從發酵法生產衣康酸的廢菌絲體中提取蛋白質的方法

2023-05-31 21:54:51

專利名稱：：從發酵法生產衣康酸的廢菌絲體中提取蛋白質的方法
技術領域：
：本發明涉及一種從發酵法生產衣康酸的廢菌絲體中提取蛋白質的方法，屬於生物
技術領域：
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背景技術：
：衣康酸是一種高科技、高利潤、高創匯產品，是重要的化工原料。衣康酸及其酯類是生產晴綸等化學纖維、合成樹脂、塑料、橡膠、表面活性劑、無毒食品包裝材料、除草劑、粘著劑以及塑料助劑等的工業原料,參見YahiroKet.al.BreedingofAspergillusterreusMutantTN-484forItaconicAcidProductionwithHighYield[J].JournalofFermentationBiology,1995，79:506-508。由於其分子內部含有兩個活潑的羧基和一個雙鍵，雙鍵與羧基呈共軛關係，使得衣康酸的性質非常活潑，除可自身聚合外，也可以和不同數目的其它單體聚合，形成聚合高分子，因此廣泛應用於化學合成行業。另外，衣康酸在水處理技術、高強度玻璃鋼及農藥中間體、除垢劑等領域中也具有廣泛中用途。隨著科學技術的發展和各個行業之間的交叉滲透，衣康酸新的用途也將不斷被開發出來。目前，衣康酸主要以玉米澱粉為原料採用土麴黴Uw^g/〃^&w^)深層發酵工藝生產，參見RiscaldatiEetal.EffectofpHandstirringrateonitaconateproductionbyAspergillusterreus[J].JournalofBiotechnology,2000，83:219—230.禾口BonnarmePet.al.ItaconateBiosynthesisinAspergillusterreus[J]Bacteriol，1995，177:3573-3578。工業生產規模日益擴大。發酵結束後會產生大量的土麴黴廢菌絲體殘渣，發酵液過濾後產生的溼渣重量佔發酵液總量的2%。由於其中有少量衣康酸殘留，因此適口性較差，無法直接作為動物的詞料，生產企業採用的處理方式只能是鍋爐焚燒，或置於空場堆放，待風乾後集中填埋。由於菌體久置會自溶，並產生難聞的氣味，尤其是夏季，從廢菌絲體中流出的汙水和散發出的惡臭對廠區周圍的環境造成嚴重汙染，而且會成為廠區內雜菌滋生的發源地。因此有必要對廢菌絲體進行綜合治理。與此同時，我國養殖業對飼料蛋白的需求量日益增加，例如飼用大豆蛋白的7(^依靠進口，參見丁國文.擴大非糧食飼料原料供給[J].中國飼料，2006，22:22-23。因此，從廢棄菌渣中提取蛋白質，擴大飼用蛋白的生產渠道，具有積極的現實意義。
發明內容針對現有技術的不足，本發明提供了一種從發酵法生產衣康酸的廢菌絲體中提取蛋白質的方法。以改變目前衣康酸生產中廢菌絲對生產環境構成汙染的現狀，實現廢物利用，變廢為寶的目的，同時提供一種新的飼料蛋白的來源。原料說明I見有技術中(參見RiscaldatiEet.al.EffectofpHandstirringrateonitaconate3productionbyAspergillusterreus[J].JournalofBiotechnology,2000，83:219—230)發酵法生產衣康酸產生的土麴黴廢菌絲體的主要成分如表1所示表l土麴黴廢菌絲體成分測定結果tableseeoriginaldocumentpage4上述蛋白質的測定採用微量凱氏定氮法[GB/T14771—93]，粗纖維的測定採用GB/T5009.10-2003中的方法，脂肪的測定採用索氏抽提法(GB5512-85)。