前，最常用的混合 溶劑DMF/DCM(二氯甲烷)=3/0. 5，即便是這樣，一般情況下，前幾位胺基酸每個耗時約 1. 5小時即可完成連接反應，但是隨後的胺基酸連接反應速度成倍下降導致連接效果不佳、 產率低下，從而使合成多肽的成本成倍提高。
發明內容
本發明的目的在於提供一種提高多肽固相合成效率的二甲苯溶劑配方，旨在克服 現有合成方法時間長及產率低的不足，該配方通過降低胺基酸疏水性側鏈及保護基團鏈內 聚集造成的空間阻礙效應，縮短反應時間，使多肽合成速度加快、多肽產率增高、雜質少易 純化，從而提高合成多肽的效率，降低了合成多肽的成本。本發明的另一目的在於提供一種二甲苯溶劑在提高多肽固相合成效率中的應用。本發明的技術方案是這樣實現的提高多肽固相合成效率的二甲苯溶劑配方，其 特徵在於多肽連接反應的溶劑體系由以下溶劑按體積比組成二甲基甲醯胺DMF 1，二氯 甲烷DCM 1. 5 2. 5，二甲苯DMB0. 15 1. 0 ；根據實際情況適當調節二氯甲烷DCM和二甲 苯DMB的比例使樹脂不沉不浮地懸在溶劑中為最佳。本發明就是在多肽固相合成中，以DMB(二甲苯)為主要原料的溶劑來降低胺基酸 疏水性的側鏈及側鏈保護基鏈內聚集產生的空間阻礙效應，提高多肽合成效率。以合成抗菌肽 V13K (Ac-KWKSFLKTFKSAKKTVLHTALKAISS-amide)為例，按體積比當 溶劑二甲基甲醯胺DMF 1，二氯甲烷DCM 2，二甲苯DMB 0. 25時合成V13K耗時，除第9位的 組氨酸為8小時外，7-16位中其它的胺基酸連接反應約為3-4小時，而對應常用的二甲基甲 醯胺DMF 3，二氯甲烷DCM 0. 5混合溶劑合成V13K的7_16位胺基酸連接反應耗時均大於10小時，第9位的組氨酸耗時甚至大於20小時如表1所示。由此可見，新配方能有效地降 低阻礙反應的空間效應，大大地縮短了連接反應時間。第9位的組氨酸連接時間長是因為 組氨酸咪唑基的保護基三苯甲基體積大，空間阻礙效應大造成的，若在連接此組氨酸時改 用二甲基甲醯胺DMF 1，二氯甲烷DCM 2，二甲苯DMB 0. 5的比例時5小時即可完成反應，但 是用此比例的混合溶劑替代二甲基甲醯胺DMF 1，二氯甲烷DCM 2，二甲苯DMB 0. 25連接其 它7-16位胺基酸耗時反而有所增加。也就是說在連接其它7-16位胺基酸時二甲基甲醯胺 DMF 1，二氯甲烷DCM 2，二甲苯DMB 0. 25的混合溶劑體系就已經能有效地降低了阻礙反應 的空間效應，使肽鏈上已脫保護的氨基與已活化的胺基酸羧基能夠接觸並發生反應，而弱 極性的二甲苯的進一步增加反而降低了能夠有效接觸的兩個反應基團的反應性。本發明的積極效果是以合成V13K為例，在合成時間上比常用的DMF-DCM體系縮 短4倍；在粗產品上對比表現出產量高、雜質少，在純品產率上(25-35mg/0. lmmol)比常用 DMF-DCM體系(7-9mg/0. lmmol)高約4倍；綜合效率提高4X4 = 16倍，有效地降低了合成 多肽的成本；其有效降低了胺基酸疏水側鏈及保護基團鏈內聚集造成的的空間阻礙效應， 縮短反應時間，使多肽合成速度加快、多肽產率高、雜質少。表1溶劑發明配方與常用配方合成V13K耗時情況的比較
圖1氨基Fmoc保護基的脫保護機理
圖2胺基酸羧基的活化機理圖3活化酯法接肽反應的機理圖4帶側鏈保護基的組氨酸、絲氨酸、賴氨酸圖5發明配方(紅)與常用配方(黑)合成V13K粗產品分析色譜圖比較
