一種基於染料結合原理在近紅外波長區測定微量蛋白質的方法

2023-05-31 10:52:41 4

專利名稱：一種基於染料結合原理在近紅外波長區測定微量蛋白質的方法
技術領域：
本發明涉及一種測定蛋白質的方法，尤其是一種基於染料結合原理在近紅外波長區測定微量蛋白質的方法。
(2)背景技術花菁染料屬一類化合物，訪類染料最早作為光敏劑，應用於照相化學工業中，或作為能量轉換與儲存材料，例如太陽能電池用色素或雷射染料。近年來發現該類化合物具有長波螢光(600～1000nm)發射，因而逐漸應用於螢光分析，結合雷射誘導螢光(Laserinduced-fluorescence，LIF)技術及毛細管電泳(Caterpillar electroporesis，CE)技術或色譜分離技術，該類化合物已用於核酸的測序(Shealy，D.B.et al.Anal.Chem.，1995，67，247；Shealy，D.B.et al.Appl.Spectrosc.，1995，49，1815)以及蛋白質(Sauda，K.et al.Anal.Chem.，1986，58，2649；Williams，R.et al.Anal.Chem.，1993，65，601)、胺基酸(Flanagan，J.H.et al.Anal.Chem.，1995，67，341)及其它小分子(Imasaka，T.et al.Anal.Chem.，1984，56，1077)的超微量分析中。
利用蛋白質與一些染料在酸性溶液中的結合反應所形成的蛋白質-染料複合物吸光度的變化(一般傾向於採用吸光度的增加)可以對蛋白質進行定量測定，這就是染料結合法。染料結合法已在生物化學實驗及臨床分析中得到廣泛應用，如考馬斯亮藍(CBB)G-250染料結合法(Bradford，M.M.Anal.Biochem.，1976，72，248)測定樣品總蛋白及溴甲酚綠法(張德安等編著.生物大分子實驗手冊.吉林大學出版社，第1版，1991.377)測定血清白蛋白。人們還發表了許多利用染料結合法進行蛋白定量的方法，但其靈敏度相對考馬斯亮藍法而言並無實質性提高。
(3)發明內容本發明旨在提供一種測定靈敏度高，測定波長位於近紅外波長區，以減少樣品中某些物質的幹擾，工作曲線線性關係好的基於染料結合原理測定微量蛋白質的方法。
本發明的步驟如下1)在容量瓶中依次加入濃度遞增的蛋白質水溶液；2)加入酸性緩衝溶液，以水稀釋至滿刻度；
3)逐瓶加入花菁溶液；4)放置，以水或相應緩衝溶液為參比掃描吸收光譜或測量吸光度的增加值。
在一系列容量瓶中依次加入濃度遞增的蛋白質水溶液，所用容量瓶最好不少於3個，蛋白質水溶液的系列濃度可落在相應的工作曲線線性範圍內；所謂的相應工作曲線線性範圍是指對應於所用花菁溶液濃度所決定的測定蛋白質濃度的線性工作曲線範圍。
所加入的酸性緩衝溶液是指pH 1.0～4.0的各種酸性緩衝溶液。
所加入的花菁溶液為終濃度介於2.0×10-6～1.0×10-5mol/L所相應量的花菁溶液，加入花菁溶液後放置的時間在6分鐘左右，可在883～922nm的波長範圍內測定吸光度。
所說的花菁為分子式C34H38N2ClS2O6Na結構式 英文名稱5-sulfoate-2-[4』-chloro-7』-(5」-sodiumsulfoate-1」-ethyl-3」，」-dimethylindolin-2」-ylidene)-3』，5』-(propane-1，3-diyl)-1』，3』，5』-heptatrien-1』-yl]-1-ethyl-3，3-dimethyl-3H-indolium中文名稱水溶性七次甲基花菁，簡稱HMC或花菁。
