人源化抗人骨橋蛋白抗體的製作方法

2023-06-01 03:37:36

專利名稱：：人源化抗人骨橋蛋白抗體的製作方法
技術領域：
：本發明涉及具有優異的活性和穩定性的人源化抗人骨橋蛋白抗體、以及使用該抗體的疾病的治療和診斷方法。
背景技術：
：骨橋蛋白(以下稱為"OPN")是在骨中較多含有的酸性釣結合性糖蛋白，已知在人體中，由於mRNA剪切的不同，可以產生骨橋蛋白-a(以下稱為"OPN-a，，)、骨橋蛋白-b(以下稱為"OPN-b，，)、骨橋蛋白-c(以下稱為"OPN-c")的至少三種同工型(非專利文獻1)。其中，OPN-a的前體具有後述序列表的SEQIDN0.23所示的胺基酸序列，通過分泌，信號肽被切割，形成I17-N314成熟體OPN-a。另外，成熟體OPN是通過生物體內的凝血酶，在第168號(為OPN-a時)的精氨酸殘基的C末端一側被切割，形成N末端片段和C末端片段兩段。上述OPN在多種生理學和病理學方面擔負著重要的功能，例如具有細胞粘附、細胞遊走、腫瘤形成、免疫應答和抑制以補體為介質的細胞溶解等功能。該多種功能是以多種細胞表面受體為介質。OPN在內部具有RGD序歹'j(例如OPN-a中的第159~161號殘基)，識別該RGD序列的aV|33、aVpl和aV|35等整聯蛋白是OPN的主要受體，其中，aV|33、aVpi和aV(35整聯蛋白在血管的平滑肌細胞中經由細胞粘附、特別是aV(33參與巨噬細胞、淋巴細胞、內皮細胞和平滑肌細胞等的遊走。目前的研究也表明OPN經由SVVYGLR序列(SEQIDNO.10)與a鄧l、a鄰l和a4p7整聯蛋白結合，但發現了其中a鄰l與未被凝血酶切割的OPN(非切割型OPN)和被凝血酶切割的N末端片段(切割型OPN)兩者結合，而a鄧l只與凝血酶切割型OPN結合這樣的差異(非專利文獻2~4)。該a9和a4、以及|31和卩7的整聯亞單元相互之間的胺基酸序列間的類似性高。a4(31和a鄰7整聯蛋白主要在淋巴細胞和單核細胞中發現，而在嗜中性粒細胞中只有極少表達。另一方面，a9(31在嗜中性粒細胞中選擇性高表達，經由VCAM-1或腱生蛋白-C(Tenascin-C)等在嗜中性粒細胞遊走中擔負著必須的功能。另外，a鄧l在肌細胞或上皮細胞、肝細胞等中也廣泛表達。這樣，整聯蛋白亞單元a4和a9的細胞質結構域分別經由有微妙不同的細胞內信號轉導途徑，互相協同地促進白細胞向炎症部位的遊走和凝集，增強其浸潤活性，由此參與各種炎症反應。這樣，各種種類的整聯蛋白均促進白細胞的遊走，參與炎症反應，因此抑制這些整聯蛋白活性的藥物被認為潛在性地具有作為抗炎症藥物的可能性。例如，整聯蛋白aVp3在破骨細胞、血管內皮細胞和平滑肌細胞等中表達，通過抑制aVp3整聯蛋白與其各種結合配體的結合，例如在關節中期待發揮抑制關節破壞的作用，因此可以實際進行抗aV(33抗體的開發。但是，屬於整聯蛋白家族的受體在廣泛的組織內普遍表達，在維持生命活動中擔負著必須的功能，因此，在類風溼性關節炎或變形性關節炎的治療中使用整聯蛋白的抗體，則在其它部位也有發生同樣的抑制的可能性，可能產生副作用。由上述觀點考慮，目前為止，已經明確了類風溼性關節炎、變形性關節病等的病因，嘗試提供更優異的治療方法。例如WO02/081522(專利文獻l)中發現，風溼病患者和變形性關節病患者，關節腔液的OPN濃度顯示高值，並且在風溼病患者中，凝血酶切割型N末端片段佔全部OPN的比例增加，確認了OPN與這些疾病的發病有很深相關性。專利文獻l中，對於用凝血酶切割OPN得到的N末端片段和C末端片段，製備將各片段分別區別識別的抗體，使用它們進行試驗，發現在類風溼性關節炎患者中，特別是由凝血酶切割的N末端片段在關節腔內顯示高濃度。該N末端片段中均存在人型整聯蛋白可識別的RGD序列和SVVYGLR序列(SEQIDNO.IO)，確認同時阻斷這兩者序列的抗體可廣泛抑制OPN與整聯蛋白的結合，對於類風溼性關節炎或變形性關節炎等治療有效。具體來說，專利文獻l中製備了抑制人OPN的RGD序列與整聯蛋白結合、以及人OPN的SVVYGLR序列(SEQIDNO.10)與整聯蛋白結合的抗體，通過細胞粘附和細胞遊走等的試驗確認了其效果。並獲得了小鼠OPN的該內部序列所對應的合成肽的抗體，使用小鼠的關節炎病態模型，確認了上述抗體作為治療藥的效果。即，小鼠OPN與人OPN在胺基酸序列上、在相同位置上具有可被小鼠的整聯蛋白識別的RGD序列和SLAYGLR序列(SEQIDN0.12),因此，取得了M5抗體作為同時阻斷這些序列的抗體。確認了該M5抗體與小鼠OPN及其凝血酶消化產物的結合被含有RGD序列的GRGDSP肽抑制，該M5抗體抑制由TNF-a活化的、來自小鼠脾臟的單核細胞的遊走。在小鼠的顱骨器官培養系統中研究該M5抗體，觀察到抑制骨破壞的作用。並且，在小鼠膠原關節炎模型中嘗試給予上述抗體，確認顯示明顯的治療效果(專利文獻1和非專利文獻5)。這些結果強烈顯示同時阻斷RGD序列與人型整聯蛋白的結合、SVVYGLR序歹,j(SEQIDNO.10)與人型整聯蛋白的結合的抗體可抑制OPN與整聯蛋白的結合，對於類風溼性關節炎等的治療有效，並且，不僅對於幼年型類風溼性關節炎或慢性風溼病等風溼病，也期待對於銀屑病性關節炎或銀屑病的治療有效。器官移植後的慢性排斥的特徵在於發生血管或支氣管的阻塞性病變，從其組織學的研究來看，T細胞和巨噬細胞的活化引發細胞因子和生長因子的生成、血管內皮細胞障礙，並且血管平滑肌增殖引發纖維化等，因此使血管阻塞進展(非專利文獻6~8)。已有報導稱，這些巨噬細胞的活化或血管平滑肌的纖維化中，OPN作為必須的蛋白而發揮功能(非專利文獻9)，OPN抑制抗體通過抑制單核細胞或嗜中性粒細胞的遊走，可以抑制向上述纖維化發展的過程。因此，期待抑制器官移植後的慢性排斥反應，有助於器官的存活，也期待對於全身性自身免疫疾病、紅斑狼瘡、葡萄膜炎、白塞氏病、多發性肌炎、繫膜增殖性腎小球腎炎、結節病等自身免疫疾病的治療的效果。還確認了在各種癌症中OPN的表達量增加，OPN促進了癌症的進展和轉移(非專利文獻10~12)，通過抗OPN抗體癌細胞的增殖和轉移得到抑制(專利文獻3、非專利文獻13)。因此，還期待抗OPN抗體對於各種癌症的治療發揮作用。WO03/027151(專利文獻2)中公開了具有專利文獻1所述的小鼠抗人骨橋蛋白抗體2K1可變區和人抗體恆定區的嵌合抗人骨橋^"白抗體，以及具有2K1抗體的互補決定區和人抗體構架區以及恆定區的人源化抗人骨橋蛋白抗體。時至今日，作為癌症治療用抗體(例如利妥昔單抗、曲妥單抗、貝伐單抗)、風溼病治療用抗體(例如英夫利昔單抗、阿達木單抗)、用於抑制移植片排斥的治療用抗體(例如莫羅單抗、巴利昔單抗)等^f艮多治療用單克隆抗體已經上市。今後，單克隆抗體製劑由於其特異性和安全性高等的根本性特徵，特別是以低分子治療藥的開發較為困難的各種疾病作為目標的研究開發將會得到加速。另一方面，上述抗體藥物的開發中，最大的問題是抗體的生產性。目前市售的單克隆抗體的臨床給藥量大約為數mg/kg水平，因此需要相當大的製備成本。為此，在顯示優異的活性的抗體、顯示相同活性的抗體中選擇表達量高、作為蛋白質的穩定性高的抗體，這在抗體藥物應用化中是極重要的因素。專利文獻1:國際公開第WO02/081522小冊子專利文獻2:國際公開第WO03/027151小冊子7專利文獻3:國際公開第WO06/043954小冊子非專利文獻1:Y.Saitoh等人.，(1995):LaboratoryInvestigation,72,55~63非專利文獻2:Y.Yokosaki等人"(1999):TheJournalofBiologicalChemistry274,36328~36334非專利文獻3:P.M.Green等人.