用白細胞介素-10抑制移植物抗宿主病的製作方法

2023-05-31 19:12:46

專利名稱：用白細胞介素-10抑制移植物抗宿主病的製作方法
從總體上說本發明涉及一種經給患病個體施用有效量的白細胞介素-10來治療並抑制移植物抗宿主病或組織排斥的方法。
本發明涉及用白細胞介素-10(IL-10)抑制移植物抗宿主病或對移植組織的排斥。本發明也包括含白細胞介素-10或其活性變異體的藥物組合物。較好的是，本發明的白細胞介素-10選自由下列胺基酸序列定義的開放閱讀框架的成熟多肽組成的組中Met His Ser Ser Ala Leu Leu Cys Cys Leu Val Leu Leu Thr GlyVal Arg Ala Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser CysThr His Phe Pro Gly Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu ArgAsp Ala Phe Ser Arg Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp GlnLeu Asp Asn Leu Leu Leu Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe LysGly Tyr Leu Gly Cys Gln Ala Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe TyrLeu Glu Glu Val Met Pro Gln Ala Glu Asn Gln Asp Pro Asp IleLys Ala His Val Asn Ser Leu Gly Glu Asn Leu Lys Thr Leu ArgLeu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg Phe Leu Pro Cys Glu Asn LysSer Lys Ala Val Glu Gln Val Lys Asn Ala Phe Asn Lys Leu GlnGlu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp Ile Phe IleAsn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile Arg Asn和
Met Glu Arg Arg Leu Val Val Thr Leu Gln Cys Leu Val Leu LeuTyr Leu Ala Pro Glu Cys Gly Gly Thr Asp Gln Cys Asp Asn PhePro Gln Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg Val LysThr Phe Phe Gln Thr Lys Asp Glu Val Asp Asn Leu Leu Leu LysGlu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys Gln AlaLeu Ser Glu Net Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro GlnAla Glu Asn Gln Asp Pro Glu Ala Lys Asp His Val Asn Ser LeuGly Glu Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Ler Arg Arg Cys HisArg Phe Leu Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Gln Gln IleLys Asn Ala Phe Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys AlaMet Ser Glu Phe Asp Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr MetThr Ile Lys Ala Arg,其中，用標準的三字母縮寫表示L-胺基酸，並從N-末端開始。這兩種形式的IL-10有時指人IL-10(或人細胞激活素合成抑制因子)和病毒IL-10(或BCRF1)(分別如Moore et al.，Science，Vol.248，pgs.1230-1234(1990);Vieira et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.Vol.88，pgs.1172-1176(1991);Fiorentino et al.，J Exp.Med.Vol.170，pgs.2081-2095(1989);Hsuet al.，Science，Vol.250，pgs.830-832(1990))。更好是，本發明方法中所用的成熟IL-10或其變異體選自由下列胺基酸序列組成的組中
Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His PhePro Gly Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala PheSer Arg Val Lys The Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp AsnLeu Leu Leu Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr LeuGly Cys Gln Ala Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Gly GluVal Met Pro Gln Ala Glu Asn Gln Asp Pro AspIle Lys Ala HisVal Asn Ser Leu Gly Glu Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg LeuArg Arg Cys His Arg Phe Leu Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys AlaVal Glu Gln Val Lys Asn Ala Phe Asn Lys Leu Gln Glu Lys GlyIle Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp Ile Phe Ile Asn Tyr IleGlu Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile Arg Asn和Thr Asp Gln Cys Asp Asn Phe Pro Gln Met Leu Arg Asp Leu ArgAsp Ala Phe Ser Arg Val Lys Thr Phe Phe Gln Thr Lys Asp GluVal Asp Asn Leu Leu Leu Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe LysGly Tyr Leu Gly Cys Gln Ala Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe TyrLeu Glu Glu Val Met Pro Gln Ala Glu Asn Gln Asp Pro Glu AlaLys Asp His Val Asn Ser Leu Gly Glu Asn Leu Lys Thr Leu ArgLeu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg Phe Leu Pro Cys Glu Asn LysSer Lys Ala Val Glu Gln Ile Lys Asn Ala Phe Asn Lys Leu GlnGlu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp Ile Phe IleAsn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Ile Lys Ala Arg.


圖1是用於在哺乳動物細胞中表達IL-10所用的載體pcD(SRα)示意圖。
圖2是用於在細菌中表達IL-10所用的載體TRP-C11的示意圖。
圖3表示攜帶小鼠IL-10，病毒IL-10，或人-IL-10的開放閱讀框架(ORF)的質粒pGSRG，所述的開放閱讀框架插入在該質粒的Xho I限制性位點;該圖也表示最後構建體(稱為TAC-RBS)的RBS-ATG-多聚連接子區域的序列。
