製備含dna物品的方法
2023-05-31 23:14:11
專利名稱：製備含dna物品的方法
技術領域：
本發明涉及一種製備含DNA物品的方法。
背景技術：
DNA是存在於細胞器的染色體中的基本遺傳物質。因為DNA中存儲有遺傳信息，所以它己成為生物和醫學領域中廣泛研究的對象。然而，因從活體組織中僅能獲取少量的DNA，則在研究該DNA之前，必須將DNA的目標序列擴增。現已知有許多擴增DNA目標序列的方法和儀器[Mullis,K.等，體外DNA特定的酶擴增聚合酶鏈反應(Specific enzymaticamplification of DNA in vitro:the polymerase chain reaction.),Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.51,263-273,1986；美國專利4,683,195、4,683,202和4,889,818,韓國專利126,231]。
本發明人觀察到DNA能代表供體的獨有特徵。利用該觀察結果，發明人製備了含DNA的物品，特別是其能長時間保存並具有吸引人的外觀。若該物品為固體，可將擴增的DNA植入其中；若該物品為無定形，可將擴增的DNA與其混合。這樣就製備了所述物品，其通過包含供體獨有特徵來代表DNA的供體。
附圖簡要說明
圖1所示為一個鑰匙鏈，其含有根據本發明一個實施例製備的一個DNA混合物、以及HLA DNA帶；圖2所示為一個項鍊，其是根據本發明另一實施例製備的；圖3所示為一個項鍊，其是根據本發明再一實施例製備的。
在圖中每個數字標號具有下列含義1．鑰匙鏈2．HLA DNA帶3．DNA供體的照片4．絲印籤名5．含有DNA的溶液6．水10、20.項鍊實施本發明的最件方式本發明的目的是提供一種製備固體物品的方法，如裝飾品、唱片和文具等，通過將供體的DNA注入物品而使其含有DNA，本發明還提供了一種製備無定形物品的方法，如香水和墨水，通過將供體的DNA與物品混合而使其含有DNA。這兩種方法採用了DNA提取和擴增技術。
根據本發明的一個實施例，其提出了一種製備含有DNA的固體物品的方法，該方法包括的步驟有從供體獲取含有DNA的樣品；從樣品中提取出DNA；擴增提取出的DNA；將擴增的DNA的溶液通過空腔的開口注入物品內的空腔；最後封好空腔的開口。
另一種辦法是，將擴增的DNA的溶液乾燥成膠態或固態並且將乾燥的DNA放入所述固體物品的空腔內。
根據本發明的另一個實施例，其提出了一種製備含DNA的無定形物品的方法，該方法包括的步驟有從供體獲取含有DNA的樣品；從樣品中提取出DNA；擴增提取出的DNA；將擴增的DNA的溶液與物品混合。
另一種辦法是，將擴增的DNA的溶液乾燥成膠態或固態並且將乾燥的DNA與無定形物品混合。
根據本發明的再一個實施例，其提出了一種製備含有DNA的固體物品的方法，該方法包括的步驟有從供體獲取含有DNA的樣品；從樣品中提取出DNA；擴增提取出的DNA；將擴增的DNA置於聚丙烯醯胺膠體中形成電泳；將形成電泳的DNA染色；將含有染色了的DNA的膠體乾燥以得到膠體膜；並將膠體膜應用於物品表面。
根據本發明的還一個實施例，其提出了一種製備含有DNA的固體物品的方法，該方法包括的步驟有從供體獲取含有DNA的樣品；從樣品中提取出DNA；擴增提取出的DNA；用擴增的DNA製取HLA DNA帶；並且將該HLA DNA帶應用於物品表面。
本發明也提供了採用上述任何一種方法製備的、含有DNA的物品。
DNA供體可以是任何具有DNA的有機活體，包括人類在內。由於對該物品的需求，與名人有關的被紀念的人物，如政治領袖、宗教領袖、作家、電影明星、體育明星和歌手，是優選的DNA供體。然而，家庭成員、團體成員或寵物也可是供體，因為與這些供體相關的物品分別地對於其他家庭成員、團體成員或寵物主人是有意義的。