，(2001):FEBSLetters503，75~79非專利文獻4:S.T.Barry等人.，(2000):ExperimentalCellResearch258，342~351非專利文獻5:Yamamoto等人.，(2003):TheJournalofClinicalInvestigation,112,181-188非專利文獻6:P.Freese等人"(2001):Nephrology,dialysis,transplantation,16，2401~2406非專利文獻7:j.r.Waller等人.，(2001):BritishJournalofSurgery,88,1429~1441非專利文獻8:S.R.Lehtonen等人.，(2001):Transplantation,72，1138-1144非專利文獻9:A.O，Regan等人.，(2000):InternationalJournalofExperimentalPathology,81,373~390非專利文獻io:G.F.Weber,(2001):BiochimicaetBiophysicaActa,1552,61~85非專利文獻ii:h.Rangaswami等人.，(2006):TRENDSinCellBiology16，79~87非專利文獻12:S.S.Forootan等人"(2006):Int.J.Cancer:118，2255~2261非專利文獻13:Z.Hu等人.，(2005):Clin.CancerRes.114646~4652
發明內容發明所要解決的課題本發明針對上述狀況而設，要解決的課題在於提供比以往的抗人骨橋蛋白抗體的活性(抗原結合活性、白細胞遊走抑制活性等)和/或穩定性(對熱、低pH條件和改性劑的耐性等)優異的人源化抗人骨橋蛋白抗體。本發明人等為解決上述課題進行了深入的研究，結果，成功地製備了具有上述特性的人源化抗骨橋蛋白抗體。解決課題的方法即，本發明具有以下特徵。(1)人源化抗人骨橋蛋白抗體，該抗體含有由SEQIDNO.l所示胺基酸序列組成的重鏈可變區、和由SEQIDN0.3所示胺基酸序列組成的輕鏈可變區。(2)上述(l)所述的人源化抗人骨橋蛋白抗體，其中，上述抗體的重鏈恆定區是人Igyl。(3)上述(l)所述的人源化抗人骨橋蛋白抗體，其中，上述抗體的輕鏈恆定區是人IgK。(4)上述(l)所述的人源化抗人骨橋蛋白抗體，其中，上述抗體的重鏈恆定區為人Igyl，上述抗體的輕鏈恆定區為人Ig/c。(5)人源化抗人骨橋蛋白抗體，該抗體含有由SEQIDNO.25所示胺基酸序列組成的重《連、和由SEQIDNO.27所示胺基酸序列組成的輕鏈。(6)多核苷酸，該多核苷酸含有編碼上述(l)所述人源化抗人骨橋蛋白抗體的重鏈可變區的序列。(7)多核苷酸，該多核苷酸含有編碼上述(l)所述人源化抗人骨橋蛋白抗體的輕鏈可變區的序列。(8)表達載體，該表達載體含有上述(6)和/或(7)所述多核苷酸。(9)宿主細胞，該宿主細胞中導入了上述(8)所述的表達載體。(10)生產人源化抗人骨橋蛋白抗體的方法，該方法包含培養上述(9)所述的宿主細胞，使該細胞表達人源化抗人骨橋蛋白抗體的步驟。(11)自身免疫疾病、風溼病、類風溼性關節炎或變形性關節病的治療藥，該藥物含有上述(l)~(5)中任一項所述的人源化抗人骨橋蛋白抗體。(12)預防或治療自身免疫疾病、風溼病、類風溼性關節炎或變形性關節病的方法，該方法包含給予治療有效量的上述(1)(5)中任一項所述的人源化抗人骨橋蛋白抗體的步驟。(13)上述(1)(5)中任一項所述的人源化抗人骨橋蛋白抗體在製備用於預防或治療自身免疫疾病、風溼病、類風溼性關節炎或變形性關節病的藥物中的應用。發明效果本發明可提供比以往的抗人骨橋蛋白抗體的活性(抗原結合活性、白細胞遊走抑制活性等)和/或穩定性(對熱、低pH條件和改性劑的耐性等)優異的人源化抗人骨橋蛋白抗體。具有上述特徵的本發明的抗體可用於以自身免疫疾病、風溼病、類風溼性關節炎、變形性關節病為代表的各種炎症性疾病的預防或治療。附圖簡述圖1表示含有插入到載體中的R2K1-VH1.7編碼區的DNA石鹹基序列(上一行SEQIDN0.15)和胺基酸序列(下一行SEQIDNO.16)(下劃線部分是用於分泌表達的前導序列)。圖2表示含有插入到載體中的R2K1-VH1.8編碼區的DNA的鹼基序列(上一行SEQIDN0.17)和胺基酸序列(下一行SEQIDNO.18)(下劃線部分是用於分泌表達的前導序列)。圖3表示含有插入到載體中的R2K1-VL1.7編碼區的DNA的鹼基序列(上一行SEQIDNO,19)和胺基酸序列(下一行SEQIDNO.20)(下劃線部分是用於分泌表達的前導序列)。圖4表示含有插入到載體中的R2K1-VL1.8編碼區的DNA的鹼基序列(上一行SEQIDN0.21)和胺基酸序列(下一行SEQIDNO.22)(下劃線部分是用於分泌表達的前導序列)。圖5表示通過ELISA法研究嵌合2K1抗體和人源化2K1抗體與10hOPN5肽的結合性的結果。圖6表示通過ELISA法研究在70。C下加熱處理的嵌合2K1抗體和人源化2K1抗體與hOPN5肽的結合性的結果。以未加熱處理時的結合性為100%,表示其比例。圖7表示通過ELISA法研究用pH5緩衝液處理的嵌合2K1抗體和人源化2K1抗體與hOPN5肽的結合性的結果。以未經pH5緩衝液處理時的結合性為100，表示其比例。圖8表示對用含各種濃度的鹽酸胍緩衝液處理的嵌合2K1抗體和人源化2K1抗體的焚光光譜中峰波長製圖的結果。圖9表示通過CD測定用各pH緩衝液處理的嵌合2K1抗體和人源化2K1抗體中隨機結構的含量的結果。圖10是表示使用超高靈敏度差示掃描量熱儀研究嵌合2K1抗體和人源化2K1抗體的熱穩定性的結果圖。虛線箭頭和實線箭頭分別表示嵌合2K1抗體和R2Klvl.7抗體的Tm。圖11表示R2Klvl.7和R2KlvO對人OPN的細胞粘附抑制效果。圖12表示R2K1vl.7對於猴膠原誘導關節炎的關節腫脹的效果。數據分為對照組、25mg/kg組和50mg/kg組，分別表示8個動物、7個動物和5個動物的平均士SE。*p<0.05,**p<0.01:通過Dunnet多重比較;j全驗確認與對照組明顯不同。圖13表示通過HPLC分析純化R2Klvl.7-scFv的結果。圖14表示通過ELISA法研究純化R2Klvl.7-scFv與hOPN5肽的結合性的結果。圖15表示完全分子型R2Klvl.7抗體、R2Klvl.7抗體的F(ab')2和純化F(ab')2-PEG的SDS-PAGE結果。圖16表示通過BIAcore研究R2Klvl.7的F(ab')-PEG與hOPN5肽的結合性的結果。實施發明的最佳方式ii以下詳述本發明。本發明人等為了克服與上述以往的抗人骨橋蛋白抗體相關的課題而進行了深入的研究，結果成功的獲得了與WO03/027151(專利文獻2)所述的嵌合2K1抗體和人源化2K1抗體相比、具有優異的活性和/或穩定性的人源化抗人骨橋蛋白抗體。抗體分子的基本結構為所有類別(classes)所共有，由具有分子量5萬~7萬的重鏈和具有2-3萬的輕鏈構成。重鏈通常由含有約440個胺基酸的多肽鏈組成，每類重鏈具有特徵性結構，對應於IgG、IgM、IgA、IgD和IgE，稱為y、〃、a、5和e鏈。並且，IgG存在IgGl、IgG2、IgG3和IgG4，分別稱為yl、y2、y3和y4。輕鏈通常由含有約220個胺基酸的多肽鏈組成，已知有L型和K型兩種，分別稱為x和k鏈。抗體分子的基本結構中的肽構成是兩條相同的重鏈和兩條相同的輕鏈通過二硫鍵(S-S鍵)和非共價鍵結合，且分子量為15萬-19萬。