圖4表示在MLC中，內源和外源IL-10對增殖反應的影響。在濃度不斷增加的IL-10(空心帶)和抗-IL-10mAb(實心帶)存在的情況下，將PBMC(1×105/孔)和異基因的經輻射的PBMC(1×105/孔)[PBMC供體A×PBMC供體B(A);PBMC供體B×PBMC供體A(B)]培養5天。在沒有(實心帶)或存在(影線帶)100U/ml IL-10以及濃度不斷增加的抗-IL-10mAb(C)情況下，完成MLC。
圖5表示IL-10對用各種異基因的細胞刺激的純化T細胞增殖反應的影響。在濃度不斷增加的IL-10情況下，將純化T細胞(1×105/孔)與同種異體的輻射洗脫單核白細胞(2×104/孔)(A)，趨向性選擇出的CD14+單核白細胞(2×104/孔)(B)，純化的B細胞(3.3×104/孔)(C)，EBV-LCL(1×104/孔)(D)一起培養5天。
圖6表示IL-10效應的動力學如何取決於IL-10加到培養基中的時間。將PBMC(1×105/孔)和異基因的經輻射的PBMC(1×105/孔)培養5天。在指定的時間加入指定濃度的IL-10。
圖7表示在MLC中，IL-10對IL-2-生產的影響。用濃度不斷增加的IL-10並在有或沒有100μg/ml的抗-IL-2R抗體BB10存在的情況下，培養PBMC(1×105/孔)和異基因的經輻射的PBMC(1×105/孔)。三天後，收集上清液，用細胞激活素特異的ELISA法檢測其中的IL-2含量。
圖8表示外源IL-2對由IL-10誘導的減弱T細胞的異抗原-誘導的增殖反應的影響。在沒有(空心符號)或有(實心符號)100U/ml IL-10存在的條件的，將用異基因的經輻射的PBMC(105/孔)(A)，或純化的B細胞(3.3×104/孔)(B)刺激的純化T細胞(105/孔)與濃度不斷增加的IL-2一起培養。
本發明涉及一種用IL-10或其拮抗劑抑制個體如移植患者中的移植體抗宿主病或組織排斥的方法。本發明也包括用於實施該方法的含有IL-10的藥物組合物。本發明所用的IL-10選自由pH5C，pH15C，和pBCRF(SRα)[均寄存於美國典型培養物收集中心(ATCC)，Rockville，Maryland，寄存號分別為68191，68192和68193]的cDNA插入片段定義的開放閱讀框架編碼的成熟多肽以及其活性變異體如拮抗劑組成的組。拮抗劑包括突變蛋白和如加工、平截，糖基化作用的翻譯後變異體。
Ⅰ 白細胞介素-10檢測方法IL-10顯示出數種可作為檢測方法的依據和單位的生物活性。特別是，IL-10(各種)具有抑制由IFN-γ，淋巴細胞毒素，IL-2，IL-3組成的組中的至少一種細胞激活素以及T輔助細胞群體中的GM-CSF的合成的特性。這些T輔助細胞與提供同基因抗原的細胞(APCs)和抗原接觸後被誘導合成一種或多種上述細胞激活素。在該活性中，處理APCs以便它們不能複製，但它們的抗原加工機制仍保留其功能。在與T細胞混合前，如用約1500-3000R(γ或Ⅹ-射線)輻射APCs可很方便地完成上述處理。
另外，可以在不需使用同基因APCs的一級或較好的是二級混合淋巴細胞反應(MLR)中檢測細胞激活素的抑制作用。MLRs是現有技術中已知的，如Bradley，pgs.162-166，in Mishell et al.，eds.Selected Methods in Cellular Immunology(Freeman，San Francisco，1980);和Battisto et al.，Meth.in Enzymol.Val.150，pgs.83-91(1987)。總之，兩群異基因淋巴樣細胞混合，其中一群在混和前已經被處理過，如輻射，以阻止增殖。較好地是，在補充培養基，如用10%胎牛血清補充的RPMI1640中，以約2×106細胞/ml的濃度製備細胞種群。對於對照和檢測培養基，混和0.1ml的各種群進行檢測。對於二級MLR，用新鮮製備的，經輻射刺激物細胞再刺激在一級MLR中保持7天留下後的細胞。在混和時，將可能含IL-10的樣品加到檢測培養基中，並在混和後，1到3天，檢測對照和被檢測培養基中產生的細胞激活素。
用在Disabato.et al.，eds.，Mech.in Enzymol.Vol.108(1984)中詳細描述的本領域已知的技術得到用於IL-10檢測法的T細胞群和/或APC群。用於優選的IL-10檢測的APCs是外周血液單核白細胞。用標準技術，如由Boyum，Meth.in Enzymol.Vol.108，pgs.88-102(1984);Mage，Meth.in Enzymol.，Vol.108，pgs 118-132(1984);
上文列舉的細胞激活素的生物檢測方法也可用於確定IL-10活性。由Aggarwal，Meth.in Enzymol.，Vol.116pgs.441-447(1985)，和Matthews et al.，pgs.221-225，in Clemens.et al.，eds.，Lymphokines and InterferonsA.Practical Approach(IRL Press，Washington，D.C.1987)公開了有關人淋巴細胞毒素的生物檢測。可以用因子依賴性細胞系CTLL-2和KG-1(可從ATCC得到，寄存號分別為TIB214和CCL246)檢測人IL-2和GM-CSF。根據其具有刺激在軟瓊脂培養基上形成各種類型造血細胞菌落，如由Metcalf，The Hemopoietic Colony Stimulating Factors(Elsevier，Amsterdam，1984)的能力而檢測人IL-3。可以用抗-病毒檢測方法[如Meager，pgs.129-147，in Clemens et al.，eds.(上文引述的)]定量分析IFN-γ。參見，Roitt(1992)Encyclopedia of Immunolgy，Academic Press，New York;and Coligan(1992)and periodic supplements)Current Protocols in Immunology Greene/Wiley，New York。
也可以通過mRNA分析確定細胞激活素的生產。可以用如White et al.，J.Biol.Chem.Vol.257，pgs.8569-8572(1982)，和Gillespie et al.，美國專利4，483，920描述的細胞質點雜交方法檢測細胞激活素mRNAs。其它方法包括利用純化RNA的點印跡法[如Chaper 6，in Hames et al.，eds.Nucleic Acid Hybridization A Practical Approach(IRL Press，Washington.D.C.1985)]。
一些檢測IL-10活性的樣品需要預處理以除去可能影響檢測的預測定的細胞激活素。例如，在一些細胞中，IL-2提高IFN-γ的生產。因此根據檢測中所用的輔助T細胞，必需從被檢測樣品中除去IL-3。使樣品通過標準抗-細胞激活素親和柱可以很容易地完成上述清除。
為了方便，根據IL-10具有增加IL-4誘導的MC/9細胞(在美國專利4，559，310中描述並可以從ATCC得到，寄存號CRL8306)增殖的能力定義IL-10活性單位。1單位/ml被定義為在下列檢測中，IL-4水平上得到50%MC/9增殖最大刺激的IL-10濃度。在標準微滴定盤每孔50μl培養基中，製備IL-4和IL-10的兩倍或三倍稀釋物。上述培養基由RPMI1640，10%胎牛血清，50μM2-巰基乙醇，2mM穀氨醯胺，青黴素(100μ/L)和鏈黴素(100μg/L)組成。加入IL-4，即以25μl/孔的1600u/ml(最後濃度為400u/ml)稀釋於培養基中，並過夜培養，如20-24小時。以0.5-1.0μCi/孔加入3H-胸苷(如50μCi/ml在培養基中)並再過夜培養細胞，然後收集細胞並檢測摻入的放射活性。
可以按在如Sambrook et al.(1989)Molecular CloningA Laboratory Manual Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Horbor，New York;或Ausubel(1987and定期補充)Current Protocols in Molecular Biology Greene/Wiley，New York描述的重組方法;或，如在Atherton et al.(1989)Solid Phase Peptide SynthesisA Practical Approach IRL Press，Oxford描述的合成方法製備本文所述的IL-10變異體和類似物。