具體實施例方式下面結合附圖和實施例對本發明做進一步的描述實施例1:溶劑配方二甲基甲醯胺(DMF)/ 二氯甲烷(DCM)/ 二甲苯(DMB) = 1/2/0. 25如圖1-4所示，以在抗菌肽V13K的合成中使用該配方作為接肽反應的溶劑，經檢 測，V13K的第7 16位胺基酸連接時間縮短至3-4小時，其中第9位組氨酸連接時間為8 小時，得到純品產率25-35mg/0. Immol樹脂。在相同條件下，使用傳統常用溶劑，V13K的第 7 16位胺基酸連接時間超過10小時，其中第9位組氨酸連接時間甚至超過20小時，得到 純品產率7-9mg/0. Immol樹脂。實施例和前述過程中所採用的原料列表如下 具體步驟如下脫帽試劑為六氫吡啶DMF = 1 4，體積比；所說的接肽溶劑為DMF DCM DMB = 1 2 0. 25，體積比；在接肽試劑中，HBTU的摩爾數為原料樹脂的4. 5倍，HOBt的摩爾數為原料樹脂的3. 5倍。所說的茚三酮檢測試劑為溶液A，水合茚三酮乙醇=5 100，質量體積比。溶 液B，苯酚乙醇=80 20，體積比。溶液C，0. OOlM的氰化鉀水溶液吡啶=1 49，體 積比。(1)取 125mg Rink amide MBHA 樹脂(0. 8mmol/g 樹脂，0. lmmol)，用 3ml DCM浸泡 8h，使樹脂充分溶脹，抽乾。(2)加入5ml脫帽試劑，25°C反應30分鐘，抽乾，分別用DMF、異丙醇和DCM各洗滌 三次，抽乾。(3)力口 入 0.4mmol Fmoc-胺基酸、0.45mmol HBTU、0. 35mmol HOBtUlOul DIEA (0. 742g/ml)用6. 5ml溶劑配方溶解，加入反應容器，25°C反應3-4小時。(4)抽乾，分別用DMF、異丙醇和DCM各洗滌三次，抽乾。(5)取少量的樹脂加入到1. 5ml EP管中分別加入50 μ 1 A，B，C溶液，混勻100°C 加熱5min，樹脂為透亮黃色表示反應完全。(6)重複步驟(2)-(5)直到最後一個胺基酸連接到樹脂上。(7)加入5ml脫帽試劑，25°C反應30分鐘，抽乾，分別用DMF、異丙醇和DCM各洗滌 三次，抽乾。分別用DMF、異丙醇和DCM各洗滌三次，抽乾。(8)依次用DCM，DMF, DCM,甲醇，DCM各洗滌兩次，減壓抽濾12小時。(9)加入切肽試劑(TFA/H20/TIS = 3. 6ml/0. 2ml/0. 2ml)，25°C攪拌 2 小時。減 壓抽取溶液加入200ml冷乙醚沉澱，過濾收集，用冷的無水乙醚洗滌後，加入150ml 50%乙 腈_水溶解沉澱，冷凍真空乾燥。得粗品將粗品溶於25ml 0. 1 % TFA水溶液中，過濾，濾液經反相C8柱純化，流動相A， 0. 1% TFA 水溶液；B，0. 1% TFA 乙腈溶液；梯度洗脫條件0_25min 0-25 % B, 25-275min 25-50% B ；檢測波長210nm ；洗脫液流速2ml/min。用液相色譜儀跟蹤收集所需的流出液， 樣品峰合併後凍幹，約得白色粉末狀成品35mg。實施例2 採用二甲基甲醯胺(DMF)/ 二氯甲烷(DCM)/ 二甲苯(DMB) = 1/2/0. 5的配方作為 接肽反應的溶劑，經檢測，V13K的第7 16位胺基酸連接時間縮短至4-5小時，其中第9位 組氨酸連接時間為5小時。具體步驟如下脫帽試劑為六氫吡啶DMF = 1 4，體積比；所說的接肽溶劑為DMF DCM DMB = 1 2 0.5，體積比；在接肽試劑中，HBTU 的摩爾數為原料樹脂的4. 5倍，HOBt的摩爾數為原料樹脂的3. 5倍。所說的茚三酮檢測試劑為溶液A，水合茚三酮乙醇=5 100，質量體積比。溶 液B，苯酚乙醇=80 20，體積比。溶液C，0. OOlM的氰化鉀水溶液吡啶=1 49，體 積比。