兩種輕鏈可以與任何重鏈形成對。各抗體總是由相同的兩條輕鏈和相同的兩條重鏈形成。鏈內S-S鍵是在重鏈中有4個—s鏈中有5個)，輕鏈中有2個，每100~IIO個胺基酸殘基形成一個環，該立體結構在各環之間類似，稱為結構單元或結構域。對於重鏈和輕鏈兩者，其位於N末端的結構域儘管是同種動物的相同類(亞類)的指標，但其胺基酸序列不恆定，該結構域被稱為可變區(V區，可變區)(各結構域分別表示為Vh和Vl)。由此向C末端一側的胺基酸序列是在每類或亞類中大致恆定的、被稱為恆定區(C區，恆定區)(各結構域分別表示為CH1、Ch2、Ch3和CL)。抗體的抗原決定部位由Vh和Vt構成，結合特異性由該部位的胺基酸序列確定。另一方面，與補體或各種細胞結合的生物學活性反映了各類Ig之間C區的結構差異。輕鏈和重鏈可變區的可變性大致限於在兩種鏈中均存在的三個小的超可變區，將這些區稱為CDR(互補決定區)。可變區的其餘部分被稱為構架區，該區是比較恆定的。通常，只有各可變區的互補決定區的5~IO個胺基酸形成抗原結合部位。本說明書中，將與抗原反應的可變區具有來自小鼠抗體(也稱為供體異源抗體)的可變區、恆定區具有來自人抗體的恆定區的抗體稱為嵌合抗體，將識別骨橋蛋白及其片段的嵌合抗體稱為嵌合抗骨橋蛋白抗體。將除抗原特異性的非人哺乳動物(例如小鼠)抗體分子的互補決定區(抗原結合部位)以外全部置換為人抗體的胺基酸，所得重組抗體稱為人源化抗體。人源化抗體也包含如本發明抗體的、在構架區附加有胺基酸修飾(置換、插入、缺失、附力O)而得到的抗體。通常認為在人源化抗體的製備中，當只是將互補決定區的胺基酸序列嫁接到作為模板的人抗體構架區時，很多情況下抗原結合活性比原始小鼠抗體降低。已經確認上述人源化2K1抗體雖然具有與OPN肽的結合性，但是與OPN的細胞粘附抑制活性極低，因此不適合作為抗體藥物使用(後述實施例9)。本發明人等為了改善上述人源化抗體的活性降低、且為了獲得適合作為抗體藥物使用的具有更優異的穩定性的人源化抗體，進行了深入的研究，結果發現，含有由SEQIDNO.l所示胺基酸序列組成的重鏈可變區、和由SEQIDNO.3所示胺基酸序列組成的輕鏈可變區的人源化抗人骨橋蛋白抗體與以往的嵌合和人源化抗人骨橋蛋白抗體比較，具有顯著改善的活性和/或各種穩定性指標方面具有優異的穩定性。上述本發明的人源化抗人骨橋蛋白抗體是在作為模板的人抗體的重鏈和輕鏈的構架區對幾種胺基酸進行修飾而製備的。與只嫁接互補決定區而製備的以往的人源化抗人骨橋蛋白抗體相比，構架區的序列不同(專利文獻2)。本發明的人源化抗人骨橋蛋白抗體可根據本說明書中所公開的其重鏈可變區和輕鏈可變區的序列信息，使用該領域所公知的方法，由本領域技術人員容易地製備。具體來說，可製備具有編碼本發明的抗體的重鏈可變區胺基酸(SEQIDNO.l)的鹼基序列的重鏈可變區基因片段、以及具有編碼本發明的抗體的輕鏈可變區胺基酸(SEQIDN0.3)的鹼基序列的輕鏈可變區基因片段。然後，將該可變區基因與人抗體的適當類別(class)的恆定區基因連接，來製備人源化抗體基因。接著，將該人源化抗體基因與適當的表達載體連接，導入到培養細胞中。最後，培養該培養細胞，由此可從培養上清中獲得人源化抗體。編碼上述本發明的抗體的重鏈或輕鏈可變區胺基酸(SEQIDNO.l和SEQIDN0.3)的各可變區基因片段例如可按照WO03/027151所述方法，如下製備製備分別編碼該文獻公開的人源化2K1抗體的重鏈可變區和輕鏈可變區的基因片段，將突變導入到編碼人源化2K1抗體構架區的該基因片段的規定位點。為了將突變導入構架區規定位點可以採用位點定向i秀變法(CurrentProtocolsinMolecularBiologyedit.Ausubel等人.(1987)Publish.JhonWiley&SonsSection8.1~8.5)等本領域所公知的各種方法。或者本發明的抗體的重鏈和輕鏈可變區的基因片段也可以基於根據該重鏈和輕鏈可變區的胺基酸序列(SEQIDNO.l和SEQIDN0.3)而設計的鹼基序列、或SEQIDNO.5和SEQIDN0.7所示的本發明的抗體的重鏈和輕鏈可變區的鹼基序列，利用本領域所公知的基因合成方法進行合成。上述基因合成方法可以採用WO90/07861所述抗體基因的合成方法等本領域所公知的各種方法。接著，將上述可變區基因片段與人抗體的恆定區基因連接，來製備人源化抗體基因。儘管所使用的人抗體的恆定區可以選擇任何亞類的恆定區，但重鏈恆定區可優選使用人Igyl,輕鏈恆定區可優選使用人IgK。製備該人源化抗體基因後，對於人源化抗體基因向表達載體的導入、表達載體向培養細胞的導入、培養細胞的培養、抗體的純化等，可採用本領域所公知的各種方法，或者參照WO02/081522或WO03/027151所述的嵌合抗人骨橋蛋白抗體或人源化抗人骨橋蛋白抗體的製備方法進行。與上述得到的人源化抗體基因連接的表達載體可以使用國際公開公報WO94/20632所述的AG-yl或AG-k等表達載體，但對表達載體沒有特別限定，只要可表達人源化抗體基因即可。表達載體如果利用AG-yl或AG-k等已經具有人Ig恆定區基因的載體，則只是將人源化抗體可變區基因插入其中，即可形成具有人源化抗體基因的表達載體，因此優選。上述表達載體例如可通過磷酸4丐法等導入到培養細胞中。要導入表達載體的培養細胞例如可使用CHO-DG44細胞等的培養細胞，可以按照常規方法進行培養。上述培養後，在培養上清中累積的抗體例如可通過使用蛋白A柱的各種色譜來純化。上述得到的人源化抗人骨橋蛋白抗體的抗原活性例如可通過後述實施例所述的使用骨橋蛋白肽等的ELISA、或BIACore(BIACore公司)等測定。人源化抗人骨橋蛋白抗體的白細胞遊走抑制活性例如如後述實施例所述，可以通過在受試抗體和OPN或凝血酶切割型OPN的存在下培養人末梢血單核細胞來測定。本發明的人源化抗人骨橋蛋白抗體具有抑制由細胞因子(例如TNF-a)活化的人末梢血單核細胞向凝血酶切割型OPN遊走的生物學活性。接著，針對各種穩定性指標，對上述製備的人源化抗人骨橋蛋白抗體進行試驗。本發明的人源化抗人骨橋蛋白抗體顯示以下的穩定性指標(A)D)):A)熱穩定性表現為與在PBS中、在70。C下加熱處理2小時後時的90%以上。嵌合抗體相比，中點轉變溫度(midpointtransitiontemperature,Tm)至少高5°C。嵌合抗體相比，具有至少可以耐受高0.5M濃度的鹽酸胍的耐性。嵌合抗體相比，具有至少可以耐受低0.3的pH的耐性。15這裡，上述指標A)和B)均為熱穩定性的指標，這些指標越好的抗體，其在長期保存穩定性和劑型方面越具有優勢。即，抗體製劑由於是蛋白質，因此在保存穩定性方面有較多問題，而凍幹製劑(在使用時必須溶解，因此在醫療現場、在便利性方面存在問題，特別是蛋白製劑溶解大多需要30秒以上，大多成為醫療現場較大的負擔)，如果是具有良好的溫度穩定性的抗體，則可以在溶液狀態下可冷藏保持2年以上的長期穩定性。實際上，作為本發明的人源化抗人骨橋蛋白抗體的後述實施例所述的R2Klvl.7在室溫(25。C)下可確保一年左右的穩定性。如果可以形成溶液製劑，則可以製成預灌封注射器等便利性更高的製劑。滿足上述指標的、溫度穩定性高的抗體其製劑化變化形式廣，為實現醫療需求更高的製劑增添了更多的選擇可能性。上述指標C)是關於鹽耐性的指標，具有所述鹽耐性的抗體可以在形成藥物製劑時進行更為有利的處方研究。特別是在預灌封注射器中，在設計為100~200^g/mL的高濃度的蛋白製劑方面大多使用高的鹽濃度，因此是有用的。上述指標D)是關於pH耐性的指標，具有上述pH耐性的抗體在抗體在抗體的製備純化過程的病毒滅活步驟中，可以以更低的pH進行處理，因此是有用的。