所述DNA樣品可以是能從供體獲取並包含供體的DNA的任何部分或樣品。對於人DNA供體來說，血液、毛髮、皮膚組織、指甲、趾甲等等可方便地用做DNA樣品。
DNA可用各種已知方法提取和復原，但這些方法可根據被使用的DNA樣品調整[Buffone等，不用苯酚提取而從生物學樣品中分離DNA(Isolation of DNA from biological specimens without extractionwith phenol.)Clin.Chem.31:164-165,1985]。如果，例如，樣品是血液，將EDTA血液和紅細胞(RBC)溶胞緩衝液與該樣品混合併且將該混合液離心分離。由此獲得的分離物與Chelex樹脂混合併煮沸以提取DNA。
根據本發明，天然基因組的DNA可被用來製備含DNA的物品。然而，因僅有少量天然DNA可被從樣品中提取出來，所以優選將提取出的天然DNA擴增。
DNA擴增可通過聚合酶鏈反應，或通過兩步擴增來實現，其中兩步擴增即第一步擴增包括一個聚合酶鏈反應，第二步擴增包括將在第一步中擴增了的DNA插入載體以獲得重組質粒，將該重組質粒植入宿主細胞，培養被重組質粒轉換的宿主細胞，並分離如此大量產生的重組質粒。
所述聚合酶鏈反應(PCR)可根據Mullis等人的方法，利用傳統聚合酶鏈反應工具來實現。基因試劑盒(HLA基因型試劑盒，Inno-lipa有限公司)可方便地用於擴增過程。
在採用質粒的第二步擴增過程中，通過聚合酶鏈反應擴增的DNA可被克隆，例如，通過利用TA克隆試劑盒(Invitrogen)。另外，擴增的DNA可無需dNTP而在含有T4 DNA聚合酶的媒介物中反應15分鐘，然後再與dNTP反應15分鐘以獲得鈍端DNA，其中從該DNA每端突出的T和A鹼基已被移除。另外，用於克隆過程的適當的載體被諸如SmaⅠ的鈍端限制酶分裂。對於如此獲得的載體，鈍端DNA被T4 DNA連接酶連接。
如此構造的質粒可被引入適當的宿主細胞用以大量分離重組質粒。該宿主細胞可以是E.coli HB101、E.coli CSH 41，等等。根據本發明被所述質粒轉換的宿主細胞採用Luria Broth(LB)媒介物培養，然後，可用Birnboin Doly的方法(1979)來提取和分離該大量產生的質粒。
得到的DNA溶液可通過空腔的開口注入固體物品內的空腔，然後封住空腔的開口以得到含有DNA的物品。另外可行的是，該DNA溶液可乾燥成膠態或固態，並且將該乾燥的DNA注入固體物品的空腔中。在注入物品前，該DNA溶液或乾燥的DNA可被染色以使其看起來更清晰。在注入物品前，該DNA溶液可用染色試劑染色，如溴酚藍或苯酚紅以及可選擇地與甘油混合。
在說明書和權利要求書中，「固體」物品是指任何具有一定形狀的物體，其可非限制性包括首飾如戒指、項鍊、耳環，書寫用具如筆、鋼筆、鉛筆、鉛筆盒，以及鑰匙鏈，洋娃娃，玩具，鞋，書包，手包，錢包，唱片，CD片。
所述物品的空腔，即DNA注入處，可由傳統加工方法製成。為了增強由染色DNA帶來的裝飾效果，該固體物品的空腔優選為一異形。透明部分可以是各種形狀。根據本發明的含有DNA的物品可進一步被下列的方法修飾，如雙鏈DNA螺旋線圖、籤字和/或DNA供體的照片以表明該物品含有供體的DNA。
所述擴增的DNA的溶液在與無定形物品混合前可選擇地被乾燥。「無定形」物品是指任何不具有一定形狀的物品，其可非限制性包括如下物品，如香水、墨水、墨汁和染料等。
根據本發明實施例，所述擴增的DNA可在聚丙烯醯胺膠體中形成電泳，染色並乾燥以獲得含有DNA的膠體膜。得到的膠體膜可用於固體物品表面。
當從血液樣品中提取DNA時，HLA DNA帶可用於物品表面以起到裝飾效果。所述DNA供體的特殊特性可由此通過該HLA DNA帶展示出來。