Ⅱ 純化和藥物組合物當本發明的多肽以可溶形式表達時，如作為轉化酵母或哺乳動物細胞的一種分泌產物，可以按現有技術中的標準方法，包括硫酸銨沉澱步驟，離子交換層析，凝膠過濾，電泳，親和層析，和/或等如「Enzyme Purification and Related Techniques」，Methods in Enzymology，22233-577(1977)純化它們;並且Scopes，R.，ProteinPurificationPrinciple and Practice(Cspringer-Verlag，New York，1982)提供上述純化方法的指導。另外，當本發明的多肽以可溶形式表達時，如作為集合物，內含體等等，可以用現有技術中的標準方法純化它們，包括從破裂的宿主細胞中經離心分離內含體，用離液序列高的以及還原劑，溶解內含體，稀釋溶解的混和物，並降低離液序列高的試劑和還原劑的濃度，以便使多肽具有生物活性結構。在下列文獻中公開了上述方法中的後者，這些文獻引入本文作為參考Winkler et al.，Biochemistry，254041-4045(1986);Winkler et al.，Biotechnology，3992-998(1985);Koths et al.，美國專利4，569，790;和歐洲專利申請86306917.5和86306353.3。
本文所用的「有效量」是指足以減少或抑制移植物抗宿主病或組織排斥的量(參見，如Paul(1989)，Fundamental Immunology Raven Press，New York)。可以根據如移植組織的狀態，類型，數量，患者的總體健康，施用的方法，副作用的嚴重程度等等改變對於特定患者的有效量。通常，IL-10作為含有效量IL-10和藥物學載體的藥物組合物施用。藥物學載體可以是適於將本發明的組合物釋放給患者的任何相容的，無毒物質。通常，上述藥物的非腸道施用的組合物是已知的，如，Remington's Pharmaceutical Science，15th.Ed.(Mack Publishing Company，Easton，PA1980)。另外，可以用可植入或可注射的藥物傳遞系統，如Urquhart et al.，Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.，Vol.24，pgs.199-236(1984);Lewis，ed.Controlled Release of Pesticides and Pharmaceuticals(Plenum Press，New York，1981);美國專利3，270，960等等將本發明的組合物導入患者體內。
當非腸道施用時，以一單位劑量可注射形式(溶液，懸浮液，乳劑)與藥物學載體結合配製IL-10。上述載體的實例是常規鹽水，格林氏溶液，葡萄糖溶液，和Hank's溶液。也可以使用非水載體如固定油，油酸乙酯。優選的載體是5%葡萄糖/鹽水。載體可含有少量附加物質如可增加等滲性和化學穩定性的物質，如緩衝液和防腐劑。最好以基本上沒有集合體和其它蛋白的純化形式，以約5到20μg/ml的濃度配製IL-10。最好以連續注入施用IL-10，以便每天釋放約50-800μg範圍的量(即約1-16μg/Kg/天)。在監測副作用和血液細胞數的基礎上，變化每天的注入速率。
實施例下列實施例用於說明本發明。選用的載體和宿主，試劑的濃度，溫度和其它變量值僅僅是為說明本發明的應用且不能認為是其限制值。
實施例1.在細菌宿主中表達人CSIF從許多化學合成的雙鏈DNA片段中裝配合成的人CSIF以形成稱作TAC-RBS-hCSIF的表達載體。在標準細菌系統，如大腸桿菌K-12菌株JM101，JM103等等[由Viera and Messing，in Gene，Vol.19，pgs.259-268(1982)中描述]完成克隆和表達。用標準方法[如Maniatis et al.，Molecular CloningA Laboratory Manul(Cold Spring Harbor Laboratory，New York，1982)]完成限制酶消化和連接酶反應。
將鹼性方法(Maniatis et al.，上文引述的)用於小規模質粒製備。為了大量製備，使用一種改進的鹼性方法，其中使用等體積異丙醇以便從澄清的溶胞產物中沉澱核酸。在氯化銫等密度離心前用冷2.5M乙酸銨進行沉澱除去RNA，並用溴化乙錠檢測。
為了過濾雜交物，使用Whatman 540過濾循環以便檢出菌落，然後將其溶解並用0.5MNaOH，1.5M NaCl;1M Tris HCl PH8.0，1.5M NaCl(每次2分鐘)連續處理固定，並在80℃加熱2小時。在42℃用32P-標記(激酶處理)的合成DNAs將其在6×SSPE，50%甲醯胺，0.1%十二烷基磺酸鈉(SDS)，100μg/ml大腸桿菌tRNA中雜交6小時(在800ml H2O中溶解174g NaCl，27.6g NaH2PO4·9H2O，和7.4g EDTA，用NaOH將PH調到7.4，將體積加到1升，並用高壓蒸汽滅菌整個溶液而製備20×SSPE)。用1×SSPE;0.1%SDS將濾紙衝洗兩次(15分鐘，室溫)。放射自顯影(Fwji RX膠片)後，用在濾紙上的蘭-斑菌落對照再生長菌落以便定位陽性菌落。用Sanger et al.Pro.Natl.Acad.Sci.，Vol.74pg.5463(1977)的雙脫氧方法測定DNA序列。雙脫氧反應的模板是再克隆到M13mp載體中的相關區域的單鏈DNAs[如，Messing et al.，Neccleic Acids Res.，Vol.9，pg.309(1981)];或者是用微鹼性方法並用0.2M NaOH變性(5分鐘，室溫)，加入2體積乙醇從0.2M NaOH，1.43M乙酸銨中沉澱而製備的雙鏈DNA。用Applied Biosystems 380A合成器經phosphoramidite化學法合成DNA。按380A合成器的操作說明進行合成，去保護，裂解和純化(7M脲PAGE，洗脫，DEAE-纖維素層析)。
將需克隆的合成DNAs的互補鏈(各400ng)混和，並在50μl反應體積中用多核苷酸激酶磷酸化。將該DNA與用適當限制酶消化的1μg載體DNA連接，連接反應在室溫下在50μl體積中進行4到12小時。磷酸化，限制酶消化，多聚酶反應，以及連接反應的條件已有描述(Maniatis et al.，上文引述的)。通過將於培養於用氨苄青黴素，異丙基-1-硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)(0.4mM)和5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷(X-gal)(40mg/ml)補充的L瓊脂平板上而篩選lacZ+的菌落(如果需要)。
用DNA多聚酶填平帶tacP的質粒pDR540(Pharmacia)的單個BamHI位點，來構建TAC-RBS載體。然後將該載體與未磷酸化的合成寡核苷酸(Pharmacia)連接，形成編碼同感核糖體結合位點(RBS GTAAGGAGGTTTAAC)的雙鏈片段。連接後，將混和物磷酸化並再將其與SstI連接子ATGAGCTCAT連接。再用SetI和EcoRI裂解該複合體，用聚丙烯醯胺凝膠電泳(PAGE)分離173個鹼基對(bp)片段，並將其克隆到EcoRI-SstI-限制的pUC19(Pharmacia)(如下文所述)中。在圖2中表示了最後構建體(稱作TAC-RBC)的RBC-ATG-多聚連接子區域的序列。
用8個步驟將合成的IL-10基因裝配到UC19質粒中。在進行將pUC19的lacZ(α)基因保留在帶有步驟1中插入的ATG起始密碼子的框架中的克隆後，可以檢測每個步驟中沒有缺失和/或插入的插入片段。在含X-gal和IPTG的L-氨苄青黴素平板上獲得蘭菌落，從而可以過濾去除含缺失和/或插入改變的克隆。另外，在小規模的質粒DNA製備中，用通用的定序引物，如可從Boehringer Mannheim得到，可以很容易地確定每個步驟中插入片段的序列。
在步驟1，用SstI消化TAC-RBS載體，用T4DNA多聚酶(其3′-核酸外切酶活性消化SstI切割物3′-突起鏈以形成平整末端片段)處理，在T4DNA多聚酶失活後，用EcoRI處理以形成含TAC-RBS區並在ATG起始密碼子有平整末端，且在相對的末端有EcoRI切割的173bp片段，最後，分離173bpTAC-RBS片段。
在步驟2中，將步驟1分離的TAC-RBS片段與EcoRI/KpnI-消化的質粒pUC19和合成片段1A/B混和，如下文所示，1A/B片段在其上遊末端有一個平整末端，在其下遊末端有相應於KpnI切割的交叉末端。將KpnI末端連接至BstEⅡ位點的下遊。連接上述片段以形成步驟2的pUC19。
在步驟3中，將合成片段2A/B和3A/B(下文所示)與步驟2的BstEⅡ/SmaⅠ-消化的pUC19(擴增和純化後)混和，並將其連接以形成步驟3的pUC19。應該說明，片段3A/B的下遊末端含有形成SmaⅠ平整末端的額外的鹼基。在步驟4中裂解這些額外的鹼基。另外，片段2A/B和3A/B有互補的9-殘基單鏈末端，這兩個末端在混和時退火，將得到的2A/B的上遊BstEⅡ切割點和3A/B的下遊平整末端與pUC19連接。
