一種人工預先氧化顯色劑顯示髓過氧化物酶的工作液的製作方法

2023-10-17 19:08:14 1

專利名稱：一種人工預先氧化顯色劑顯示髓過氧化物酶的工作液的製作方法
技術領域：
本發明屬於一種顯示髓過氧化物酶的工作液，更具體地說它是一種人工預先氧化顯色劑顯示髓過氧化物酶的工作液。
背景技術：
髓過氧化物酶(MPO)染色對白血病的診斷和分型具有重要意義，應用廣泛。FAB(France America Britian協作組)分型方案中，將髓過氧化物酶(MPO)陽性率＞3％作為診斷急性髓細胞性白血病(AML)的標準。目前MPO染色方法主要有Washburn聯苯胺法及Pereira碘化鉀(KI)法兩種。
Washburn法MPO染色工作液由聯苯胺溶液及稀H2O2溶液組成。因聯苯胺具有潛在致癌作用，其方法已逐漸被淘汰。
Pereira原法中MPO染色工作液由緩衝溶液、碘化鉀(KI)及顯色劑Leishman’s染料組成，不加H2O2，但所用KI溶液需充分振搖使與空氣充分接觸，以獲取足夠的氧，因此所需的時間較長。
目前大多數學者採用改良的Pereira法，其MPO染色工作液由緩衝溶液、稀H2O2溶液、碘化鉀(KI)溶液及顯色劑組成。這種方法每次配製MPO染色工作液時需加H2O2，比較麻煩，操作步驟也複雜；同時若H2O2失效對MPO染色結果易產生影響。

發明內容
本發明的目的在於克服上述背景技術的不足之處而提供一種人工預先氧化顯色劑顯示髓過氧化物酶的工作液。該工作液安全、穩定可靠、易於配製、操作簡單、是理想的MPO染色工作液。
本發明的目的是通過如下措施來達到的一種人工預先氧化顯色劑顯示髓過氧化物酶的工作液，它由緩衝溶液、碘化鉀溶液或含碘化鉀的緩衝溶液、顯色劑組成，所述顯色劑是經人工預先氧化的顯色劑。
在上述技術方案中，所述人工預先氧化的顯色劑是經雙氧水人工預先氧化成熟。
在上述技術方案中，所述的顯色劑為吡囉紅G(PyG)的甲醇溶液，吡囉紅B(PyB)的甲醇溶液或乙醇溶液。
在上述技術方案中，所述顯色劑可為下述物質中的一種①氧蒽酮染料類，特別是由氧蒽酮為母體的鹼性染料；②燦爛甲酚藍及其類似物；③以吩噻嗪為母體的鹼性染料；④以吩嗪為母體的鹼性染料；⑤三苯甲烷類鹼性染料。
在上述技術方案中，所述顯色劑可為亞甲藍、羅丹明B、天青I、孔雀石綠、甲基綠、碘綠、乙基紫中的一種。
本發明具有如下優點(1)每次配製MPO染色工作液時不必再加H2O2，省去了需經常配製H2O2的麻煩，從而簡化了操作步驟，(2)消除了因H2O2失效對MPO染色結果的影響，避免了假陰性結果的發生。(3)提高了試劑的穩定性及便於標準化，也增加了結果間的可比性。(4)試劑安全、穩定可靠、便於標準化、易於配製、操作簡單、是理想的MPO染色方法。(5)成熟中性粒細胞染色時間為5～15秒即可，特別適合用於快速機檢。


圖1為正常骨髓塗片KI-PyB法MPO染色顯微圖，圖2為急性髓細胞白血病外周血塗片KI-PyB法MPO染色顯微圖，圖3、圖4為急性髓細胞白血病骨髓塗片KI-PyB法MPO染色顯微圖，圖5為正常骨髓塗片KI-PyG法MPO染色顯微圖，圖6為急性髓細胞白血病外周血塗片KI-PyG法MPO染色顯微圖，圖7、圖8為急性髓細胞白血病骨髓塗片KI-PyG法MPO染色顯微圖，具體實施方式
經意外發現，在配製的0.5％PyB(50％乙醇為溶劑)溶液做MPO染色時出現過強陽性反應，經實驗研究發現PyB是被自然氧化了。用此已自然氧化了的PyB溶液做MPO染色時，不需加H2O2。於是設想將適量H2O2加入到0.5％PyB(50％乙醇)溶液中，促使PyB溶液預先氧化而達到成熟。實驗顯示，只需一次性加入適量H2O2即可使PyB預先氧化成熟，其H2O2的量與正交試驗所確定的最佳含量一致，而以後每次配製MPO工作液時都不必再加H2O2，也能很好的顯示MPO。