為此，與通常的抗體比較，即使具有低0.3左右的低pH耐性，也會成為很大的優勢。指標A)的試驗方法如下。首先，將受試人源化抗人骨橋蛋白抗體在PBS中稀釋(優選50〃g/mL),並在70。C下加熱處理2小時。然後將該稀釋液恢復至室溫，例如通過Kon等人的ELISA方法(JoumalofCellularBiology,88:420~432(2002))測定該抗體與含有SWYGLR序列(SEQIDNO.10)的肽的結合活性。該熱處理的抗體的結合活性與對未熱處理的相同抗體測定的結合活性進行比較。本發明的人源化抗人骨橋蛋白抗體，在上述加熱處理時，顯示與含有SVVYGLR序列(SEQIDNO.10)的肽的結合活性為未進行加熱處理時的90%以上的結合活性。優選本指標試驗中使用的含有SVVYGLR序列(SEQIDNO.10)的16肽是具有CVDTYDGRGDSVVYGLRS序列(SEQIDN0.13)的骨橋蛋白肽。指標B)的試驗方法如下。首先，將受試人源化抗人骨橋蛋白抗體mM檸檬酸緩衝液+120mMNaCl(pH6.0))進行調節，通過差示掃描量熱儀(優選MicroCal公司的VPcapillaryDSCplatform)可評價對加熱的穩定性。表示本發明的人源化抗人骨橋蛋白抗體變性溫度的中點轉變溫度(Tm)與C2K1比較，至少高5。C。指標C)的試驗方法如下。首先，將受試人源化抗人骨橋蛋白抗體和上述嵌合2K1抗體(C2K1)溶解於含有0~5M各濃度鹽酸胍的緩衝液(優選20mM磷酸鈉+120mMNaCl溶液(pH7.0)),將溶液調整為適當的濃度(優選50,g/mL)。接著，將各溶液樣品在l(TC下靜置過夜，然後測定各樣品的螢光光語。具體來說，在波長320nm370m的範圍內對通過280nm的激發光使色氨酸產生的螢光進行掃描。峰波長由於鹽酸胍導致的抗體蛋白立體結構的鬆散而發生位移。對受試抗體和嵌合抗體分別測定使峰波長發生位移的鹽酸胍濃度。對於本發明的人源化抗人骨橋蛋白抗體，上述使峰波長發生位移的鹽酸胍濃度與C2K1比較，至少約高0.5M濃度。指標D)的試驗方法如下。首先，將受試人源化抗人骨橋蛋白抗體和上述嵌合2K1抗體(C2K1)用適當的緩衝液(優選20mM檸檬酸鈉緩衝液+120mMNaCl(pH6.0))調節(優選2mg/mL)，向其中加入酸性溶液(優選0.1NHC1)和水，製備規定濃度(lmg/mL)的各低pH的樣品。將該樣品在室溫下處理1小時，然後測定圓二色性(CD)光譜。在波長205nm~260nm的範圍內測定CD光譜，根據Yang等人的CD光譜分析法(MethodsinEnzymology，130,208~269(1986)),對各抗體的各pH處理樣品測定隨機結構的含有率。對於本發明的人源化抗人骨橋蛋白抗體，隨機結構的含有率開始升高的pH比C2K1至少低約0.3。本發明人等以WO03/027151所述人源化抗體為基礎，將位點定向誘變等產生的構架區基因的修飾、與使用上述A)~D)的穩定性指標的穩定性試驗組合，進行了深入的研究，結果，通過使人抗體支架部分(FRl-4)為SEQIDNO.l所示的胺基酸序歹'J(胺基酸編號分別為1~30、36~49、67~98和106~116)以及SEQIDN0.3所示的氨基斷列(胺基酸編號分別為1~23、40~54、62-93和103-113),首次成功地獲得了比以往的抗人骨橋蛋白抗體具有優異的活性(抗原結合活性、白細胞遊走抑制活性等)和/或穩定性(對熱、低pH條件、變性劑的耐性等)的人源化抗人骨橋蛋白抗體。對本發明的人源化抗人骨橋蛋白抗體的上述抗原結合活性、白細胞遊走抑制活性和各種穩定性指標進行試驗，結果發現，具有該活性，且顯示該指標A)D)的所有的特性。含有由SEQIDNO.l所示胺基酸序列組成的重鏈可變區、以及由SEQIDN0.3所示胺基酸序列組成的輕鏈可變區的本發明的人源化抗人骨橋蛋白抗體可如下容易地獲得使用本領域中公知的方法，合成編碼SEQIDNO.l所示胺基酸序列的DNA、和編碼SEQIDNO.3所示胺基酸序列的DNA，將它們與適當類別的人抗體恆定區基因、優選重鏈為人Ig丫l恆定區基因、輕鏈為人IgK恆定區基因連接，構建人源化抗體基因，採用本領域中公知的各種方法或WO02/081522或WO03/027151所述方法等，將該人源化抗體基因導入到表達載體中，將該表達載體導入培養細胞中，培養該培養細胞，由所得培養物中純化抗體。將SEQIDNO.l所示重鏈可變區基因和人Igyl重鏈恆定區基因連接得到的本發明的優選的人源化抗體重鏈基因例如有含有編碼SEQIDN0.25所示氨基斷列的鹼基序列的基因，更優選含有SEQIDNO.24所示的鹼基序列的基因。將SEQIDNO.3所示的輕鏈可變區基因與人IgK輕鏈恆定區基因連接得到的本發明的優選的人源化抗體輕鏈基因例如有含有編碼SEQIDNO.27所示胺基酸序列的石鹹基序列的基因，更優選含有SEQIDNO.26所示石威基序列的基因。由含有SEQIDNO.24所示鹼基序列的重鏈基因、和含有SEQIDNO.26所示18鹼基序列的輕鏈基因所編碼的本發明的人源化抗人骨橋蛋白抗體例如有後述實施例所示的R2Klvl.7。或者，含有由SEQIDNO.l所示胺基酸序列組成的重鏈可變區、和由SEQIDN0.3所示胺基酸序列組成的輕鏈可變區的本發明的人源化抗骨橋蛋白抗體還可以以編碼上述SEQIDNO.1所示胺基酸序列的DNA和人抗體重鏈恆定區基因、以及編碼SEQIDNO.3所示胺基酸序列的DNA和人抗體輕鏈恆定區基因為模板，使用無細胞轉錄/翻譯體系進行合成。無細胞轉錄/翻譯體系可以使用市售商品，也可以按照本身已知的方法，具體來說，大腸桿菌提取液可按照PrattJ.M.等人.，"TranscriptionandTranslation",HamesB.D.和HigginsS丄編輯.,IRLPress,Oxford179~209(1984)中所述的方法等製備。作為市售的細胞裂解物，來自大腸桿菌的例如有大腸桿菌S30提取系統(Promega公司製備)或RTS500Rapid翻譯系統(Roche公司製備)等，來自兔網織紅細胞的例如有兔網織紅細胞裂解系統(Promega公司製備)等，來自小麥胚芽的例如有PROTEIOS頂(TOYOBO公司製備)等。其中，優選使用小麥胚芽裂解物。小麥胚芽裂解物的製備方法例如可採用JohnstonF.B.等人"Nature,179，160~161(1957)、或者EricksonA.H.等人.，Meth.Enzymol.,96，38~50(1996)等所述的方法。本發明也包含含有由SEQIDNO.l所示胺基酸序列組成的重鏈可變區、由SEQIDNO.3所示胺基酸序列組成的輕鏈可變區的、保有活性的單鏈可變區片段(scFv)、Fab、Fab'和F(ab')2等人源化抗人骨橋蛋白抗體片段。可在scFv的製備中使用的用於將重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)連接的接頭只要可使本發明的抗體片段具有上述特性即可，沒有特別限定，例如有含有GGGGSGGGGSGGGGS(SEQIDNO,14)所示胺基酸序列的肽。本領域技術人員可以根據本發明製備該人源化抗人骨橋蛋白抗體或抗體片段與其它肽和蛋白質的融合抗體，和製備結合有修飾劑的修飾抗體。融合中使用的其它肽或蛋白質只要不使抗體19結合活性降低即可，沒有特別限定，例如有人血清白蛋白，各種tag肽、人工螺旋基序肽、麥芽糖結合蛋白、穀胱甘肽S轉移酶、各種毒素、可促進多聚體化的其它肽或蛋白質等。修飾中使用的修飾劑只要不使抗體結合活性降低即可，沒有特別限定，例如有聚乙二醇、糖鏈、磷脂、脂質體、低分子化合物等。