在步驟4中，用AflⅡ/XbaⅠ消化步驟3的pUC19，將其擴增，純化，再純化，與合成片段4A/B(下文所示)混和，並連接形成步驟4的pUC19。
在步驟5中，用XbaⅠ/SalⅠ消化步驟4的pUC19，將其擴增並純化，與合成片段5A/B(下文所示)混和，並連接形成步驟5的pUC19。應注意的是，在步驟6中，用HpaⅠ消化除去片段5A/B的SalⅠ-交叉末端。
在步驟6中，用HpaⅠ/PstⅠ消化步驟5的pUC19，將其擴增，純化，與合成片段6A/B(下文所示)混和並連接形成步驟6的pUC19。
在步驟7中，用ClaⅠ/SphⅠ消化步驟6中的pUC19，將其擴增，純化，與合成片段7A/B(下文所示)混和並連接形成步驟7的pUC19。
在步驟8中，用MluⅠ/HindⅢ消化步驟7的pUC19，將其擴增，純化，與合成片段8A/B和9A/B混和並連接形成最後的構建體，然後用標準技術將該構建體插入到大腸桿菌K-12菌株JM101(如可從ATCC得到，寄存號為33876)。培養後，從JM101細胞中提取蛋白質，並稀釋提取物，檢測其生物活性。
AGCCCAGGCC AGGGCACCCA GTCTGAGAAC AGCTGCACCC ACTTCCCAGG-TCGGGTCCGG TCCCGTGGGT CAGACTCTTG TCGACGTGGG TGAAGGGTCC-tAACCggtacaTTGGc片段1A/BGtAACCTGCC TAACATGCTT CGAGATCTCC GAGATGCCTT CAGCAGAGTG-GACGG ATTGTACGAA GCTCTAGAGG CTCTACGGAA GTCGTCTCAC-AAGACTTTCT TTTTC片段2A/BCAAATGAAGG ATCAGCTGGA CAACTTGTTc TtAAGTGAAAGAAA GTTTACTTCC TAGTCGACCT GTTGAACAAg AaTTC片段3A/BGAGTCCTTGC TGGAGGACTT TAAGGGTTAC CTGGGTTGCC AAGCCTTGTC-CTCAGGAACG ACCTCCTGAA ATTCCCAATG GACCCAACGG TTCGGAACAG-TGAGATGATC CAGTTTTAtACTCTACTAG GTCAAAATaG AtC片段4A/BCTaGAGGAGG TGATGCCCCA AGCTGAGAAC CAAGACCCAG ACATCAAGGC-GAtCTCCTCC ACTACGGGGT TCGACTCTTG GTTCTGGGTC TGTAGTTCCG-GCATGTtAAC gCGTACAaTTG cagctFr片段nt5A/BAACTCCCTGG GGGAGAACCT GAAGACCCTC AGGCTGAGGC TACGGCGCTG-TTGAGGGACC CCCTCTTGGA CTTCTGGGAG TCCGACTCCG ATGCCGCGAC-TCATCGATct gcaAGTAGCTAg片段6A/BCGATTTCTTC CCTGTCAAAA CAAGAGCAAG GCCGTGGAGC AGGTGAAGAA-TAAAGAAG GGACAGTTTT GTTCTCGTTC CGGCACCTCG TCCACTTCTT-
cGCgTgcatggCGcAc片段7A/BCGCGTTTAAT AATAAGCTCC AAGACAAAGG CATCTACAAA GCCATGAGTG-AAATTA TTATTCGAGG TTCTGTTTCC GTAGATGTTT CGGTACTCAAGTTTGAC片段8A/BATCTTCATCA ACTACATAGA AGCCTACATG ACAATGAAGA-CTCAAACTG TAGAAGTAGT TGATGTATCT TCGGATGTAC TGTTACTTCT-TACGAAACTG AATGCTTTGAC Ttcga片段9A/B(小字母說明鹼基不同於同樣位點的天然序列)。
實施例2.在COS7猴細胞中表達vIL-10用引物，經多聚酶鏈反應擴增編碼vIL-10的開放閱讀框架的基因，該引物可使擴增片段然後插入到EcoRⅠ-消化的pcD(SRα)載體(圖1)中。下列表示插入片段的編碼鏈(用大寫字母表示開放閱讀框架)。
aattcATGGA GCGAAGGTTA GTGGTCACTC TGCAGTGCCT GGTGCTGCTTTACCTGGCAC CTGAGTGTGG AGGTACAGAC CAATGTGACA ATTTTCCCCAAATGTTGAGG GACCTAAGAG ATGCCTTCAG TCGTGTTAAA ACCTTTTTCCAGACAAAGGA CGAGGTAGAT AACCTTTTGC TCAAGGAGTC TCTGCTAGAGGACTTTAAGG GCTACCTTGG ATGCCAGGCC CTGTCAGAAA TGATCCAATTCTACCTGGAG GAAGTCATGC CACAGGCTGA AAACCAGGAC CCGGAGGCTAAGGACCATGT CAATTCTTTG GGTGAAAATC TAAAGACCCT ACGGCTCCGCCTGCGCAGGT GCCACAGGTT CCTGCCGTGT GAGAACAAGA GTAAAGCTGTGGAACAGATA AAAAATGCCT TTAACAAGCT GCAGGAAAAA GGAATTTACAAAGCCATGAG TGAATTTGAC ATTTTTATTA ACTACATAGA AGCATACATGACAATTAAAG CCAGGTGAg
通過vIL-10表達和/或限制消化的電泳圖譜來鑑別在正確方向攜帶插入片段的克隆。將一個帶vIL-10基因的上述載體稱作pBCRF1(SRα)且寄存於ATCC，寄存號為68193。在大腸桿菌MC1061中擴增pBCRF1(SRα)，用標準技術分離，並按如下方法用於轉染COS7猴細胞轉染前一天，將約1.5×106COS7猴細胞播種於單個的100mm盤中的Dulbecco's改良Eagle培養基(DME)，該培養基含5%胎牛血清(FCS)和2mM穀氨醯胺。為了完成轉染，與胰蛋白酶一起培養從盤中取出COS7細胞，用無血清DME洗滌兩次，並在無血清DME中懸浮該細胞，達到107細胞/ml。將0.75ml樣品與20μgDNA混和，並將其轉移到無菌的0.4cm電穿孔小容器中。10分鐘後，在Biokad Gene脈衝儀裝置中，以200瓦，960μF脈衝細胞。再經10分鐘後，從小容器中取出細胞，並將其加到20ml含5%FCS，2mM穀氨醯胺，青黴素，鏈黴素，和慶大黴素的DME中。將混和物等分到4個100mm組織培養盤中。在37℃，5%CO212到24小時後，用僅含1%FCS的相似培養基代替上述培養基，並在37℃，5%CO2繼續培養72小時，收集培養基後，檢測其抑制IFN-γ合成的能力。
在37℃，將10ml新分離的PBLs樣品(約2×106細胞/ml)與PHA(100ng/ml)一起在由(ⅰ)補充了5%FCS和2mM穀氨醯胺的90%DME，和(ⅱ)預先用pBCRF1(SRα)轉染的10%COS7上清液組成的培養基中培養。24小時後，收集細胞和上清液以便分別檢測是否存在IFN-γ mRNA或IFN-γ蛋白質。對照實驗的處理相同，但不同的是10%上清液是從用攜帶不相關的cDNA插入片段的質粒預先轉染的COS7培養物中收集的。與對照組比較，vIL-10-處理的樣品表現出抑制約50%的IFN-γ合成。
實施例3 在大腸桿菌中表達vIL-10-10在大腸桿菌中可以表達編碼下列成熟vIL-10的基因Thr Asp Gln Cys Asp Asn Phe Pro Gln Met Leu Arg Asp Leu ArgAsp Ala Phe Ser Arg Val Lys Thr Phe Phe Gln Thr Lys Asp GluVal Asp Asn Leu Leu Leu Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe LysGly Tyr Leu Gly Cys Gln Ala Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe TyrLeu Glu Glu Val Met Pro Gln Ala Glu Asn Gln Asp Pro Glu AlaLys Asp His Val Asn Ser Leu Gly Glu Asn Leu Lys Thr Leu ArgLeu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg Phe Leu Pro Cys Glu Asn LysSer Lys Ala Val Glu Gln Ile Lys Asn Ala Phe Asn Lys Leu GlnGlu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp Ile Phe IleAsn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Ile Lys Ala Arg.