(1)取 125mg Rink amide MBHA 樹脂(0. 8mmol/g 樹脂，0. lmmol)，用 3ml DCM浸泡 8h，使樹脂充分溶脹，抽乾。(2)加入5ml脫帽試劑，25°C反應30分鐘，抽乾，分別用DMF、異丙醇和DCM各洗滌 三次，抽乾。 (3)力口 入 0.4mmol Fmoc-胺基酸、0.45mmol HBTU、0. 35mmol HOBtUlOul DIEA (0. 742g/ml)用5. 6ml溶劑配方溶解，加入反應容器，25°C反應4-5小時。(4)抽乾，分別用DMF、異丙醇和DCM各洗滌三次，抽乾。(5)取少量的樹脂加入到1. 5ml EP管中分別加入50 μ 1 A，B，C溶液，混勻100°C 加熱5min，樹脂為透亮黃色表示反應完全。(6)重複步驟(2)-(5)直到最後一個胺基酸連接到樹脂上。(7)加入5ml脫帽試劑，25°C反應30分鐘，抽乾，分別用DMF、異丙醇和DCM各洗滌 三次，抽乾。分別用DMF、異丙醇和DCM各洗滌三次，抽乾。(8)依次用DCM，DMF, DCM,甲醇，DCM各洗滌兩次，減壓抽濾12小時。(9)加入切肽試劑(TFA/H20/TIS = 3. 6ml/0. 2ml/0. 2ml)，25°C攪拌 2 小時。減 壓抽取溶液加入200ml冷乙醚沉澱，過濾收集，用冷的無水乙醚洗滌後，加入150ml 50%乙 腈_水溶解沉澱，冷凍真空乾燥。得粗品將粗品溶於25ml 0. 1 % TFA水溶液中，過濾，濾液經反相C8柱純化，流動相A， 0. 1% TFA 水溶液；B，0. 1% TFA 乙腈溶液；梯度洗脫條件0_25min 0-25 % B, 25-275min 25-50% B ；檢測波長210nm ；洗脫液流速2ml/min。用液相色譜儀跟蹤收集所需的流出液， 樣品峰合併後凍幹，約得白色粉末狀成品31mg。實施例3 採用二甲基甲醯胺(DMF)/ 二氯甲烷(DCM)/ 二甲苯(DMB) = 1/1. 5/0. 5的配方作 為接肽反應的溶劑，經檢測，V13K的第7 16位胺基酸連接時間縮短至3-5小時。具體步驟如下脫帽試劑為六氫吡啶DMF = 1 4，體積比；所說的接肽溶劑為DMF DCM DMB = 1 1.5 0. 5，體積比；在接肽試劑中， HBTU的摩爾數為原料樹脂的4. 5倍，HOBt的摩爾數為原料樹脂的3. 5倍。所說的茚三酮檢測試劑為溶液A，水合茚三酮乙醇=5 100，質量體積比。溶 液B，苯酚乙醇=80 20，體積比。溶液C，0. OOlM的氰化鉀水溶液吡啶=1 49，體 積比。(1)取 125mg Rink amide MBHA 樹脂(0. 8mmol/g 樹脂，0. lmmol)，用 3ml DCM浸泡 8h，使樹脂充分溶脹，抽乾。(2)加入5ml脫帽試劑，25°C反應30分鐘，抽乾，分別用DMF、異丙醇和DCM各洗滌 三次，抽乾。(3)力口 入 0.4mmol Fmoc-胺基酸、0.45mmol HBTU、0. 35mmol HOBtUlOul DIEA (0. 742g/ml)用4. 8ml溶劑配方溶解，加入反應容器，25°C反應4-5小時。(4)抽乾，分別用DMF、異丙醇和DCM各洗滌三次，抽乾。(5)取少量的樹脂加入到1. 5ml EP管中分別加入50 μ 1 A，B，C溶液，混勻100°C 加熱5min，樹脂為透亮黃色表示反應完全。
(6)重複步驟(2)-(5)直到最後一個胺基酸連接到樹脂上。(7)加入5ml脫帽試劑，25°C反應30分鐘，抽乾，分別用DMF、異丙醇和DCM各洗滌 三次，抽乾。分別用DMF、異丙醇和DCM各洗滌三次，抽乾。(8)依次用DCM，DMF, DCM,甲醇，DCM各洗滌兩次，減壓抽濾12小時。(9)加入切肽試劑(TFA/H20/TIS = 3. 6ml/0. 2ml/0. 2ml)，25°C攪拌 2 小時。減 壓抽取溶液加入200ml冷乙醚沉澱，過濾收集，用冷的無水乙醚洗滌後，加入150ml 50% 乙腈_水溶解沉澱，冷凍真空乾燥。得粗品將粗品溶於25ml 0. 1 % TFA水溶液中，過濾，濾 液經反相C8柱純化，流動相A，0. 1% TFA水溶液；B，0. 1% TFA乙腈溶液；梯度洗脫條件 0-25min 0-25% B，25_275min 25-50% B ；檢測波長2IOnm ；洗脫液流速:2ml/min。用液相 色譜儀跟蹤收集所需的流出液，樣品峰合併後凍幹，約得白色粉末狀成品28mg。