上述得到的本發明的人源化抗人骨橋蛋白抗體或保有起因於該抗體的活性的抗體片段、將該抗體或該抗體片段與肽或其它蛋白質融合而成的融合抗體、或者使該抗體或抗體片段與修飾劑結合而成的修飾抗體還可以根據需要進一步純化，然後按照常規方法製成藥物製劑，可用於類風溼性關節炎、幼年型類風溼性關節炎和慢性類風溼等風溼病、銀屑病關節炎、銀屑病等的治療；抑制癌症和器官移植後的慢性排斥反應；以及變形性關節病、全身性自身免疫疾病、紅斑狼瘡、葡萄膜炎、白塞氏病、多發性肌炎、繫膜增殖性腎小球腎炎和結節病等自身免疫疾病的治療。本發明的人源化抗人骨橋蛋白抗體優選作為風溼病治療藥、自身免疫疾病治療藥、變形性關節病治療藥或類風溼性關節炎治療藥，更優選作為類風溼性關節炎治療藥使用。這些風溼病治療藥等的劑型的例子可以是注射劑、點滴劑等非腸道給藥製劑，優選通過靜脈內給藥、皮下給藥等進行給藥(為自身免疫疾病治療藥時也可以按照該方法)。製成藥物製劑時，在藥學上可接受的範圍內可以使用與這些劑型匹配的載體或添加劑。在上述製劑製備中，人源化抗人骨橋蛋白抗體的添加量根據患者的症狀程度、年齡或所使用的製劑的劑型或重組OPN抑制抗體的結合效價等而不同，例如可以使用0.1mg/kg~100mg/kg左右。上述得到的本發明的治療藥是作為有效成分的人源化抗人骨橋蛋白抗體與OPN的RGD序列和SVVYGLR序列(SEQIDNO.10)牢固地結合，抑制OPN的該部分與整聯蛋白的結合，結果可以抑制風溼20本發明的人源化抗人骨橋蛋白抗體不是與整聯蛋白一側、而是與OPN—側特異性結合，因此，抑制整聯蛋白的其它重要功能的可能性小，期待避免副作用的問題。此外，本發明的人源化抗人骨橋蛋白抗體還可用作類風溼性關節炎的診斷藥。如前所述，在類風溼性關節炎患者的關節中，特別發現了高濃度的凝血酶切割的OPN的N末端片段。因此，使用該人源化抗人骨橋蛋白抗體測定檢體中的OPN或其N末端片段的量，可對於類風溼性關節炎的診斷髮揮作用。該方法可以利用放射性同位素免疫測定法(RIA法)、ELISA法(E.Engvall等人.，(1980):MethodsinEnzymol.,70,419~439)、螢光抗體法、噬菌斑法、點樣法、凝集法、Ouchterlonymethod(烏赫特朗尼氏法)等常規免疫化學測定法中使用的各種方法("雜交瘤法和單克隆抗體"，抹式會社R&DPlanning發行，30—53頁，1982年3月5曰)。儘管上述方法可根據各種角度適當選擇，但從靈敏度、簡便性等角度考慮優選ELISA法。更優選方法的例子是例如將本發明的人源化抗人骨橋蛋白抗體固定在載體上，對與本發明的人源化抗人骨橋蛋白抗體識別不同的OPN上的部位的抗體進行標記，由此可以檢測OPN或其N末端片段，可以將其用作類風溼性關節炎的診斷藥。在標記上述抗體時所使用的標記物可以是用於形成融合蛋白/肽的穀胱甘肽S-轉移酶等蛋白質/肽，辣根過氧化物酶(以下稱為"HRP")、鹼性磷酸酶(以下稱為"AP")等酶，異硫氰酸螢光素、羅丹明等螢光物質，32P、1251等放射性物質，和化學發光物質等修飾劑。關於OPN同工型的檢測方法，例如可使用夾層法等本領域中公知的方法，更具體來說，可以通過使用與WO02/081522(專利文獻2)本發明還提供編碼本發明的抗體或其片段的基因、以及含有該基因的表達載體。本發明的表達載體只要是在原核細胞和/或真核細胞的各種宿主細胞中表達編碼本發明的抗體或其片段的基因、可生成這些21多肽即可，沒有特別限定。例如有質粒載體、病毒載體(例如腺病毒、反轉錄病毒)等。以及可與該基因功能性連接的啟動子。作為使本發明的多肽在細菌中表達的啟動子，當宿主為埃希氏桿菌屬細菌時，例如有Trp啟動子、lac啟動子、rec啟動子、XPL啟動子、lpp啟動子、tac啟動子等。作為使本發明的抗體或其片段在酵母中表達的啟動子，例如有PH05啟動子、PGK啟動子、GAP啟動子和ADH啟動子，宿主為芽孢桿菌屬細菌時，例如有SL01啟動子、SP02啟動子、penP啟動子等。宿主為哺乳動物細胞等的真核細胞時，例如有來自SV40的啟動子、反轉錄病毒的啟動子、熱激啟動子等。宿主細胞使用細菌、特別是大腸桿菌時，本發明的載體可以進一步含有起始密碼子、終止密碼子、終止子區和可複製單元。宿主使用酵母、動物細胞或昆蟲細胞時，本發明的表達載體可以含有起始密碼子和終止密碼子。此時，可以含有增強子序列、編碼本發明的多肽的基因的5'—側和3'—側的非翻譯區、剪接界、聚腺苷酸化位點、或可複製單元等。還可根據需要含有通常使用的選擇標記(例如四環素、氨千青黴素、卡那黴素)。本發明還提供導入了本發明的基因的轉化體。上述轉化體例如可通過用本發明的表達載體轉化宿主細胞來製備。轉化體的製備所使用的宿主細胞只要適合上述表達載體、並可轉化即可，沒有特別限定，可例舉本發明
技術領域：
中通常使用的天然細胞或人工建立的細胞系等各種細胞(例如細菌(埃希氏桿菌屬細菌、芽孢桿菌屬細菌)、酵母(酵母屬、畢赤氏酵母屬等)、動物細胞或昆蟲細胞(例如Sf9)等)。轉化可按照本身公知的方法進行。本發明還提供本發明的抗體或其片段的生成方法，該方法包含使本發明的基因在宿主細胞中表達，即，使用上述轉化體。本發明的抗體或其片段的生成中，轉化體可在營養培養基中培養。營養培養基優選含有轉化體生長發育所必需的碳源、無機氮源或有機氮源。碳源例如有葡萄糖、葡聚糖、可溶性澱粉、蔗糖等，無機氮源或有機氮源例如有銨鹽類、硝酸鹽類、胺基酸、玉米漿、蛋白腖、酪蛋白、肉膏、大豆粕、馬鈴薯提取液等。還可根據需要含有其它營養素(例如無^L鹽(例如氯化鈣、磷酸二氫鈉、氯化鎂)、維生素類、抗生素(例如四環素、新黴素、氨苄青黴素、卡那黴素等)等)。轉化體的培養可按照本身公知的方法進行。培養條件例如溫度、培養基的pH和培養時間可適當選擇。例如，宿主為動物細胞時，培養基可以使用含有約5~20%胎牛血清的MEM培養基(Science,122巻，501頁，1952)、DMEM培養基(Virology，8巻，396頁，1959)、RPMI1640培養基(J.Am.Med.Assoc.,199巻，519頁，1967)、199培養基(Proc.Soc.Exp.Biol.Med.，73巻，1頁，1950)等。培養基的pH優選約為6~8,培養通常在約3040。C下進行約15-72小時，可以根據需要進行通氣或攪拌。宿主為昆蟲細胞時，例如有含胎牛血清的Grace's培養基(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82巻，8404頁，1985)等，其pH優選約5~8。培養通常在約2040。C下進行15~100小時，可以根據需要進行通氣或攪拌。宿主為細菌、放線菌、酵母、絲狀真菌時，例如含有上述營養源的液體培養基較為適當。優選pH為58的培養基。宿主為大腸桿菌時，優選的培養基可例舉LB培養基、M9培養基(Miller等人.，Exp.Mol.Genet,ColdSpringHarborLaboratory,431頁，1972)等。這種情況下，培養通常可以在1443。C下進行約3-24小時，根據需要可同時進行通氣或攪拌。宿主為芽孢桿菌屬細菌時，培養通常可以在30~40。C下進行約16~96小時，根據需要可同時進行通氣或攪拌。宿主為酵母時，培養基例如有Burkholder，s極限培養基(Bostian,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77巻，4505頁，1980),pH優選為5~8。培養通常在約20~35。C下進行約14~144小時，並且可以根據需要進行通氣或攪拌。分離和純化。