在pBCRF1(SRα)的cDNA插入片段再克隆到經位點特異性誘變改變兩次的M13質粒中第一次在該成熟vIL-10多肽編碼區的5′-末端形成ClaⅠ位點，第二次在該成熟vIL-10多肽編碼區的3′-末端形成BamHⅠ位點。然後很容易將突變序列插到下文所述的TRPC11表達載體中。
通過將合成的同感RBS片段與ClaⅠ連接子(ATGCAT)並將所得片段克隆至ClaⅠ-限制的pMT11hc(已預先修飾以含有ClaⅠ位點)來構建TRPC11載體。pMT11hc是一個小(2.3Kb)的高拷貝，pBR322的AMPR，TETS衍生物，它帶πVX質粒的EcoRⅠ-HindⅢ多聚連接子區域(πVX由Maniatis et al.，Molecular CloningA Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory，1982描述)。通過用EcoRⅠ和BamHⅠ限制性切割pMT11hc，填平所得的粘性末端並用CalⅠ連接子(CATCGATG)連接，由此恢復EcoRⅠ和BamHⅠ位點，並用ClaⅠ位點代替SmaⅠ位點，這樣修飾pMT11hc使其包含ClaⅠ位點，來自TRPC11構建體的一個轉化體在ClaⅠ位點側面有串聯RBS序列，通過用PstⅠ消化該質粒，用Bal31核酸酶處理，用EcoRⅠ限制並在全部四種三磷酸脫氧核苷酸存在的情況下用T4DNA多聚酶處理，從而除去該質粒中的一個ClaⅠ位點和部分RBS序列的第二拷貝。用PAGE回收所得的30-40bp片段，並將其克隆到SmaⅠ限制的pUC12。然後將從pKC101[由Nichols et al.，in Methods in Enzymology，Vol.101，pg.155(Academic Press，N.J.1983描述的)]得到的攜帶有大腸桿菌色氨酸啟動子248bp的大腸桿菌片段克隆到EcoRⅠ位點以完成TRPC11構建體，說明見圖2。通過首先用ClaⅠ和BamHⅠ消化TRPC11，將其純化，然後在標準連接溶液中將其與含成熟BCRF1核苷酸編碼序列的M13的ClaⅠ-BamHⅠ片段混和，從而將TRPC11用作為vIL-10的載體。含TRPC11的插入片段稱為TRPC11-BCRF1，在大腸桿菌K12菌株JM101(如可從ATCC，寄存號33876得到)中繁殖該片段。
實施例4本實施例在本文件的優先權日以後由Bejarano等人(1992)International Immunology 41389-1397公開。它提供了在適當的體外環境下IL-10治療效果的證明。尤其是，它說明IL-10抑制異源基因的增殖以及在一級混和淋巴細胞培養物(MLC)中產生的細胞毒性T細胞反應。
該實施例顯示IL-10如何以劑量依賴性方式抑制異抗原誘導的增殖反應。當在培養開始時加入IL-10，抑制效果最好，這說明它在T細胞活化早期起作用。存在抗-IL-10mAb情況下，增強增殖反應，這說明內源產生的IL-10在一級MLC中抑制增殖。當刺激物細胞是被照射的異基因外周血液單核細胞(PBMC)，純化單核白細胞或B細胞時，仍可觀察到IL-10的抑制效果。高濃度的外源IL-2不能恢復減弱的增殖反應，這說明IL-10的影響不僅僅與IL-2合成的抑制有關。另外，IL-10可以減少在一級MLC中IL-2，IFN-γ，IL-6，GM-CSF和TNF的生產而存在抗-IL-10mAb時，增加其生產。在IFN-γ生產中觀察到最大效果。雖然IL-10減弱增殖反應，但在IL-10處理的培養物和對照組中，CD3+CD4+和CD3+CD8+T細胞的比率保持不變。然而，存在IL-10時，按CD25+和HLA-DR+表達判斷激活的CD3+T細胞的百分比一直減少。
IL-10抑制異特異性的增殖反應和細胞激活素生產。另外，證明外源IL-12不能恢復減弱的增殖反應，暗示IL-10通過減弱刺激物細胞的刺激能力而明顯地抑制異特異性的增殖T細胞反應。
這些資料說明，在體外，IL-10對異基因反應有重要的調節作用。
培養基和試劑在用10%採集的熱激活人AB血清補充的Yssel's培養基中培養細胞(參見Yssel et al.，(1986)Eur.J.Immunol.161187-)。
製備抗vIL-10的中和性抗-IL-10mAb 19F1並有效地抑制hIL-10和vIL-10(參見Bejarano et al.(1985)Int.J.Cancer 35327;和ATCC寄存物HB10487，寄存日1990年6月28)。認別IL-2Rp55鏈的BB10mAb是Dr.J.Wijdenes友好地贈送的禮物(CRTS，Besancon，France;參見Herve et al.(19-)Blood 751017-1023)。從Becton-Dickinson(Mountain View，CA)購買鼠抗-CD3(抗-Leu-4，IgG1)，抗-CD4(抗-Leu-3a，IgG1)，抗-CD8(抗-Leu-2a，IgG2a)，抗-CD14(抗-Leu-M3，IgG2b)，抗-CD19(抗-Leu-12，IgG1)，抗-CD25(抗-IL-2R P55，IgG1)，抗-CD56(抗-Leu-19，IgG1)，抗-HLA-DR(克隆L243，IgG2a)mAb和適當的異型對照mAb。
細胞製劑從Blood Bank of Stanford University Hospital得到血沉棕黃色層製劑。通過在Ficollhypaque(Pharmacia，Uppsala，Sweden)密度梯度離心分離PBMC。
為了純化T細胞，通過塑料吸附和鐵吞噬作用消耗盡PBMC單核細胞(參見Bejarano et al.(1985)Int.J.Cancer 35327-)。非吸附細胞通過尼龍棉(Julius et al.(1973)Eur.J.Immunol.3645-)，藉助磁粉小珠除去NK細胞。簡單地說，用飽和濃度的抗-CD56mAb在4℃，染色30分鐘後，用Hanks's平衡鹽溶液(HBSS)，洗滌兩次並且隨後用羊抗-小鼠IgG(Dynbeads M-450羊抗-小鼠IgG，Dynal AS，Oslo，Norway)包被的磁珠以珠∶細胞40∶1的比率完成玫瑰花實驗。在按製造商建議用磁性顆粒濃縮器除去玫瑰細胞前，在緩慢振動下於4℃將混合物培養30分鐘。所得的細胞製劑＞99%CD3+，＜1%CD14+，＜1%CD19+，＜1%CD56+。
為了分離CD14+單核細胞，用PE共軛的CD14mAb(Becton-Dickinson，Mountain View，CA)給PBMC染色，在HBSS中洗滌兩次，然後用FACStar-Plus(Becton-Dickinson，Sunnyvale，CA)將其分CD14+和CD14-群體。再分析經分類的群體表明，大於99.5%的純化細胞是CD14+。在部分實驗中，通過在血液組分分離器中經密度離心從外周血液分離單核細胞，接著離心淘選(參見，Figdor et al.(1984)J.Immunol.Methods 6868-)。根據非特異性酯酶染色判斷，這些單核細胞製劑的純度大於95%。
用磁性小珠耗竭得到純化B淋巴細胞。簡單地說，在4℃，將非吸附的PBMC與飽和濃度的抗-CD3，抗-CD4，抗-CD8，抗-CD14和抗-CD56mAbs一起培養30分鐘。用HBSS洗滌細胞兩次，用羊抗-小鼠IgG(Dynal AS，Oslo，Norway)包被的磁性小珠以40∶1的小珠∶細胞比率做玫瑰花實驗。隨後，按上面所述耗竭玫瑰花細胞。所得的群體含大於98%的CD19+細胞。
增殖檢測用各種經輻射的(4000rad)異基因刺激物細胞刺激PBMC或高度純化的T細胞(1×105細胞/孔)。將PBMC，CD14+單核細胞，經離心淘洗分離的單核細胞，以及純化的B淋巴細胞，分別以R∶S1∶1，5∶1，5∶1和3∶1的比率用作刺激物細胞。在200μl培養基中，沒有(實心圖5-7)(或有(影線柱)IL-10的情況下，在96孔平底微滴定板設置三個重複完成培養。