進一步實驗本組同時配製了加H2O2的PyG及PyB三種溶液，其溶劑分別為50％乙醇、50％甲醇及蒸餾水，以觀察PyG及PyB的氧化成熟情況。1周後染色發現以50％甲醇為溶劑的PyG溶液被氧化成熟，達到了做MPO染色時不需加H2O2的目的，染色效果很滿意；但以50％乙醇及蒸餾水為溶劑的PyG溶液卻沒有出現氧化，做MPO染色時仍需加H2O2。而以50％乙醇及50％甲醇為溶劑的PyB溶液均被氧化成熟，而以蒸餾水為溶劑的PyB溶液氧化較緩慢。因此配製PyG溶液必須以甲醇為溶劑，PyG才能被氧化；配製PyB溶液以乙醇及甲醇為溶劑為佳，也可用蒸餾水。甲醇、乙醇中的甲基、乙基或羥基可能參與了PyG及PyB溶液氧化成熟的反應過程或具有媒促反應的效果。
本KI-PyB法MPO染色陽性顆粒為鮮紅色，KI-PyG法MPO染色陽性顆粒為棕黑色。所顯示的MPO陽性反應，對比鮮明，易於判斷，染色時間短，靈敏度高。試劑安全、穩定可靠、易於配製、操作簡單，特別是不需加H2O2，消除了H2O2對染色結果的影響，避免了假陰性結果的發生。新鮮塗片通常染色30～60s即可達最佳，必要時可適當延長染色時間，但不必超過2min。成熟中性粒細胞染色時間為5～15s即可，特別適合用於快速機檢。
經多次實驗證明許多與PyG、PyB化學結構類似的化學物，特別是帶有苯胺基結構的的化學物(試劑)，均可作為碘化鉀法MPO染色的顯色劑，這類化學物(試劑)主要是①氧蒽酮染料類，特別是由氧蒽酮為母體的鹼性染料(例如羅丹明B及其類似物)；②燦爛甲酚藍(煌焦油藍)及其類似物；③以吩噻嗪為母體的鹼性染料(如硫菫、亞甲藍及其類似物、天青I、Wright-Giemsa染色液等)；④以吩嗪為母體的鹼性染料(如中性紅、藏紅T及其類似物)；⑤三苯甲烷類鹼性染料(如孔雀石綠、甲基綠、碘綠、結晶紫、乙基紫、新品紅、鹼性品紅、副品紅等，及其類似物)。
各類染料中的部分試劑也可用本法人工氧化的方法氧化成熟，作為本法MPO染色的顯色劑。其中亞甲藍、羅丹明B、天青I、孔雀石綠、甲基綠、碘綠、乙基紫等效果較好。
實施例一KI-PyB法一、試劑配製1、固定劑1∶9甲醛乙醇液，即40％甲醛溶液10ml加無水乙醇90ml混合即得。
2、磷酸鹽緩衝溶液0.067mol/L pH5.8。
3、KI溶液500mg碘化鉀溶於50ml蒸餾水中。
4、PyB溶液250mg吡囉紅B溶於50ml 50％乙醇中，待完全溶解後，加30％H2O225μl。
5、甲基綠溶液500mg甲基綠溶於50ml蒸餾水中。
6、MPO染色工作液配製(臨用時現配)取磷酸鹽緩衝溶液1ml，加KI溶液50μl、PyB溶液100μl(邊滴邊搖)，4小時內使用。
二、染色步驟1、乾燥的血塗片或骨髓塗片，滴加固定劑布滿血膜固定30-60s，流水衝洗，晾乾或濾紙吸乾。
2、滴加工作液於塗片上，染色1-2min後傾去(不用水衝洗)，濾紙吸乾。
3、滴加甲基綠溶液於塗片上，染色5s後傾去(不用水衝洗)，濾紙吸乾，鏡檢。
三、染色結果判斷陽性產物呈紅色至深紅色顆粒狀定位於胞漿中，強陽性時陽性顆粒充滿整個胞漿，甚至覆蓋細胞核。MPO陰性細胞的胞漿呈淺藍色，無紅色顆粒。細胞核呈淺綠色，核仁呈淺藍色。(見圖1、圖2、圖3、圖4)，圖1為正常骨髓塗片KI-PyB法MPO染色顯微圖，圖2為急性髓細胞白血病外周血塗片KI-PyB法MPO染色顯微圖，圖3、圖4為急性髓細胞白血病骨髓塗片KI-PyB法MPO染色顯微圖。
實施例二KI-PyG法一、試劑配製1、固定劑1∶9甲醛乙醇液，即40％甲醛溶液10ml加無水乙醇90ml混合即得。
2、磷酸鹽緩衝溶液0.067mol/L pH5.8。
3、KI溶液500mg碘化鉀溶於50ml蒸餾水中。
4、PyG溶液250mg吡囉紅G溶於50ml 50％乙醇中，待完全溶解後，加30％H2O225～50μl。
5、工作液配製(臨用時現配)取磷酸鹽緩衝溶液1ml，加KI溶液150μl、PyG溶液100μl混勻，4小時內使用。
二、染色步驟1、乾燥的血塗片或骨髓塗片，滴加固定劑布滿血膜固定30～60s，流水衝洗，晾乾或濾紙吸乾。