分離和純化的方法例如有鹽析和溶劑沉澱法等利用溶解度差的方法；透析、超濾、凝膠過濾和十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳等利用分子量差的方法；離子交換色傳和羥基磷灰石色語等利用電荷差的方法；親和層析等利用特異性親和性的方法；反相高效液相色譜等利用疏水性差異的方法；等電點聚焦電泳等利用等電點差的方法等。以上對於本發明的整體情況進行了描述，這裡給出為了深化理解而參照的特定實施例，它們的目的只是例舉，並不限定本發明的範圍。實施例以下給出實施例。如無特別說明，涉及使用試劑盒等的部分是4安照所附說明書進行。(1.人源化2K1抗體的製備)本發明中，製備兩種將國際公開公報WO2003/027151所述的來自小鼠的抗人骨橋蛋白抗體一2K1抗體進行人源化的人源化抗人骨橋蛋白抗體(以下稱為人源化2K1抗體或R2K1抗體)。各人源化2K1抗體的製備大致按上述公報所述方法製備，因此以下才既略描述。首先，通過使用合成寡DNA的PCR，製備具有圖1和圖2所示鹼基序列的、兩種編碼人源化抗OPN抗體的重鏈可變區(VHs)的DNA,和具有圖3和圖4所示石鹹基序列的、兩種編碼人源化抗OPN抗體的輕鏈可變區(VLs)的DNA。在以下的記述中，為了將它們區另ij,將圖1和圖2所示人源化抗人OPN抗體VHs分別稱為R2K1-VH1.7和R2K1-VH1.8。同樣，將圖3和圖4所示的人源化抗人OPN抗體VLs分別稱為R2K1-VL1.7和R2K1-VL1.8。接著，利用限制酶HindIII識別位點和Bamffl識別位點，將各編碼上述人源化抗人OPN抗體VHs的DNA插入到含有人免疫球蛋白恆定區鏈的基因的表達載體AG-y1中，製備具有R2K1-VH1.7的重鏈的表達質粒、和具有R2K1-VH1.8的重鏈的表達質粒。同樣，將24各編碼上述人源化抗人OPN抗體VLs的DNA插入到含有人免疫球蛋白恆定區k鏈的基因的表達載體AG-k中，製備具有R2K1-VL1.8的輕鏈的表達質粒、和具有R2K1-VL1.7的輕鏈的表達質粒。這些表達質粒導入到大腸桿菌中，使其增殖，使用市售的質粒純化試劑盒(QIAGEN公司)進行純化。最後，將上述純化表達質粒的各種組合，通過磷酸釣法轉染CHO-DG44細胞，在含有Geneticin(Invitrogen公司)和透析型FCS(Invitrogen公司)的MEM培養基(Invitrogen公司)中選擇細胞，由此得到表達兩種人源化2K1抗體的細胞。即，可使由具有R2K1-VH1.8的重鏈和具有R2K1-VL1.8的輕鏈組成的人源化2K1抗體一R2Klv1.8抗體；由具有R2K1-VH1.7的重鏈和具有R2K1-VL1.7的輕鏈組成的人源化2K1抗體一R2Klvl.7抗體表達。將按照上述順序得到的各R2K1抗體生成細胞在添加有進行了10%透析型FCS的MEM培養基中充分增殖，接種於細胞培養滾瓶(BDBiosciences公司)中，在37。C、1rpm轉速的條件下進行培養。數曰後，確認細胞貼附於器壁並增殖，捨去培養液，更換為500mL不含有血清的MEM培養基，並在上述條件下培養細胞。約2周後，在由器壁剝離並懸浮的細胞增多時結束培養，將培養上清用0.22/mi的濾器過濾並回收，由此得到含有各R2K1抗體的培養上清。以這些培養上清為起始材料，使用蛋白A柱(MILLIPORE公司)和陽離子交換柱(Amersham公司)，得到了各數mg的兩種純化人源化抗體，即R2Klvl.8抗體和R2Klvl.7抗體。在以下所述各種試驗中，使用上述得到的純化抗體。嵌合2K1抗體(以下也稱為C2K1抗體)使用按照上述國際公開公報WO2003/027151所述方法獲得的抗體。(2.通過ELISA確認與人骨橋蛋白肽的結合性)參考Kon等人的ELISA法(JournalofCellularBiology,88:420~25432(2002)),對各R2K1抗體和CZK1抗體與人骨橋蛋白肽(CVDTYDGRGDSVVYGLRS:SEQIDN0.13)的結合活性進行比較。以下概略描述。學社)與導入了馬來醯亞氨基的BSA反應，製備hOPN5-BSA螯合物。將hOPN5-BSA螯合物以200ng/100/^L/孔在4°C下、在ELISA板(Nunc公司)中固定一夜，洗板，然後用添加了1。/。BSA的PBS在4。C下封閉過夜。將用添加1%BSA的PBS稀釋的抗體樣品以100//L/孔添加到上述板中，在37。C下反應1小時。檢測是使用過氧化物酶(HRP)標記抗人IgG(H+L)抗體(和光純藥林式會社製備)進行。使用酶標儀(MolecularDevices<^司)測定波長450nm的p及光度。結果證實，R2Klvl.7抗體和R2Klvl.8抗體與hOPN5肽的結合性與C2K1抗體同等(圖5)。(3.R2K1抗體對人末梢血單核細胞遊走的抑制活性)進行研究。首先，將對健康人肝素採血得到的血液用RPMI1640培養基稀釋2倍。將稀釋的血液鋪於Ficoll-Paque(Pharmacia公司)中，以400xg下在室溫下離心30分鐘。回收在血漿和Ficoll-Paque交界所見到的白色層，作為單核細胞使用。將這樣得到的單核細胞用人TNF-a(20ng/mL)進行過夜培養和活化，將活化後的細胞用於遊走試驗。遊走試驗是使用48孔微型化學趨化室裝置(microchemotaxischamber,NeuroProbeInc公司)進行。將人OPN與牛凝血酶(Sigma)一起在37。C下反應2小時，進行切割。將以各種濃度添加R2K1抗體和C2K1抗體而得到的混合液預先在37。C下;^置15分鐘，然後加入到下側房室中(人OPN終濃度為10^g/mL)。在其上放置聚碳酸酯濾器(孔徑5/mi),再向上側房室中加入50〃L細胞懸浮液(2x106個細胞26/mL)。在37。C、5%(302存在下培養2小時，然後取下聚碳酸酯濾器，除去上側濾器表面的細胞，然後將細胞用Diff-Quick(Baxter公司)染色。以40倍的放大倍率下計測上側濾器表面的細胞數，結果以6孔的平均細胞數(細胞/mm"士SEM表示(表1)。這些結果顯示，R2Klvl.7抗體和R2Klvl.8抗體兩者與C2K1抗體同樣，抑制了由TNF-a活化的人末梢血單核細胞向凝血酶切割型人骨橋蛋白的遊走。R2Klvl.7和R2Klvl.8tableseeoriginaldocumentpage27(4.通過ELISA評價熱穩定性)將C2K1抗體和兩種R2K1抗體用PBS稀釋為50〃g/mL，在70°C的水浴下進行2小時處理，然後恢復至室溫，通過上述ELISA,將所得的吸光度與未處理樣品的吸光度的比例作為殘留活性製成圖表表示。殘留活性使用具有直線性的0.2~2.0範圍內的吸光度的值計算(以下相同)。結果表明，上述處理後的殘留活性中，R2Klvl.7抗體和R2Klvl.8抗體比C2K1抗體高(圖6)。特別是R2Klv1.7抗體顯示超過卯％的殘留活性。由此可以判斷，R2Klvl.7抗體和R2Klvl,8抗體與27C2K1抗體相比，熱穩定性提高。(5.通過ELISA評價低pH耐性)將C2K1抗體和兩種R2K1抗體的純化品用PBS稀釋為50^g/mL。使用1NHC1和pH計(HORIBA公司)將各稀釋劑調節至pH5，在25。C下處理2小時。然後用1MTris-HCl(pH9.5)將各稀釋劑調節至pH7，進行上述ELISA,將所得吸光度與未處理樣品的吸光度的比例作為殘留活性製成圖表表示。結果發現，上述處理後的殘留活性中，R2Klvl.7抗體比C2K1抗體和R2Klvl.8抗體顯著高(圖7)。由此表明，R2Klvl.7抗體與R2Klvl.8抗體和C2K1抗體相比，對低pH的耐性提高。