在5天培養期間的最後10小時用[3H]TdR脈衝培養物並將其收集到的纖維玻璃濾器上，用液體閃爍計數器測定放射性。在圖4中將結果表示成[3H]TdR摻入的c.p.m，且代表三個重複培養物的方式。
大量培養以上述的R∶S比率，在50ml燒瓶中，以1×106反應細胞/ml濃度在有或沒有100U/ml IL-10的情況下，將PBMC或高度純化的T細胞與經輻射的異基因細胞一起培養。5至6天後，收集上清液，在-20℃將其冷凍以確定它們的細胞激活素含量，回收細胞以進行表型分析。
螢光分析在4℃，將從大量培養中回收的細胞(105)在V-底的微滴定盤(Flow Laboratories，Mclean，Va)中與10μl純化的PE共軛的mAb一起培養30分鐘，在雙標記實驗中，在FITC標記後，用1%正常小鼠血清將細胞洗滌兩次，加入PE共軛的mAb。用含1%BSA和0.02M NaN3的HBSS將細胞洗滌兩次，然後在FACScan上分析。
淋巴細胞激活素的測定用淋巴細胞激活素特異的ELISA(Bacchetta et al.(1989)J.Immunol.144902-)檢測從5到6天的大量培養物中收集的上清液中GM-CSF，IFN-γ，TNF-α，IL-2，IL-4，IL-5和IL-6含量。為了測定IL-2產生的量，在存在10mg/ml抗-IL-2受體抗體BB10的情況下進行培養以減少IL-2消耗。72小時後，收集上清液，並用特異的ELISA確定IL-2水平。各種ELISA的敏感性是對IL-4為40pg/ml;對IL-2，IL-5和IL-6為20pg/ml;對GM-CSF為50pg/ml;對TNF-α和IFN-γ為100pg/ml。
在MLC中IL-10抑制增殖反應為了確定典型的一條途徑一級MLC中IL-10對增殖反應的影響，在沒有或有各種濃度IL-10的情況下用異基因PBMC刺激PBMC。圖4表明，IL-10以劑量依賴性方式抑制增殖反應。在1U/ml低的IL-10濃度，就已經觀察到顯著的抑制效果，而在100U/ml的IL-10濃度得到最大抑制效果(在不同實驗中，從33-95%的抑制範圍)。這些IL-10的抑制效果完全由抗-IL-10mAb中和，從而說明抑制的特異性(圖4C)。事實上，在存在中和抗-IL-10mAb的情況下進行的MLC中的增殖反應被顯著地增強，這說明內源產生的IL-10具有抑制一級MLC中的增殖反應的能力。
在MLC中單核白細胞對IL-10抑制效果的影響已經知道通過向下調節Ⅱ型MHC抗原，IL-10大大減弱單核白細胞提供Ag(Ap)的能力。相反，Epstein-Barr病毒(EBV)-轉化的B細胞(EBV-轉化的淋巴樣幹細胞系EBV-LCL)的Ap-能力和Ⅱ型MHC表達不受IL-10的影響。
在該實驗中，將經負選擇得到的高度富集的T細胞用作反應器細胞。將經離心淘洗或由從PBMC，純化的B淋巴細胞，和EBV-LCL直接分離的CD14+細胞而富集的純化單核白細胞群體用作刺激器細胞。IL-10大大地抑制由異基因單核白細胞獨立誘導的增殖反應，所述的單核白細胞是經離心淘洗(圖5a)或由FACS(圖5b)正挑選得到的;而對異基因EBV-LCL的增殖反應不受影響(圖5d)。按照對可溶性抗原的特異性增殖反應所觀察的，這些結果表明，當異基因單核白細胞，但不是異基因EBV-LCL用作刺激器細胞時，異基因增殖被阻斷。由剛分離的高度純化的異基因B細胞誘導的增殖反應也由IL-10抑制(圖5c)，說明儘管IL-10對這些細胞的Ⅰ型或Ⅱ型MHC表達沒有可測量的影響，但當B細胞用作刺激器時，也存在IL-10的抑制效果。
動力學實驗表明，IL-10對MLC-誘導的增殖的影響隨時間逐步降低。當在一級培養開始時加入IL-10，有最大效果，如果在培養開始後2或3天加入，則有臨界效果且觀察到不清楚的劑量反應影響(圖6)。這些結果說明IL-10在MLC中T細胞激活作用早期起作用。
IL-10在MLC中抑制細胞激活素生產已經證明IL-10降低由抗-CD3或PHA激活的PBMC生產的IFN-γ和GM-CSF。另外，IL-10抑制由單核白細胞生產的細胞激活素。為了確定IL-10對單途徑MLC中細胞激活素生產的影響，將異基因PBMC用作反應器和刺激器細胞。在沒有或有IL-10或抗-IL-10mAb的情況下完成培養，在第5天收集上清液且檢測其細胞激活素含量。表1表示在MLC中生產的IFN-γ，IL-6，GM-CSF和TNF-α，且IL-10在各種程度上抑制這些細胞激活素的生產。未檢測到顯著的IL-4生產，且IL-5的水平低於100pg/ml。在不同實驗中，IL-10的生產量從1000到3000pg/ml。在IFN-γ的生產中觀察到最弱的抑制效果。
在有抗-IL-10mAb完成的MLC(表1)的上清液中觀察IFN-γ，GM-CSF和TNF-α的水平得到提高。抗-IL-10mAb對細胞激活素生產的這些增強作用是劑量依賴性的。綜上所述，這些結果表明內源和外源IL-10降低所檢測的細胞激活素的生產。為估算在MLC中IL-10對IL-2生產的影響且為了降低由激活的T細胞消耗IL-2，在有或沒有IL-10和抗IL-2受體mAb BB10的情況下進行培養。在這些實驗中，IL-10以劑量依賴性方式抑制IL-2生產(圖7)。當以100U/ml加入IL-10時，沒有檢測到可檢測水平的IL-2。
表1外源和內源IL-10對由異抗原刺激的淋巴細胞生產細胞激活素的影響條件 細胞激活素IL-10 αIL-10 IL-6 IL-10 GM-CSF TNF-α IFN-γA 0 22.2 572 109 79 11 20.5 41 61 110 13.0 11 38 1100 12.1 16 47 10.05 22.9 144 144 10.5 25.8 165 111 15 24.9 172 51 1A+B 0 35.4 1473 1744 141 29.51 35.3 928 151 20.810 23.9 784 82 18.1100 24.7 612 66 11.40.05 36.9 2372 137 33.10.5 39.1 2355 137 45.35 39.1 3487 250 43.8在沒有和有IL-10或抗IL-10mAb 19F1的情況下，將人PBMC(A)單獨或與異基因輻射的PBMC(B)一起培養5天。用細胞激活素特異的ELISA法，確定上清液中細胞激活素的生產。
表1表示四個實驗之一的效果。
由外源IL-2不能恢復IL-10的抑制影響為了研究是否在有外源IL-2的情況下觀察到IL-10的抑制效果，用各種濃度的IL-2進行MLC。圖8表示，向MLC中加入其量連續增加的IL-2時(其中，純化的T細胞用作反應器和PBMC或純化的B細胞用作刺激器)，在沒有和有IL-10的情況下，增殖都得到加強。然而，當以高至100U/ml的濃度加入IL-2時，仍然有IL-10的抑制影響;且應該說明10U/ml足以飽和高親和度的IL-2R。相似地，當加入有T細胞生長因子活性的400U/ml IL-4時，不能恢復由IL-10誘導的降低的增殖反應。綜上所述，這些結果說明，在有IL-10的情況下完成MLC時，IL-2的缺乏不是導致所觀察的降低的增殖反應的限制因子。
IL-10降低MLC激活T細胞的比例為了確定存在IL-10的情況下在MLC中增殖反應的降低是否不同程度地影響CD4+或CD8+T細胞亞群，確定CD3+CD4+和CD3+CD8+細胞的比例。表2中表示當用異基因PBMC，純化單核白細胞，或B細胞在IL-10存在的情況下刺激T細胞時，T細胞總數降低30到60%。然而CD4+和CD8+T細胞的比例相同，這說明IL-10對每一個T細胞亞群沒有優先的影響。
相反，在含IL-10的培養物中，激活T細胞表達的CD25和HLA-DR抗原的比例持續降低。用純化B細胞或單核白細胞刺激純化的CD3+T細胞時，在MLC中通常可觀察到最大程度的減少。
表2IL-10對異抗原刺激的T細胞的影響