實施例4 採用二甲基甲醯胺(DMF)/ 二氯甲烷(DCM)/ 二甲苯(DMB) = 1/2. 5/1. 0的配方作 為接肽反應的溶劑，經檢測，V13K的第7 16位胺基酸連接時間縮短至4-6小時。具體步驟如下脫帽試劑為六氫吡啶DMF = 1 4，體積比；所說的接肽溶劑為DMF DCM DMB = 1 2. 5 1. 0，體積比；在接肽試劑中， HBTU的摩爾數為原料樹脂的4. 5倍，HOBt的摩爾數為原料樹脂的3. 5倍。所說的茚三酮檢測試劑為溶液A，水合茚三酮乙醇=5 100，質量體積比。溶 液B，苯酚乙醇=80 20，體積比。溶液C，0. OOlM的氰化鉀水溶液吡啶=1 49，體 積比。(1)取 125mg Rink amide MBHA 樹脂(0. 8mmol/g 樹脂，0. lmmol)，用 3ml DCM浸泡 8h，使樹脂充分溶脹，抽乾。(2)加入5ml脫帽試劑，25°C反應30分鐘，抽乾，分別用DMF、異丙醇和DCM各洗滌 三次，抽乾。(3)力口 入 0.4mmol Fmoc-胺基酸、0.45mmol HBTU、0. 35mmol HOBtUlOul DIEA (0. 742g/ml)用6. 6ml溶劑配方溶解，加入反應容器，25°C反應4-5小時。(4)抽乾，分別用DMF、異丙醇和DCM各洗滌三次，抽乾。(5)取少量的樹脂加入到1. 5ml EP管中分別加入50 μ 1 A，B，C溶液，混勻100°C 加熱5min，樹脂為透亮黃色表示反應完全。(6)重複步驟(2)-(5)直到最後一個胺基酸連接到樹脂上。(7)加入5ml脫帽試劑，25°C反應30分鐘，抽乾，分別用DMF、異丙醇和DCM各洗滌 三次，抽乾。分別用DMF、異丙醇和DCM各洗滌三次，抽乾。(8)依次用DCM，DMF, DCM,甲醇，DCM各洗滌兩次，減壓抽濾12小時。(9)加入切肽 試劑(TFA/H20/TIS = 3. 6ml/0. 2ml/0. 2ml)，25°C攪拌 2 小時。減 壓抽取溶液加入200ml冷乙醚沉澱，過濾收集，用冷的無水乙醚洗滌後，加入150ml 50% 乙腈_水溶解沉澱，冷凍真空乾燥。得粗品將粗品溶於25ml 0. 1 % TFA水溶液中，過濾，濾 液經反相C8柱純化，流動相A，0. 1% TFA水溶液；B，0. 1% TFA乙腈溶液；梯度洗脫條件 0-25min 0-25% B，25_275min 25-50% B ；檢測波長:210nm ；洗脫液流速:2ml/min。用液相 色譜儀跟蹤收集所需的流出液，樣品峰合併後凍幹，約得白色粉末狀成品23mg。
權利要求
提高多肽固相合成效率的二甲苯溶劑配方，其特徵在於由以下原料按體積比組成二甲基甲醯胺DMF/二氯甲烷DCM/二甲苯DMB＝1/1.5～2.5/0.15～1.0。
2.根據權利要求1所述的提高多肽固相合成效率的二甲苯溶劑配方，其特徵在於所述 的溶劑配方按體積比為二甲基甲醯胺DMF/ 二氯甲烷DCM/ 二甲苯DMB = 1/2/0. 25。
3.根據權利要求1所述的提高多肽固相合成效率的二甲苯溶劑配方，其特徵在於所述 的溶劑配方按體積比為二甲基甲醯胺DMF/ 二氯甲烷DCM/ 二甲苯DMB = 1/2/0. 5。
4.一種二甲苯溶劑在提高多肽固相合成效率中的應用。
全文摘要
本發明涉及提高多肽固相合成效率的二甲苯溶劑配方及應用，其特徵在於二甲苯溶劑配方由以下原料按體積比組成二甲基甲醯胺DMF/二氯甲烷DCM/二甲苯DMB＝1/1.5～2.5/0.15～1.0。其有效地降低了合成多肽的成本；其降低了胺基酸疏水側鏈及保護基團的空間阻礙效應，縮短反應時間，使多肽合成速度加快，多肽產率高，雜質少。
文檔編號C07K1/06GK101880311SQ201010185129
公開日2010年11月10日 申請日期2010年5月28日 優先權日2010年5月28日
發明者毛世忠, 潘玲, 王笑非, 陳育新, 黃宜兵 申請人:吉林大學