所說的花菁依如下程序合成1)化合物(1)(2，3，3-trimethylindoleninium-5-sulfonate)的合成在100mL圓底燒瓶中，加入3-甲基-2-丁酮25.2mL，對肼基苯磺酸15g以及冰醋酸45mL，混合物回流5小時。以旋轉蒸發器抽除冰醋酸，得粉紅色粘稠狀物。在加熱情況下以儘可能少的甲醇溶解，慢慢加入以KOH飽和的異丙醇溶液，至反應瓶中液體由棕紅色變為土黃色(此時pH5～6)。於1～4℃中放置，有大量黃色固體析出。過濾，以無水乙醚洗滌。 2)化合物(2)(1-ethyl-2，3，3-trimethylindoleninium-5-sulfonate)的合成 取化合物(1)3g以及15mL碘乙烷於50mL圓底燒瓶中回流24小時。反應混合物冷卻，傾去未反應的碘乙烷。所得固體以丙酮處理三次(15mL×3)以除去生成的碘化鉀，得亮紫色易吸溼固體，置乾燥器中保存。
3)化合物(3)(2-chloro-l-formyl-3-hydroxymethylenecyclohexene)的合成 在以冰水浴冷卻的40mL DMF及40mL CH2Cl2混合液中，逐滴滴入37mL POCl3與35mLCH2Cl2的混合液；然後再滴加10g的環己酮。滴加完畢後，混合液在氮氣氛下回流3小時，冷卻至室溫，所得紅色反應混合物慢慢加入到200g碎冰中(勿使水解劇烈而致溫度升高)，放置過夜。濾去液體，所得棕紅色固體以預先冷凍的丙酮洗滌數次至固體呈亮黃色。
4)目標化合物(花菁)的合成
在50ml圓底燒瓶中，稱取化合物(2)1.02克，化合物(3)0.347克，以30ml醋酸酐溶解，再加入470毫克無水NaAc。於氮氣氛下室溫攪拌6小時，倒出反應混合物，於其中加入適量無水乙醚至無沉澱析出，傾去上清液，沉澱物以甲醇溶解(不溶物為醋酸鈉)，洗滌殘渣，收集濾液，減壓濃縮，以快速柱層析法分離，收集綠色組分，得270毫克草綠色且具金黃色金屬反射光澤的晶體，產率約20％。
合成的目標化合物(花菁)結構表徵數據如下1H NMR(500 MHz)(ppm，DMSO-d6)1.3(t，J＝7.0Hz，6H)，1.68(s，12H)，1.86(m，J＝5.6Hz，2H)，2.72(t，J＝5.7Hz，4H)，4.26(q，J＝7.0Hz，4H)，7.8(d，J＝1.2Hz，2H)，7.68(dd，J＝1.4Hz，8.3Hz，2H)，7.38(d，J＝8.3Hz，2H)，6.34(d，J＝14.1Hz，2H)，8.26(d，J＝14.1Hz，2H).IR(KBrPellet)1640，1475，1390，1252，1167，1061，824，728，668cm-1MS，m/z694.4(M++1，22)，693.4(M+，42)，671.4(M++1-Na，100)。Rf＝0.46(薄層層析用矽膠板，自製)CHCl3/MeOH＝4/1(v/v)。m.p.202-205℃本發明所合成的七次甲基花菁染料在酸性條件下，蛋白質存在時，在904nm處出現一新的吸收峰，且吸光度(ABS)的增加與蛋白質含量的增多成正比，據此建立了以染料結合法為原理進行蛋白質定量的新方法。相對於傳統的染料結合法，本發明的獨特優點有試劑無本底吸收，因而可用水或緩衝溶液做空白調零；蛋白質-染料複合物摩爾吸收係數大，在同等濃度的蛋白質條件下，本發明所引起的測定體系的吸光度的增強最顯著，測定的靈敏度高(測定5000ng/mL牛血清白蛋白時，考馬斯亮藍法引起吸光度增加值為0.275OD(見Bradford，M.M.Anal.Biochem.，1976，72，248)，而測定2000ng/mL牛血清白蛋白時，本發明引起吸光度增加值為0.900OD；若以A＝0.02計，本發明的最低檢出量為100～200ng/mL，比現有的各種染料結合法靈敏度提高近10倍。)；測定波長大於900nm，位於近紅外波長(700～1000nm)區，可消除樣品中可能存在的長波強吸收物質，如溶血等對測定的幹擾。
本發明的工作曲線線性關係良好，而考馬斯亮藍法有時會出現工作曲線的非線性現象。
(4)