所述HLA DNA帶可按如下方法製備。從血液樣品中提取DNA並將其擴增。擴增的DNA可與諸如從Inno-lipa有限公司獲得的試劑盒帶反應。因用來識別白細胞的各種DNA序列的探針存在於該帶上，所以這些探針通過形成鹼基對而與DNA結合。若將可與DNA反應的染色試劑加到該帶上，則染色試劑將和與所述探針結合的DNA反應以成色。所述帶根據DNA的供體的不同而變化，因為每個供體都有他或她自己特殊的DNA鹼基序列。
因根據本發明的方法製備的物品含有DNA，其代表了該DNA供體的特殊特性，人們通過佩帶這些物品而紀念該供體，如名人、家庭成員、愛人、寵物等等。
而且，根據本發明的方法製備的物品與不含有DNA的物品相比截然不同。本發明的方法可用於鑑別某物品的真偽。
存在於根據本發明方法製備的物品中的DNA可長期保存而不變質。因此，該DNA可用來鑑別一個人的身份也就是，存在於根據本發明方法製備的物品中的DNA可與從一個人身上獲得的用來鑑別身份的DNA相比較，由此可確定(若需要的話)其是不是該供體，或者是否與該供體有遺傳關係。
下述實施例用以說明根據本發明製備含有DNA物品的方法。
實施例1DNA的提取將從供體採集來的全血3ml置於EDTA塗覆的試管中並放置在2-8℃的冰箱裡。
將50μl的EDTA血液和RBC溶胞緩衝溶液置於已消毒的1.5ml的微型離心試管中，在13000rpm轉速下離心旋轉一分鐘以獲得沉澱物。所得沉澱物用500μl消毒水洗滌。重複離心和洗滌步驟直到除去所有殘留的RBC。然後在洗滌過的沉澱物中加入200μl的Chelex樹脂，煮沸10分鐘後進行離心分離。將如此所獲得的10μl上清液用於進一步的擴增過程。可重複10分鐘的煮沸和隨後的冷藏步驟。
DNA的擴增將在下表1中所示的材料混合，用一種聚合酶鏈式反應工具(Inno-lipa有限公司的HLA基因型試劑盒)將該混合物在下表2中所述的條件下進行DNA擴增。
表1 擴增混合物(總量50μl)
表2 聚合酶鏈式反應條件
預處理1、HLA DNA帶的製備HLA DNA帶可採用HLA試劑盒(Inno-lipa有限公司)由擴增的DNA製備。
2、用於注入的DNA溶液的製備由擴增過程獲得的DNA通過TA克隆試劑盒(Invitrogen有限公司)克隆入載體中。克隆的質粒被大量分離。使用E.coli HB101，並且將該轉換的E.coli HB101置於37℃條件下搖動溫育18小時。起初的HB101在傳統的LB(Luria Broth)媒介物中培育過夜。經培育的細菌用500ml的LB稀釋至1/100，然後在該媒介物中接種並培養。採用Birnboin Doly(1979)的方法分離質粒。將含有目標質粒DNA的E.coli HB101在37℃條件下培養18小時。將用於分離該質粒的試劑SolⅠ[50mM葡萄糖，25mM Tris·Cl(pH 8.0),10mM EDTA(pH 8)]、SolⅡ(0.2N NaOH,1％ SDS)和SolⅢ(5M醋酸鉀60ml，冰醋酸11.5ml，水28.5ml)按順序加入，溫和攪拌由此獲得的混合物，然後在14000rpm的轉速下離心分離10分鐘。將由此獲得的上清液加入等量的苯酚∶氯仿(1∶1)中，劇烈混合然後離心分離。將該步驟重複2次或3次。在獲得的清亮的上清液中加入100％乙醇(2倍)，將該混合物冷藏10分鐘然後離心分離。棄置上清液並乾燥剩餘物，用1ml 70％的乙醇洗滌1次，乾燥，與TE緩衝液混合以溶解DNA，然後冷藏。
將甘油和溴酚藍加入由此獲得的DNA溶液中。
後處理將2個圓形丙烯酸板(每個直徑為5cm，厚0.5cm)疊放在一起以便在板的相鄰表面間形成空腔。其中一個板上有一個與空腔相連的孔並且由此將DNA溶液注入空腔。板上還有一構件以使一環狀物可與其相連。如圖1所示，HLA帶附著在板的側邊，並且將該DNA供體的照片和絲印籤名印製在板的外表面。丙烯酸板在其側邊處相互接觸連接。在預處理過程中製備的DNA溶液通過位於一個板上的孔注入空腔，然後將孔封住。如此生產的丙烯酸物品(厚1cm)是平面對稱的。通過在丙烯酸物品的環連接構件上插入一個環來製成一個鑰匙鏈。