從表1中可以看出，發酵生產衣康酸產生的土麴黴廢菌絲體成分中含量最多的是蛋白質，對這部分蛋白質進行提取，可實現變廢為寶的目的。發明概述首先將從衣康酸生產企業取來的土麴黴廢菌絲體進行磨碎、篩分及酸洗等預處理，然後在適宜的條件下用Na0H脫菌絲體蛋白，經過抽濾後收集得到的蛋白液，用酸調pH至菌體蛋白的等電點將菌體蛋白沉澱下來，離心洗滌後乾燥得到菌體蛋白。發明詳述一種從廢菌絲體中提取蛋白質的方法，所用原料為發酵法生產衣康酸所產生的土麴黴廢菌絲體，包括廢菌絲體磨碎過篩、清洗、鹼液提取蛋白、過濾、蛋白沉澱及乾燥，步驟如下(1)廢菌絲體磨碎過40目篩，用0.61M的稀鹽酸清洗，除去廢菌絲表面雜質。(2)稀鹽酸洗過的土麴黴廢菌絲體用鹼法提取菌體蛋白，提取條件為溫度85-90°C，Na0H溶液的濃度為0.50.8M，Na0H溶液與土麴黴廢菌絲體(乾重)的質量比為3040:1，反應時間為8-9小時，反應完成後立即抽濾，收集液體部分，得蛋白提取液。(3)用鹽酸將上述蛋白提取液的pH調到菌體蛋白的等電點pH34,室溫下靜置26小時，當沉澱量不再增加時用離心機在4000rpm轉速下離心20-25分鐘，棄去上清液，留取蛋白沉澱。(4)向上述蛋白沉澱中加入35倍質量比的蒸餾水，充分混和後進行噴霧乾燥，得到菌體蛋白。本發明方法從衣康酸廢菌絲體提取得到的菌體蛋白為淡黃色粉體。上述步驟(1)優選以下方法用0.61M的稀鹽酸清洗衣康酸廢菌絲體，稀鹽酸用量與菌絲體乾重的質量比48:1，分兩次加入，第一次加24:l的稀鹽酸，放入恆溫振蕩器中於3(TC，160rpm條件下，充分混和12小時後，棄去液體部分，向固體部分加入剩餘鹽酸，同樣條件下混和30分鐘，用布氏漏鬥抽濾，第二次加入的鹽酸回收後重複使用，固體部分用48倍質量的水洗至pH6.07.0，抽濾後備用。本發明方法從衣康酸發酵產生的土麴黴廢菌絲體中提取菌體蛋白，原料成本低，操作方法簡單易行，得到的菌體蛋白中胺基酸種類豐富(見表2)，含有多種畜禽自身不能合成的胺基酸，因此是一種優良的飼料蛋白來源。表2從衣康酸廢菌絲體提取菌體蛋白中胺基酸成分分析結果tableseeoriginaldocumentpage5具體實施例方式以下實施例中使用的原料廢菌絲體為青島琅琊臺集團股份有限公司生產衣康酸過程中產生的風乾的土麴黴廢菌絲體，主要成分如表l所示。實施例1:(1)廢菌絲體的預處理稱取土麴黴廢菌絲體100g，用研缽磨碎後過40目篩，加入300ml的0.6M的鹽酸，30'C恆溫振蕩器中，轉速160rpm振蕩l小時，取出後靜置，倒出上面部分黃綠色清液，再重複上述步驟，振蕩約40分鐘，用布氏漏鬥抽濾，稀鹽酸回收後重複利用，用蒸餾水將廢菌體洗至p服.5抽濾後備用。(2)鹼液提取蛋白用0.8M的NaOH溶液提取步驟(1)預處理的廢菌絲體中的蛋白，固液比為1/30(單位g/ml)，充分攪拌均勻後放入9(TC水浴中，反應時間為9小時，其間每隔兩個小時攪拌一次，反應完畢立即用布氏漏鬥抽濾，鹼液抽濾完畢後用200ml蒸餾水衝洗濾餅，衝洗液一同收集，最終收集鹼蛋白液2850ml，取樣用凱氏定氮法測量其中的蛋白含量，菌體蛋白質收率為87%wt。(3)等電點法提取菌體蛋白沉澱及乾燥將上述收集的鹼蛋白液用5M鹽酸調pH，邊加鹽酸邊緩慢攪拌混均，用酸度計檢測溶液中pH的變化，當pH降至3.4菌體蛋白的等電點時，出現的絮狀沉澱達到濃度最大，停止加酸，室溫下靜置過夜，使溶液中的蛋白質充分沉澱，倒出上面的清液，向沉澱部分加水300ml，此時蛋白懸濁液的pH為7左右，然後對得到的該蛋白質樣品進行噴霧乾燥，控制噴霧乾燥條件進風溫度15(TC，最終得到黃色菌體蛋白粉28.5g。