圖1為花菁染料及花菁-牛血清白蛋白(BSA)混合物在pH 2.6時的吸收光譜。
圖2為花菁染料-蛋白質複合物的穩定性曲線。
圖3為測定不同種類蛋白質的響應曲線。
(5)
具體實施例方式
以下給出優化條件下實驗操作舉例。
在一系列10 mL容量瓶中依次加入0.0，0.05，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2mL濃度為20ug/mL的人血清白蛋白(HSA)水溶液，再依次加入1.0mL pH 2.6的甘胺酸-鹽酸緩衝溶液，以水稀釋至滿刻度並搖勻。然後逐瓶加入0.3mL濃度為1.0×10-4mol/L的花菁溶液，搖勻。放置40min後，以緩衝溶液為參比掃描吸收光譜或在904nm處測量吸光度。各組分參數見下表

以下給出其它條件下本發明對蛋白質的響應。
1)不同pH體系對蛋白質的響應系列濃度蛋白質在不同pH時所引起的吸光度變化見下表。

aHCl-KCl體系bHac-NaAc體系

a鄰苯二甲酸氫鉀-HCl體系bBritton-Robinson體系c0.01N HCl體系d0.005N H2SO4體系可見，在pH1.0～4.0範圍內，可用七種體系來調控pH值甘胺酸-HCl體系；HAc-NaAc體系；HCl-KCl體系；鄰苯二甲酸氫鉀-HCl體系；Britton-Robinson體系；稀濃度的HCl體系及稀濃度的H2SO4體系。
2)不同測定波長時體系對蛋白質的響應不同波長處測定系列濃度蛋白質所引起的吸光度變化見下表。