a)說明沒有IL-10b)ND＝未做c)負挑選的單核白細胞d)正挑選的單核白細胞(CD14+)在沒有或有IL-10(100U/ml)的情況下，將純化的T細胞與經輻射的異基因PBMC，純化B細胞或單核白細胞一起培養。6天後，用間接的免疫螢光法計數並表型分析回收的T細胞。
呈現的結果表明在典型單途徑一級MLC中，IL-10以劑量依賴的方式減少異反應性T細胞的增殖，其中，兩種不同供體的異基因PBMC被分別用作反應器和輻射的刺激器細胞。用抗-IL-10mAb可完全中和這些抑制效果，從而表明抑制作用的特異性。另外，已表明在存在抗-IL-10mAb的情況下，顯著地增強增殖反應，這說明內源IL-10的產生導致MLC中增殖反應的抑制。
將高度純化的T細胞用作反應器和以純化單核白細胞用作刺激器時，IL-10也降低MLC中的增殖反應。有意思的是，當由經輻射的異基因EBV-LCL刺激純化的T細胞時，IL-10沒有效力(參見圖5b)。這些資料與前面的研究結果一致，即當以單核細胞，但不是EBV-LCL用作抗原遞呈細胞(APC)時，IL-10明顯地阻礙T細胞或T細胞克隆對可溶抗原或抗原肽的特異性增殖反應。發現這種降低的抗原遞呈能力與IL-10對單核白細胞Ⅱ型MHC表達的下降調節有關。相反，IL-10不影響EBV-LCL的表達Ⅱ型MHC。從這些資料得出結論，降低的抗原特異性的增殖T細胞反應反映了反應器細胞激活作用的阻礙，而不是對T細胞增殖的直接抑制影響。存在IL-10的情況下激活的反應器T細胞克隆中減弱的Ca2+流動進一步支持該結論。
不僅在以單核白細胞用作刺激器而且使用純化的B細胞時，IL-10也抑制MLC-誘導的增殖。數項研究已經表明，MHC異抗原的T細胞識別在機制上與病毒，細菌，或其它外源蛋白抗原的識別相似。最近，已經證明顯著比例的MHCⅡ型異反應活性的T細胞克隆識別與異基因Ⅱ型分子相關的經加工的人血清蛋白的抗原決定簇。在相反的情況中，需要形成新的MHC-肽複合體以激活抗原特異的T細胞克隆，沒有跡象表明必須在單核白細胞和B細胞上形成新的異-MHC-肽複合體以刺激MLC中的T細胞。而且，IL-10不影響在人B細胞上表達Ⅱ型MHC膜。因此，這是不相似的，IL-10對MLC-誘導的T細胞增殖的抑制影響能夠完全歸因於對單核白細胞表達MHC Ⅱ型的下降調節。可能是其它還未確定的機制在IL-10存在的情況下，引起B細胞的刺激能力降低。
已經表明，除經特異性異抗原交叉連接或TCR/CD3複合體外，LFA-1-ICAM-1的相互作用需要由異特異性的T細胞產生的細胞激活素。另外，已經證明CD28-B7/BB1的相互作用對誘導休止T細胞異抗原-特異性激活作用，從而導致細胞激活素的生產，增殖以及胞毒活性是必需的。B7在休止B細胞和單核白細胞上的表達很弱，但可隨這些細胞的激活而提高。但是，可以排除由於IL-10對TCR/CD3或這些輔助分子的表達的下降調節引起增殖降低和胞毒異反應。IL-10不影響TCR/CD3，LFA-1在反應器T細胞上的表達，或ICAM-1和B7在用作為刺激器的B細胞或單核白細胞上的表達。
此外，本文所報導的資料說明對異抗原的降低的增殖反應也反映出對反應器T細胞激活作用的阻礙。需從培養的開始就加入IL-10以發揮其最大的抑制作用。另外，按CD25和HLA DR抗原的表達判斷，在含IL-10的培養物中，激活T細胞的比例比對照MLC中明顯地低。雖然存在IL-10的情況下完成的MLC中生產的全部CD3+T細胞總數是減少的，但這些T細胞亞群的比例與沒有IL-10的情況下完成的對照MLC中的那些相比，IL-10並不是優先地影響CD4+或CD8+T細胞的反應。CD25的表達降低說明在MLC中對T細胞增殖的抑制作用不僅僅是IL-10細胞激活素抑制活性的結果當外源IL-2以足以飽和高親和度IL-2受體的濃度加入(圖8)時，IL-10也降低增殖反應的結論支持上述結果。總的來說，這些資料說明IL-10降低在MLC中PBMC，單核白細胞和正常B細胞的刺激能力。不能完全排除IL-10直接影響T細胞的可能性。但是，IL-10不能抑制用EBV-LCLs作為刺激器生產MLC的事實不支持該觀點，除非EBV-LCL能超越IL-10的抑制效果。
存在外源IL-10的情況下，也顯著地降低以全部異基因PBMC用作反應器和刺激器的MLC中生產的細胞激活素水平。IL-2，IFN-γ，TNF-α，和GM-CSF的量比沒有IL-10的情況下完成的對照MLC中的相應量低約2到3倍。IL-6的生產受很少的影響;這可能由於在IL-10的抑制活性變得有效之前，這些培養基中的單核白細胞在激活後很早就已經生產了可觀察的該細胞激活素。
目前的結果因此清楚地說明IL-10在體外下降調節異反應性中起重要的作用。從這些體外觀察和研究看，對於移植組織的特異性免疫排斥來說，異抗原是主要對象，人們可預料在體內異基因移植後IL-10對耐受性的誘導和維持起重要作用。
實施例5下列實施例在本申請的優先權日以後由Roncarolo和Bacehetta(1992)在Bone Marrow TransplantionProceedings ofFoetal and Neonatal Cell Transformation and Retroviral Therapy Vol 9，副刊1中公開的。它提供了體內胎兒幹細胞移植後T細胞抗體庫在耐受性方面的重要性的證據。
在用HLA錯配的胎兒肝幹細胞移植的患嚴重結合性免疫缺陷症的兩個患者中研究T細胞抗體庫和耐受機制。他們是18和6歲(在1993)且身體健康，對回憶抗原表現正常的免疫應答。他們的T細胞是供體源的，而單核白細胞和B細胞仍是宿主的。NK細胞有不同的來源，因為在一個患者中從供體得到，在另一個患者中從宿主得到。儘管在供體和宿主細胞間有HLA錯配，但沒有觀察到急性或慢性移植物抗宿主病。用PBMC的體外實驗表明對由宿主細胞表達的HLA抗原有特異的非應答性。然而，廣泛的克隆分析表明，在兩個患者的外周血液中存在CD4+和CD8+宿主反應性T細胞克隆，它們分別識別宿主Ⅱ型和Ⅰ型HLA分子。限制性稀釋實驗表明CD8+宿主反應性細胞的頻率與對異反應活性T細胞所觀察的範圍一樣。相反，可分離出非供體反應性CD8+細胞。宿主反應性CD4+和CD8+T細胞克隆在生產IL-2，IFN-γ，GM-CSF和IL-5能力方面是正常的，但它們完全不能合成IL-4。另外，來自患者RV的CD4+T細胞克隆分泌很高水平的IL-10。有趣的是，外源IL-10能夠抑制CD4+宿主反應性T細胞克隆的增殖反應。這些資料說明，在進行異基因胎兒肝幹細胞移植後，供體T細胞抗體庫中沒有缺失宿主反應性細胞。因此，體內宿主與供體間的耐受性由細胞激活素起作用的外周自動調節機制維持。
從HLA相同的供體進行骨髓移植是選擇給患嚴重結合性免疫缺陷症(SCID)兒童的治療法。然而，從錯配的供體移植生成的紅細胞的胎兒肝細胞(FLT)可以提供持續的移植且在沒有HLA-相同的骨髓供體的情況下提供一種可能的治療(參見如，Touraine et al.(1987)Thymus 1075-)。在上述患者中，可以在移植後的2-3個月內鑑定由HLA類型確定的供體源的免疫活性T淋巴細胞。雖然可用常規方法檢測用胎兒肝幹細胞移植的兒童中的外周T淋巴交移特質，但B淋巴細胞交移特質缺乏不是罕見的。對這些患者的免疫原性評估，給在HLA錯配的體內條件下，在T前體細胞和分化環境之間研究人T細胞分化和自身/非自身辨別提供了唯一的可能。
關於用全部HLA完全不同的供體提供的胎兒肝幹細胞移植的18和6歲前兩個SCID兒童的報告為IL-10在調節免疫系統方面的體內活性提供了證據，特別是，由宿主反應性細胞生產的IL-10在體內下降調節它們的應答方面起重要的作用。
患者SP接受兩種胎兒肝幹細胞移植，同時注射同基因的胎兒胸腺。雖然標準HLA定型表明僅移植來自第二供體的細胞，但使用對多態HLC抗原決定簇特異的單克隆抗體進行的一種更精確的細胞螢光檢測分析表明，10-20%的T淋巴細胞實際上來自第一個供體。第二個患者RV接受了七種胎兒肝幹細胞移植，但在外周血液中僅能鑑別一種供體細胞群(參見Roncarolo et al(1986)J.Clin.Investig.77673-)。