該菌體蛋白中胺基酸成分分析結果列於表2中。實施例2:(1)廢菌絲體的預處理稱取土麴黴廢菌絲體200g，用研缽磨碎後過40目篩，加入400ml濃度為0.6M的鹽酸，45"C恆溫振蕩器中，轉速140rpm振蕩0.5小時，取出後靜置1小時，倒出清液，再加入200ml濃度為0.6M的鹽酸重複上述步驟，振蕩20分鐘，用布氏漏鬥抽濾，稀鹽酸回收後重複利用，再用蒸餾水100ml，將廢菌絲體洗至p服.O。(2)鹼液提取蛋白用4000ml濃度為1.OM的NaOH溶液與步驟(1)預處理的廢菌絲體充分攪拌均勻，在沸水浴中反應6小時，其間每隔1個小時攪拌一次，反應完畢立即用布氏漏鬥抽濾，鹼液抽濾完畢後用200ml蒸餾水衝洗濾餅，衝洗液一同收集，最終收集鹼蛋白液3800ml。(3)等電點法提取菌體蛋白沉澱及乾燥將上述收集的鹼蛋白液用5M鹽酸調pH，當pH值接近等電點時，控制加鹽酸速度，同時緩慢攪拌混均，用酸度計檢測溶液中pH的變化，當pH降至3.6時，產生的絮狀菌體蛋白沉澱達到濃度最大，停止加酸，室溫下靜置過夜，使溶液中的蛋白質充分沉澱，用乳膠管吸出上面透明的清液，收集留下的蛋白懸濁液進行噴霧乾燥，為保證樣品的均勻，在噴霧乾燥過程中，使用磁力攪拌器攪拌蛋白懸濁液，控制噴霧乾燥條件進風溫度150。C，最終得到黃色菌體蛋白粉60.5g。權利要求1.一種從廢菌絲體中提取蛋白質的方法，所用原料為發酵法生產衣康酸所產生的土麴黴廢菌絲體，包括廢菌絲體磨碎過篩、清洗、鹼液提取蛋白、過濾、蛋白沉澱及乾燥，步驟如下(1)廢菌絲體磨碎過40目篩，用0.6～1M的稀鹽酸清洗，除去廢菌絲表面雜質；(2)清洗乾淨的廢菌絲體用NaOH溶液提取菌絲體中的蛋白，提取條件為溫度85-90℃，NaOH溶液的濃度為0.5～0.8M，NaOH溶液與衣康酸廢菌絲體乾重的質量比為30～401，反應時間為8-9小時，反應完成後立即抽濾，收集液體部分，得蛋白提取液；(3)用鹽酸將上述蛋白提取液的pH調到菌體蛋白的等電點pH3～4，室溫下靜置2～6小時，當沉澱量不再增加時用離心機在4000rpm轉速下離心20-25分鐘，棄去上清液，留取蛋白沉澱；(4)向上述蛋白沉澱中加入3～5倍質量的蒸餾水，充分混和後進行噴霧乾燥，得到菌體蛋白。2.如權利要求1所述的從廢菌絲體中提取蛋白質的方法，其特徵在於，步驟(1)所述的稀鹽酸清洗方法如下先用0.61M的稀鹽酸清洗廢菌絲體，稀鹽酸用量與廢菌絲體乾重的質量比48:1，分兩次加入，第一次加24:l的鹽酸，放入恆溫振蕩器中於3(TC，160rpm條件下，充分混和12小時後，棄去液體部分，向固體部分加入剩餘鹽酸，同樣條件下混和25-32分鐘，用布氏漏鬥抽濾，第二次加入的鹽酸回收後重複使用，固體部分用48倍質量的水洗至p朋.07.0，抽濾。全文摘要本發明涉及一種從發酵法生產衣康酸的廢菌絲體中提取蛋白質的方法，首先將從衣康酸生產企業取來的土麴黴廢菌絲體進行磨碎、篩分及酸洗等預處理，然後在適宜的條件下用NaOH脫菌絲體蛋白，經過抽濾後收集得到的蛋白液，用酸調pH至菌體蛋白的等電點將菌體蛋白沉澱下來，離心洗滌後乾燥得到菌體蛋白。本發明方法提取菌體蛋白，原料成本低，操作方法簡單易行，得到的菌體蛋白中胺基酸種類豐富，含有多種畜禽自身不能合成的胺基酸，是一種優良的飼料蛋白來源。文檔編號C07K14/38GK101531714SQ20091002030公開日2009年9月16日申請日期2009年4月7日優先權日2009年4月7日發明者劉建軍,李丕武申請人:山東輕工業學院