3)體系在不同測定時間對蛋白質的響應不同時間測定系列濃度蛋白質所引起的吸光度變化見下表。

不同時間測定同一濃度蛋白質的吸光度數值見下表。

4)體系在不同花菁濃度時對蛋白質的響應使用不同花菁濃度時系列濃度蛋白質所引起的吸光度變化見下表。


以下結合附圖對本發明作進一步的說明。
1)近紅外花菁染料的吸收光譜圖1為花菁染料及花菁-牛血清白蛋白(BSA)混合物在pH2.6時的吸收光譜。
從圖1中可以看出，當不存在BSA時，花菁最大吸收峰位於776nm，在904nm處無吸收；加入BSA後，776nm處的吸光度隨BSA濃度增大而降低並略紅移，而904nm處則出現新的吸收峰且其吸光度隨BSA濃度增大而增大。在圖1中，HMC的濃度為3.0×10-6mol/L；BSA的濃度(ng/mL)為(1)0，(2)400，(3)800，(4)1200，(5)1600；WL為測定波長。
2)染料—蛋白質複合物的穩定性圖2為花菁染料—蛋白質複合物的穩定性曲線。
在實驗條件下，染料與蛋白質作用後，形成的染料—蛋白質複合物在40分鐘時吸光度達到最大並至少在80分鐘內是穩定的，在圖2中，HMC的濃度為3.0×10-6mol/L；BSA的濃度2400ng/mL，甘胺酸-鹽酸緩衝溶液pH2.6。
3)對不同種類蛋白質的響應圖3為測定不同種類蛋白質的響應曲線。
在實驗條件下建立測定不同種類蛋白質的標準工作曲線。測定BSA的線性範圍是200～2000ng/mL，回歸方程為A＝-0.085+4.874×10-4C(Cng/mL)，線性相關係數γ＝0.9976。對1200ng/mL BSA的七次平行測定的相對標準偏差(RSD)為2.19％。測定人血清白蛋白(human serum albumin，HSA)的線性範圍是100～2400ng/mL，回歸方程為A＝-0.048+5.706×10-4C(Cng/mL)，線性相關係數γ＝0.9987。測定人血丙球蛋白(IgG)的線性範圍是200～3000ng/mL，回歸方程為A＝-0.060+3.427×10-4CA＝(Cng/mL)，線性相關係數r＝0.9984。測定卵清蛋白(ovalbumin)的線性範圍是300～4000ng/mL，回歸方程為A＝-0.027+2.425×10-4CA＝(Cng/mL)，線性相關係數r＝0.9990。由此可見，該方法對於不同種類的蛋白質有不同的響應，因而在蛋白質測定時應以同源的蛋白質作為標準。
權利要求
1.一種基於染料結合原理在近紅外波長區測定微量蛋白質的方法，其特徵在於步驟如下1)在容量瓶中依次加入濃度遞增的蛋白質水溶液；2)加入酸性緩衝溶液，以水稀釋至滿刻度；3)逐瓶加入花菁溶液；4)放置，以水或相應緩衝溶液為參比掃描吸收光譜或測量吸光度的增加值。
2.如權利要求1所述的一種基於染料結合原理在近紅外波長區測定微量蛋白質的方法，其特徵在於所說的容量瓶至少3個。
3.如權利要求1所述的一種基於染料結合原理在近紅外波長區測定微量蛋白質的方法，其特徵在於所說的蛋白質水溶液的系列濃度落在相應的工作曲線線性範圍內，所說的相應工作曲線線性範圍是指對應於所用花菁溶液濃度所決定的測定蛋白質濃度的線性工作曲線範圍。
4.如權利要求1所述的一種基於染料結合原理在近紅外波長區測定微量蛋白質的方法，其特徵在於所加入的酸性緩衝溶液是指pH 1.0～4.0的酸性緩衝溶液。
5.如權利要求1所述的一種基於染料結合原理在近紅外波長區測定微量蛋白質的方法，其特徵在於所加入的花菁溶液為終濃度介於2.0×10-6～1.0×10-5mol/L所相應量的花菁溶液。
6.如權利要求1所述的一種基於染料結合原理在近紅外波長區測定微量蛋白質的方法，其特徵在於加入花菁溶液後放置的時間至少6分鐘。
7.如權利要求1所述的一種基於染料結合原理在近紅外波長區測定微量蛋白質的方法，其特徵在於在883～922nm的波長範圍內測定吸光度。
全文摘要
涉及一種測定蛋白質的方法，尤其是一種基於染料結合原理在近紅外波長區測定微量蛋白質的方法。步驟為在容量瓶中依次加入濃度遞增的蛋白質水溶液；加入酸性緩衝溶液，以水稀釋至滿刻度；逐瓶加入花菁溶液；放置，以水或相應緩衝溶液為參比掃描吸收光譜或測量吸光度的增加值。測定靈敏度高，測定波長位於近紅外波長區，以減少樣品中某些物質的幹擾，工作曲線線性好；試劑無本底吸收，可用水或緩衝溶液做空白調零；蛋白質－染料複合物摩爾吸收係數大，在同等濃度的蛋白質條件下，所引起的測定體系的吸光度的增強最顯著，測定的靈敏度高，測定波長大於900nm，位於近紅外波長區，可消除樣品中可能存在的長波強吸收物質，如溶血等對測定的幹擾。
文檔編號G01N21/31GK1401988SQ0212846
公開日2003年3月12日 申請日期2002年9月6日 優先權日2002年9月6日
發明者鄭洪 , 李東輝, 毛玉霞 申請人:廈門大學