(6.通過螢光光譜測定來評價鹽酸胍耐性)將C2K1抗體和兩種R2K1抗體用含有各濃度的鹽酸胍的20mM磷酸鈉緩衝液+120mMNaCl(pH7)調節至50〃g/mL(對照未添加鹽酸胍)，在10。C下靜置過夜，然後測定各樣品的螢光光譜。螢光光譜的測定使用FP-6500螢光分光計(JASCO公司)進行。使用光路長3mm的比色皿(cell),在波長320nm~370nm的範圍內對由280nm的激發光產生色氨酸發出的螢光進行掃描。在抗體間比較鹽酸胍濃度和峰波長之間的關係。結果，對於C2K1，從鹽酸胍濃度超過1M的時間點，對於R2Klv1.8，從超過2M的時間點，可觀察到由於蛋白立體結構鬆散而產生的峰波長的位移，而對於R2Klv1.7，直至3.8M也未有峰波長位移(圖8)。由此表明，R2Klvl.7抗體與R2Klvl.8抗體和C2Kl抗體比較，對鹽酸胍的耐性提高。(7.通過CD評價低pH耐性)將C2K1抗體和R2Klvl.7抗體用20mM檸檬酸緩衝液+120mMNaCl(pH6)調節至2mg/mL。向其中邊加入0.1NHC1和蒸餾水邊製備具有抗體濃度為1mg/mL的各pH水準的樣品，在室溫下處理1小時後測定各樣品的CD光譜。28CD(圓二色性)的測定使用J-820分光偏振計(JASCO公司)進行。使用光路長O.lmm的比色皿，測定波長205nm~260nm範圍內CD光譜。光譜的分析使用基於Yang等人的CD光譜分析法(MethodsinEnzymology,130,208~269(1986))製造的JWSSE-480型蛋白質二次結構分析程序(JASCO公司)。在抗體間比較本方法中計算的隨機結構的含有率與處理pH之間的關係。結果表明，對於C2K1抗體，由pH3可見隨機結構含有率的升高，而對於R2Klv1.7，直至pH2.7也未見隨機結構的升高(圖9)。由此確認，R2Klvl.7抗體與C2K1抗體相比，具有低0.3的pH耐性。(8.通過差示掃描量熱儀評價熱穩定性)將C2K1抗體和R2Klvl.7抗體以1mg/mL的濃度溶解於20mM檸檬酸緩衝液+120mMNaCl(pH6.0)緩衝液中，使用MicroCal公司的超高靈敏度差示掃描量熱儀(VPcapillaryDSCplatform)研究熱穩定性。結果如圖10所示。表示高級結構變性溫度的中點轉變溫度(Tm)在C2K1抗體中是76.0°C，而在R2Klvl.7抗體中是82.8°C，確認升高約6。C。由此表明，R2Klvl.7抗體的熱穩定性顯著提高。(9.R2Klvl.7對OPN的細胞粘附抑制效果)為了比較本申請發明的R2Klvl.7和公知的人源化抗OPN抗體(參照WO03/027151,以下稱為R2KlvO)的藥理效果，研究了這兩種抗體對人OPN的細胞粘附抑制效果。1.細胞的培養和繼代JurkatE6.1細胞購自大日本製藥(抹)，使用RPMI1640(10%FCS、青黴素-鏈黴素)進行繼代和培養。2.試劑的製備粘附緩衝液(L-15培養基、1%BSA、50mMHEPES、pH7.4)PMA溶液(粘附緩衝液中含有40ng/mL12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(PMA)[SIGMA])29CV染色液(0.5。/。結晶紫、1%曱醯胺、20%曱醇)GST溶液(PBS(-)中含有5^g/mL穀胱甘肽S-轉移酶(GST)[SIGMA])人IgG,溶液(PBS(-)中含有400pg/mL)[CALBIOCHEM]3.凝血酶切割型人N末端骨橋蛋白(OPN)的製備GST融合凝血酶切割型人N末端OPN(GST-人N-OPN，1.6mg/mL)如WO02/081522中記載的方法進行製備，用PBS(-)稀釋為5^g/mL後，用於試驗。4.受試藥物的製備將R2Klvl.7(18.6mg/mL)和R2KlvO(4.39mg/mL)用PBS(-)稀釋為4、12、40、120和400(wg/mL)，各稀釋液均添加人IgGP使總蛋白質濃度為400:g/mL。5.組構成空白組(GST)對照組受試藥物組R2Klvl.7(1、3、10、30、lOO^wg/mL)R2Klv0(1、3、10、30、濯^g/mL)6.細胞粘附試驗將25pLGST-人N-OPN溶液添加到96孔微孔板的除外空白的所有的孔中，空白組是添加25;wLGST溶液，將該微孔板在37。C下溫育1小時，然後用PBS(-)清洗2次。添加50〃LPMA溶液，將該微孔板在37。C下溫育30分鐘，然後添加25pL受試藥物溶液(受試藥物組)或人IgG,溶液(空白組和對照組)。JurkatE6.1細胞懸浮於粘附緩衝液中，使濃度為2xl(^個細胞/mL，所有孔中均添加25^L。將懸浮液以15xg離心1分鐘，使細胞沉澱於板的底部，然後在37。C下培養1小時。反應結束後，將板倒轉，以47xg離心2分鐘，除去上清(非粘附細胞)。粘附細胞數的定量是添加25;uLCV染色液，將該微孔板在室溫下放置10分鐘，對細胞染色並固定，然後將該微孔板用純水洗330次。在所有的孔中加入251。/。Triton-X100溶液，確認細胞溶解，然後用酶標儀(SPECTRAmax250，MolecularDevices)測定吸光度(測定波長595nm)。7.分析試驗是每組使用5個孔。計算各組吸光度的平均值和抑制率，計算IC50值(抑制率為50%時的受試藥物濃度)。抑制率是以空白組為100%，對照組為0%。IC50值如下計算繪製X軸以對數表示受試藥物濃度，Y軸表示抑制率的圖表，通過最小二乘法代入直線回歸方程式進行計算。IC50值的計算使用在用量反應中顯示直線性的受試藥物濃度的數據。由圖11所示的結果可以理解公知的人源化抗人OPN抗體的細胞粘附抑制效果極低，而R2Klvl.7具有優異的細胞粘附抑制效果(IC50值6.4)。(10.R2Klvl.7在食蟹猴中對於膠原誘導關節炎的效果)將用弗氏完全佐劑(BectonDickinsonandCompany)乳液化的牛II型膠原(膠原技術研修會)在給藥36日前免疫雌性食蟹猴的背部和尾部，在給藥15天前加強免疫。根據與免疫前進行比較的體重和近側指間關節橢圓面積的變化率，將動物隨機分成三組給藥治療組(『10)。將25mg/kg或50mg/kg用量的R2Klvl.7或溶劑對照組按每周1次、共8次通過靜脈內注入給藥。以最初給藥日規定為第0天。給藥期間的第0、6、13、20、27、34、41、48和55天，監控近側指間關節橢圓面積作為關節腫脹的體徵。用遊標卡尺測定前後肢近側指間關節的短軸和長軸，計算橢圓面積，用16個指的橢圓面積的平均值作為近側指間關節橢圓面積。以給藥前的值為100，計算近側指間關節橢圓面積的變化率。第0天以及第6、13、20、27、34、41、48和55天(給藥6天後)採集血漿，測定R2Klvl.7和抗R2Klvl.7抗體。該測定的R2Klvl.7的血漿濃度與波谷水平對應。數據分析是在刪除抗R2Klvl.7抗體陽性動物和試驗期間死亡的動物的數據後進行。在25mg/kg用量R2Klvl.7組的1隻動物、以及50mg/kg用量R2Klvl.7組的4隻動物中產生了抗R2Klvl.7抗體。溶劑對照組的2隻動物、25mg/kg用量R2Klvl.7組的2隻動物以及50mg/kg用量R2Klvl.7組的1隻動物在給藥後死亡。死亡例可能是由於劇烈炎症導致的衰竭而死亡。50mg/kgR2Klvl.7的治療中，與對照溶劑組比壽交，在第27天~第55天期間，通過近側指間關節橢圓面積的變化率測定的足腫脹顯著減少(圖l2)。25mg/kg用量R2Klvl.7對於近側指間關節橢圓面積的變化未顯示顯著效果。