表3HLA定型A C B DR DQSP受體 3-33 6 14-47 4-5 3第一供體 2-11 4 27-62 1-8 1第二供體 1-2 7 8-18 3-9 3RV受體 2-13 4-7 X-62 8-10 4-5供體 2-30 4 8-35 11-13 6-7在上述患者中，移植後觀察到供體T細胞的穩定結合，而B細胞和單核白細胞是來源於宿主。
表4 交移特質αβTCR+T細胞 供體源γδTCR+T細胞單核白細胞 宿主源B細胞NK細胞 宿主源-SP供體源-RV儘管在免疫系統的細胞內處於這種分離的交移特質狀態，但仍可獲得全部重建物並在體內和體外觀察到對回憶抗原的正常抗體應答。這歸因於供體T細胞能跨越異基因障礙與宿主的抗原遞呈細胞(APC)協作。特別是，供體源的破傷風類毒素特異性的T細胞克隆(從患者SP的外周血液分離的)可以識別由宿主B細胞，EBV-轉化的B細胞系，和NK細胞克隆加工並遞呈的抗原(Ag)。相反，由供體細胞表達的Ⅱ型HLA抗原不能抑制至今所檢測的任何Ag-特異性的T細胞克隆(參見Roncarolo et al.(1988)J.Expt'l Med.1671523-;Roncarolo et al.，(1991)J.Immunol.147781-)。
在這兩個患者中NK群體的交移特質不同。在一個患者中，新鮮的NK細胞和NK細胞克隆表現出宿主的HLA表型，在另一患者中他們是源自於供體的。這些NK細胞表達CD16CD56抗原並表現出抗各種NK敏感的靶目標的正常胞毒活性。這些結果表明，宿主或供體功能NK細胞的存在不阻止胎兒幹細胞移植後，供體T細胞的穩定結合。儘管淋巴樣細胞與主要的和/或最小的組織親和性抗原差異共存，但在這兩個患者體內達到了完全的耐受性，且未觀察到急性或慢性移植物抗宿主病。此外，體外研究表明，供體T細胞對宿主表達的HLA抗原的特異性非反應性存在於一級混和白細胞培養中，而抗異基因細胞的增殖反應是正常的。然而在克隆水平，研究結果有所不同。已經從兩個患者的外周血液中得到供體源的宿主。反應活性胞毒T細胞克隆，它能識別Ⅰ型HLA或Ⅱ型HLA抗原。相反已經報告了在用HLA-單一相同親本供體骨髓移植的SCID患者中，不能從這些患者中分離到供體反應活性的T細胞克隆。此外，在患者RV中，未能鑑別到與宿主共有的與HLA Ⅰ型位點A抗原特異的T細胞克隆。用改進的限制稀釋檢測方法(參見Vandekerckhove et al.(1992)J.Expl.Med.1751033-1043)的頻率分析確定供體反應活性的喪失並證明CD8+宿主-反應活性T細胞頻率與T細胞抗第三個參與者的HLA抗原的反應頻率範圍相同。這些結果說明從供體T細胞抗體庫中，不能通過克隆去除宿主反應活性細胞。顯然，由於這些患者中，移植物抗宿主病的臨床症狀不明顯，所以上述宿主反應活性的T細胞是受調節的。這可能是宿主反應活性細胞在體內是無反應性，且在存在IL-2的情況下體外刺激能中止這種無反應性。
在多克隆和抗原特異性的刺激後，宿主反應活性T細胞表現出一種獨特的淋巴細胞激活素生產方式。沒有CD4+或CD8+細胞克隆能分泌IL-4，而它們能合成正常水平的IL-2，IL-5，和GM-CSF。這些克隆的IFN-γ生產量通常是非常高的。另外，在抗原特異性刺激後，患者RV的CD4+宿主反應活性克隆的IL-10生產量極高，這似乎與低IL-2合成負相關。此外，外源IL-10的加入可以顯著地抑制體外CD4+宿主反應活性T細胞克隆的增殖反應。這提供了宿主反應活性細胞生產的IL-10在體內下降調節它們的應答方面起重要作用的證據。
實施例6本實施例研究在用異基因幹細胞移植的SCID患者中IL-10的生產。用錯配的HLA胎兒幹細胞給患嚴重結合免疫缺陷症的兒童移植，且在僅有供體T細胞結合時，獲得免疫重建體。儘管對宿主具耐受性，在這些患者的外周血液中仍存在高頻率的宿主反應活性T細胞，但說明自體調節抑制機制可導致體內的內環境穩定。最近，將IL-10描述成能抑制(異)抗原特異性T細胞激活和增殖的抑制性細胞激活素。對兩個患有全部外周血液單核白細胞的半定量PCR分析。證明IL-10mRNA水平比正常供體的高很多，而IFN-γ和GM-CSF mRNA類似。對純化單核細胞，B和T細胞的PCR分析表明宿主源的單核細胞引起IL-10的生產量增加。在一個患者中，在純化的全部T細胞中也觀察到高水平的IL-10mRNA。此外，由CD4+宿主反應活性T細胞生產的高水平IL-10以自體調節方式抑制應答宿主細胞的這些細胞的增殖。這些結果說明高水平內源IL-10生產可引起幹細胞移植後異反應性的抑制。
1989年12月20日，申請人將攜帶pH5C，pH15C，和pBCRF1(SRα)的大腸桿菌MC1061的不同培養物寄存於美國典型培養物收集中心，Rockville，MD USA(ATCC)，寄存號分別為68191，68192，和68193。這些寄存物根據ATCC的關於用於專利目的的培養物寄存(Culture Deposit for Patent Purposes)的協議提供的條件進行寄存，根據35USC122和37CFR1.14，確保美國專利和商標委員會(US(Commissioner of Patents and Trademarks)得到寄存物，且在美國專利公開後，公眾可得到，並要求使寄存物保持存活。當違背任何政府的權威機構根據其專利法授予的專利權時，得到寄存菌株不能構成實施本發明的許可。
已經對寄存物限制以便使其符合布達佩斯條約(Budapest Convention)的要求。
本發明上文描述的實施例是為了達到說明和描述的目的。它們不是用來詳盡或限制本發明以達到公開的精確形式，且顯然，按上文的指導，許多改進和變化都是可行的。所選擇和描述的實施方案是為了更好地解釋本發明的原理以使本領域的其它技術人員能夠在各種實施方案以及在特別設計的用途中所用的各種改進方案中更好地利用本發明。意圖是本發明的範圍由這裡所附的權利要求限定。
權利要求
1.一種抑制個體中移植物抗宿主病或組織排斥的方法，該方法包括給個體施用有效量白細胞介素-10或其拮抗劑的步驟。
2.根據權利要求1的方法，其中所述白細胞介素-10選自病毒白細胞介素-10和人白細胞介素-10組。
3.根據一種抑制個體中移植物抗宿主病的方法，該方法包括給個體施用有效量的白細胞介素-10的步驟。
4.根據權利要求3的方法，其中所述白細胞介素-10選自病毒白細胞介素-10和人白細胞介素-10組。
5.一種抑制個體中組織排斥的方法，該方法包括給個體施用有效量白細胞介素-10的步驟。
6.根據權利要求5的方法，其中所述白細胞介素-10選自病毒白細胞介素-10和人白細胞介素-10。
7.根據權利要求1的方法中，其中所述白細胞介素-10是轉譯後的變異體或突變型蛋白。
8.一種抑制個體中移植物抗宿主病或組織排斥的方法，該方法包括給個體施用有效量的下列序列的白細胞介素-10
9.根據權利要求8的方法，其中所述白細胞介素-10選自病毒白細胞介素-10和人白細胞介素-10組。
10.白細胞介素-10治療移植物抗宿主病或組織排斥的用途。
11.製備用於治療移植物抗宿主病或組織排斥的藥物的白細胞介素-10的用途。
12.一種治療患有移植物抗宿主病患者的方法，包括給所述患者施用有效量的白細胞介素-10。
13.用於治療移植物抗宿主病或組織排斥的白細胞介素-10。
14.用於治療移植物抗宿主病或組織排斥的含白細胞介素-10的藥物組合物的用途。
15.製備用於治療移植物抗宿主病或組織排斥的藥物組合物的白細胞介素-10的用途。
全文摘要
一種用於抑制移植物抗宿主病或組織排斥的方法，該方法包括給個體施用有效量的白細胞介素-10。
文檔編號A61K35/12GK1079166SQ9310448
公開日1993年12月8日 申請日期1993年3月3日 優先權日1992年3月4日
發明者M·-G·朗卡洛羅, R·迪瓦爾馬力費特, R·巴切塔 申請人:先靈公司