2、滴加工作液於塗片上，染色1-2min後傾去，濾紙吸乾，鏡檢。
三、MPO染色結果判斷陽性產物呈棕黑色顆粒狀定位於胞漿中，強陽性時陽性顆粒充滿整個胞漿，甚至覆蓋細胞核，細胞核呈淺紅色。MPO陰性細胞的胞漿呈淺紅色，但較細胞核略深，無棕黑色顆粒。(見圖5、圖6、圖7、圖8)。圖5為正常骨髓塗片KI-PyG法MPO染色顯微圖，圖6為急性髓細胞白血病外周血塗片KI-PyG法MPO染色顯微圖，圖7、圖8為急性髓細胞白血病骨髓塗片KI-PyG法MPO染色顯微圖。
上述實施例一、實施例二染色結果採用急性淋巴細胞性白血病(ALL)9例、急性髓細胞性白血病(AML)33例、粒系反應性增12例及正常骨髓塗片5例，共計59例標本。各例分別按本實施例1、實施例2及Washburn法做MPO染色，每張塗片分類計200個有核細胞，記錄MPO染色陽性細胞佔有核細胞(ANC)的百分率；採用t檢驗進行統計分析。
附表50例骨髓塗片MPO染色陽性率(％，x±S)結果比較骨髓診斷例數實施例1 實施例2 Washburn法正常髓象5 58.6±3.3 63.0±6.8 65.0±7.9粒系增生12 71.8±6.0 72.4±6.5 73.3±6.1AML-M1 10 40.8±21.939.7±20.338.2±22.5AML-M2a 9 73.1±15.074.4±15.271.3±14.2AML-M2b 4 80.0±10.478.5±8.5 77.8±14.3AML-M3b 6 92.2±4.3 91.3±4.8 94.3±2.9AML-M4b 4 42.3±3.7 50.3±11.646.8±13.1總計50 65.3±21.366.3±20.565.8±21.9結果顯示，9例ALL的白血病細胞，本法中的實施例1、實施例2與Washburn法MPO染色均為陰性，但塗片中的少量中性粒細胞MPO呈強陽性；另50例MPO染色陽性率(ANC)見附表，實施例1及實施例2與Washburn法MPO陽性率十分相近，平均值分別為65.3％、66.3％及65.8％，三者差異無顯著性意義(P＞0.05)。
權利要求
1.一種人工預先氧化顯色劑顯示髓過氧化物酶的工作液，它由緩衝溶液、碘化鉀溶液或含碘化鉀的緩衝溶液、顯色劑組成，其特徵在於所述顯色劑是經人工預先氧化的顯色劑。
2.根據權利要求1所述的人工預先氧化顯色劑顯示髓過氧化物酶的工作液，其特徵在於所述人工預先氧化的顯色劑是經雙氧水人工預先氧化成熟。
3.根據權利要求1或2所述的人工預先氧化顯色劑顯示髓過氧化物酶的工作液，其特徵在於所述的人工預先氧化的顯色劑為吡囉紅G的甲醇溶液。
4.根據權利要求1或2所述的人工預先氧化顯色劑顯示髓過氧化物酶的工作液，其特徵在於所述的人工預先氧化的顯色劑為吡囉紅B的甲醇溶液或乙醇溶液。
5.根據權利要求1或2所述的人工預先氧化顯色劑顯示髓過氧化物酶的工作液，其特徵在於所述顯色劑可為下述物質中的一種①氧蒽酮染料類，特別是由氧蒽酮為母體的鹼性染料；②燦爛甲酚藍及其類似物；③以吩噻嗪為母體的鹼性染料；④以吩嗪為母體的鹼性染料；⑤三苯甲烷類鹼性染料。
6.根據權利要求1或2所述的人工預先氧化顯色劑顯示髓過氧化物酶的工作液，其特徵在於所述顯色劑可為亞甲藍、羅丹明B、天青I、孔雀石綠、甲基綠、碘綠、乙基紫中的一種。
7.根據權利要求5所述的人工預先氧化顯色劑顯示髓過氧化物酶的工作液，其特徵在於所述顯色劑可為亞甲藍、羅丹明B、天青I、孔雀石綠、甲基綠、碘綠、乙基紫中的一種。
全文摘要
一種人工預先氧化顯色劑顯示髓過氧化物酶(MPO)的工作液，它由緩衝溶液、碘化鉀溶液或含碘化鉀的緩衝溶液、顯色劑組成，所述顯色劑是經人工預先氧化的顯色劑。其優點在於每次配製MPO染色工作液時不必再加H
文檔編號G01N1/30GK1546978SQ20031011151
公開日2004年11月17日 申請日期2003年12月4日 優先權日2003年12月4日
發明者陳萬新 申請人:華中科技大學同濟醫學院附屬協和醫院