25mg/kg用量和50mg/kg用量的血漿中R2Klvl.7波谷濃度分別為38.41~76.13Ag/mL和73.91~125.3^g/mL。人OPN的SVVYGLR序列與猴OPN的相應序列(SVAYGLR)(SEQIDNO.ll)不同，R2Klvl.7與該人OPN肽的結合親和性比對應的對猴OPN肽的結合親和性高100倍以上。考慮到這些發現，推定在關節炎治療中，R2Klvl.7的有效血漿濃度為100〃g/mL以下。(11.R2Klvl.7的scFv的製備)以上述具有R2K1-VH1.7的重鍊表達質粒和具有R2K1-VL1.7的輕鍊表達質粒作為模板，通過PCR製備編碼具有VH1.7-接頭-VL1.7(接頭是編碼GGGGSGGGGSGGGGS(SEQIDN0.14)所示胺基酸序列的鹼基序列)結構的單鏈可變區片段(scFv)的DNA片段。該DNA片段的末端附加有限制酶Sfil和Notl的識別序列。將該DNA片段用限制酶Sfil和Notl消化，插入到同樣用Sfil和Notl消化的pCANTAB5E載體(Marks,J.D等人，J.Mol.Biol.,222巻，581~97頁,1991)的Sfil位點和Notl位點，由此製備R2K1-VH1.7的scFv表達質粒。該表達質粒中，scFv的編碼區的下遊附加有編碼E-Tag的鹼基序列。按照常規方法，將該質粒導入大腸桿菌HB2151抹，接種於SOBAG瓊脂板(含2%葡萄糖和100〃g/mL氨苄青黴素的SOB板)，得到轉化克隆。由所得克隆提取質粒DNA，通過以該質粒DNA為模板的DNA,鹹基序列分析確認scFv的編碼區的序列。DNA鹼基序列分析是使用32DTCS-QuickStart試劑盒和CEQ2000XLDNA分析系統(兩者均為BeckmanCoulter公司)。所得鹼基序列如SEQIDN0.9所示。確認了鹼基序列的大腸桿菌克隆在含有2%葡萄糖和100^g/mL氨苄青黴素的2xYT培養基中培養後，將其一部分懸浮於加入了1mMIPTG和100〃g/mL氨千青黴素的2xYT培養基中，再培養過夜，進行scFv的表達誘導。培養結束後，通過離心回收細胞，懸浮於含有1mMEDTA的PBS中，在冰上放置30分鐘。接著將懸浮液以10,000rpm離心15分鐘，回收上清，用0.45^m的濾器過濾，由此得到含有scFv的周質組分。通過使用抗E-Tag抗體的親和層析，由該周質組分中純化R2Klvl.7的scFv(以下稱為R2Klvl.7-scFv)。對於上述製備的R2Klvl.7-scFv進行凝膠過濾層析，結果由圖13所示的分離圖譜中確認，幾乎均為單體。(12.確認R2Klvl.7-scFv與人骨橋蛋白肽的結合性)通過ELISA法測定純化的R2Klvl.7-scFv與hOPN5肽的結合活性。方法大致如前所述，在本測定中，使用HRP標記抗E-Tag抗體作為標記抗體。結果如圖14所示。確認純化的R2Klvl.7-scFv未與陰性對照的BSA結合，而與hOPN5肽特異性結合。(13.聚乙二醇修飾抗體片段的製備)按照常規方法，對R2Klvl.7抗體進行胃蛋白酶處理，然後使用蛋白GHP柱(兩者均為AmershamBiosciences公司)和Hiprep16/60SephacrylS-200HighResolution柱(AmershamBiosciences公司),4尋到純化F(ab')2。接著，用0.1MDTT對純化F(ab')2進行還原處理，活化石危醇基，然後進4亍4吏用SephadexG-25才主(AmershamBiosciences公司)的凝膠過濾，除去DTT。將這樣得到的Fab，與馬來醯亞胺化聚乙二醇SUNBRIGHTME-120MA(日本油月旨)按照摩爾比1:10混合，在4。C下靜置過夜，進行偶聯反應。添加碘乙醯胺(NacalaiTesque),終止偶聯33反應，然後通過使用Hiprep16/60SephacrylS-200HighResolution柱的凝膠過濾，得到聚乙二醇修飾的F(ab')2(以下可記為F(ab')2-PEG)。該SDS-PAGE的結果如圖15所示。通過與作為比較對照的、電泳的未修飾F(ab')2進行比較，可以確認通過聚乙二醇修飾導致分子量增力口。(14.確認F(ab')2-PEG與骨橋蛋白肽的結合活性)使用表面等離子共振測定法確認純化R2Klv1.7的F(ab')2-PEG與hOPN5肽的結合活性。將生物素化hOPN5肽固定在SensorChipSA(BIAcore公司)上，使用用HBS-EP緩衝液(BIAcore公司)預先稀釋為5Z^g/mL的F(ab')2-PEG確認結合活性，結果如圖16所示。由信號的升高，可確認本F(ab')2-PGE與hOPN5肽的結合活性與R2Klvl.7相同。產業實用性本發明的人源化抗人骨橋蛋白抗體的活性(抗原結合活性、白細胞遊走抑制活性等)和/或穩定性(對熱、低pH條件和改性劑的耐性等)優異，因此在以自身免疫疾病、風溼病、類風溼性關節炎和變形性關節病為代表的各種炎症性疾病的預防或治療中，比起以往的抗人骨橋蛋白抗體可作為更為有效的藥物。雖然本發明強調、說明了優選方式，但優選的方式也可以變更，這對於本領域技術人員來說是顯而易見的。本發明可以按照本說明書詳述以外的方法實施。因此，本發明包含在所附"權利要求書"的要旨和範圍內所包含的所有的變更。本申請是以在日本國申請的特願2006-152892為基礎，其中所公開的內容均包含在本說明書中。這裡所述的包含專利或專利申請說明等程度地引入到本說明書中。3權利要求1.人源化抗人骨橋蛋白抗體，該抗體含有由SEQIDNO.1所示胺基酸序列組成的重鏈可變區、和由SEQIDNO.3所示胺基酸序列組成的輕鏈可變區。2.權利要求1所述的人源化抗人骨橋蛋白抗體，其中，上述抗體的重鏈恆定區是人IgYl。3.權利要求1所述的人源化抗人骨橋蛋白抗體，其中，上述抗體的輕鏈恆定區是人IgK。4.權利要求1所述的人源化抗人骨橋蛋白抗體，其中，上述抗體的重鏈恆定區為人Igyl，上述抗體的輕鏈恆定區為人IgK。5.人源化抗人骨橋蛋白抗體，該抗體含有由SEQIDNO.25所示胺基酸序列組成的重鏈、和由SEQIDNO.27所示胺基酸序列組成的輕鏈。6.多核苷酸，該多核苷酸含有編碼權利要求1所述人源化抗人骨橋蛋白抗體的重鏈可變區的序列。7.多核苷酸，該多核苷酸含有編碼權利要求1所述人源化抗人骨橋蛋白抗體的輕鏈可變區的序列。8.表達載體，該表達載體含有權利要求6和/或7所述多核苷酸。9.宿主細胞，該宿主細胞中導入了權利要求8所述的表達載體。10.生產人源化抗人骨橋蛋白抗體的方法，該方法包含培養權利要求9所述的宿主細胞，使該細胞表達人源化抗人骨橋蛋白抗體的步驟。11.自身免疫疾病、風溼病、類風溼性關節炎或變形性關節病的治療藥，該藥物含有權利要求1-5中任一項所述的人源化抗人骨橋蛋白抗體。12.用於預防或治療自身免疫疾病、風溼病、類風溼性關節炎或變形性關節病的方法，該方法包含給予治療有效量的權利要求1~5中任一項所述的人源化抗人骨橋蛋白抗體的步驟。13.權利要求1~5中任一項所述的人源化抗人骨橋蛋白抗體在製備用於預防或治療自身免疫疾病、風溼病、類風溼性關節炎或變形性關節病的藥物中的應用。全文摘要本發明提供比以往的抗人骨橋蛋白抗體活性(抗原結合活性、白細胞遊走抑制活性等)和/或穩定性(對熱、低酸性條件和改性劑的耐性等)優異的人源化抗人骨橋蛋白抗體。文檔編號C12N15/09GK101495632SQ20078002856公開日2009年7月29日申請日期2007年5月30日優先權日2006年5月31日發明者中島敏博,山本宣哉,樋口浩文,酒井文彥,鳥飼正治申請人:安斯泰來製藥有限公司;財團法人化學及血清療法研究所