實施例2DNA的提取將由供體獲得的毛髮從根部剪斷成5cm以內的小段。在5ml的試管中將毛髮與200μl的Chelex樹脂混合，將混合物煮沸10分鐘以除去DNA以外的細胞碎片。然後在12000rpm的轉速下將混合物離心分離。將由此獲得的上清液用於進一步的擴增過程。
DNA的擴增按下表3所示製備所述擴增混合物，然後按下表4所示聚合酶鏈反應條件實施DNA擴增過程。
表3 擴增混合物(總量50μl)
表4 聚合酶鏈反應條件
預處理1、含有DNA的聚丙烯醯胺膠體膜的製備製備10％聚丙烯醯胺膠體並加入擴增了的DNA。通過對電泳柱施以200V的電壓以使DNA形成電泳。電泳完成後，將膠體在0.4％的硝酸銀溶液中沉澱30分鐘以使膠體中的DNA染色。將膠體放置在兩層玻璃紙間並乾燥以得到含DNA的堅硬的膠體膜(1mm長，3cm厚)。
2、被注入的DNA溶液的製備向通過擴增過程獲取的DNA中加入苯酚紅和甘油，以獲取被注入的DNA溶液。
後處理根據實施例1的方法製備鑰匙鏈，只是用含有DNA的聚丙烯醯胺膠體代替HLA DNA帶。
根據本發明，可製備各種含有DNA的物品。這些物品可代表該DNA供體的獨特特性並且可長久保持。
權利要求
1.一種製備含有DNA的固體物品的方法，該方法包括的步驟有從供體獲得包含DNA的一個樣品；從該樣品中提取出DNA；擴增提取出的DNA；通過空腔的開口向物品中的空腔注入該擴增的DNA的溶液；並且封住空腔的開口。
2.根據權利要求1的製備含有DNA物品的方法，其中所述DNA擴增步驟是通過聚合酶鏈反應來實現的。
3.根據權利要求1的製備含有DNA物品的方法，其中所述DNA擴增步驟是通過兩步擴增來實現的，第一步擴增包括一個聚合酶鏈反應，並且接下來的第二步擴增包括以下步驟將在第一步擴增過程中擴增了的DNA插入載體以得到重組質粒，將該重組質粒引入宿主細胞，培養通過重組質粒轉換的宿主細胞，並且分離由此大量產生的質粒。
4.根據權利要求1-3任何一項的製備含有DNA物品的方法，其中所述擴增的DNA的溶液在注入物品中的空腔之前被乾燥成膠體態或固態。
5.根據權利要求1-3任何一項的製備含有DNA物品的方法，其中所述擴增的DNA的溶液在注入物品中的空腔之前被染色。
6.一種製備含有DNA的無定形物品的方法，該方法包括的步驟有從供體獲得包含DNA的一個樣品；從該樣品中提取出DNA；擴增提取出的DNA；並且將該擴增的DNA的溶液與物品混合。
7.根據權利要求6的製備含有DNA物品的方法，其中所述無定形物品選自香水、墨水、墨汁和染料。
8.根據權利要求6或7的製備含有DNA物品的方法，其中所述擴增了的DNA的溶液在與物品混合之前被乾燥成膠體態或固態。
9.一種製備含有DNA的固體物品的方法，該方法包括的步驟有從供體獲得包含DNA的一個樣品；從該樣品中提取出DNA；擴增提取出的DNA；將該擴增的DNA置於聚丙烯醯胺膠體中形成電泳；將該形成電泳的DNA染色；乾燥含有染色DNA的膠體以獲得膠體膜；並且將該膠體膜應用於物品的表面。
10.一種製備含有DNA的固體物品的方法，該方法包括的步驟有從供體獲得包含DNA的一個樣品；從該樣品中提取出DNA；擴增提取出的DNA；用該擴增的DNA製備HLA DNA帶；並且將該HLA DNA帶應用於物品的表面。
11.根據權利要求1-10任何一項的方法製備的含有DNA的物品。
全文摘要
一種製備含DNA物品的方法,該方法包括以下步驟:從供體獲取含DNA的樣品;從該樣品中提取出DNA;擴增提取出的DNA;通過空腔的開口向物品裡的空腔中注入該擴增的DNA的溶液;並且封住該空腔的開口,其中所述物品具有一定的形狀,或若物品為無定形時,將擴增的DNA的溶液與該物品混合。
文檔編號A44C3/00GK1306402SQ99807627
公開日2001年8月1日 申請日期1999年6月24日 優先權日1998年6月24日
發明者任勇彬 申請人:恆星基因有限公司