一種在大腸桿菌中一步法合成dna片段並組裝合成基因的方法

2023-06-01 03:52:01 2

一種在大腸桿菌中一步法合成dna片段並組裝合成基因的方法
【專利摘要】本發明提出了一種在大腸桿菌中一步法合成DNA片段並組裝合成基因的方法，主要步驟包括：構建LIC載體質粒LIC-A；製備LIC-A線性載體；構建組裝DNA片段的受體載體puc-Kana；選擇目標基因，劃分300bp左右的小片段進行合成；多個小片段DNA利用金門克隆反應組裝成大片段基因。本發明操作簡單，無需再重複做克隆和測序的操作，直接退火，克隆效率高，使用了發光報告基因sfgfp、gfp，篩選方法直觀，合成方法的錯誤率很低，合成基因的周期短，大大節約了成本，節約了時間。本發明適用於各種基因的合成，對於大基因的合成特別有效。
【專利說明】一種在大腸桿菌中一步法合成DNA片段並組裝合成基因的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種基因合成方法的研究，是一種在大腸桿菌中一步法合成DNA片段並組裝合成基因的方法，屬於基因工程【技術領域】。
【背景技術】
[0002]合成生物學是生命科學在二十一世紀剛剛出現的一個分支學科，近年來合成生物學的研究進展很快，特別是基因合成技術。全基因合成是依照某一蛋白質的基因序列，設計合成相互重疊的單鏈寡核苷酸，再通過重疊延伸PCR法拼接出全長，基因合成無需模板，是獲取基因的手段之一。通過全基因合成實現基因的分子改造和人工組建正成為一種實驗室常規手段。因此，建立一種能夠在相對低廉和短時間內準確和高效地設計和合成長片段基因的方法十分重要。
[0003]隨著合成生物學的研究越來越流行，人們對生命的探究不再僅僅局限在宏觀生物上，而是從更簡單的基本單元基因著手，至從上個世紀70年代以來分子生物學基因工程迅猛發展，到目前為止DNA合成的方法主要集中3種方法:(I)化學合成方法，由於化學合成的原理決定了化學法合成的DNA片段不可能太長，所以主要用於寡核苷酸的合成；(2) PCR介導的合成方法，這種方法是可以合成大的DNA片段，而且周期也比較短，但是到目前為止，PCR介導的合成方法錯誤率比較高，尤其對於合成大於2kb以上的DNA由於錯誤率高，所以為了得到正確的克隆，需要做多次克隆和測序的重複工作，這樣成本會很高；而且由於是PCR介導的方法，需要DNA高溫聚合酶和DNTP等試劑，這樣成本會比較高；(3)非PCR介導的方法，到目前為止報導的基於非PCR的DNA合成方法主要是DNA的固相合成技術。這種固相合成技術，在合成中的`錯誤率確實大大降低了很多，但是由於在合成的時候引物需要經過特殊的修飾，再加上該方法需要建庫，引物成本會比較高；其次是由於該方法每次只能增加3個鹼基，這樣合成的速度會比較慢，特別對於大的DNA片段的合成，周期尤為長，雖然可以實現自動化操作，但是對於一般的實驗室研究不是很實用。
[0004]鑑於目前的基因合成的方法中錯誤率高，合成成本高等問題，有必要尋找新的基因合成方法來解決現有技術存在的問題。

【發明內容】

[0005]本發明的目的是提出一種在大腸桿菌中一步法合成DNA片段並組裝合成基因的一種新的基因合成方法。該方法利用大腸桿菌自身的修復機制，在大腸桿菌中一步法合成DNA片段，並把DNA小片段組裝合成基因。主要步驟包括:載體的改造，線性載體的製備，小DNA片段的合成，組裝DNA片段的載體的構建，多個300bp左右的DNA片段的組裝合成基因。
[0006]具體做法如下:
[0007]I)、構建 LIC 載體 LIC-A。
[0008]以商品化的pet23a和pLP_VSVG載體用常規方法構建T7_sfgfp質粒，以sfgfp-PF/PBR - PR、T7-sfgfp質粒為模板，通過PCR擴增得到線性載體骨架LIC (3.5kb)(序列列表對應為NOl);設計SPC-PF/SPC-PR(序列見表1)為兩對引物，以T7_sfgfp為模板，通過PCR擴增得到SPC盒式結構(Ikb)(序列列表對應為N02)，擴增好的SPC盒式結構的兩端都帶上了一個限制性酶切位點(BciVI)和13bp的片段填充序列和T7啟動子下遊的10個鹼基的序列；其次，在載體骨架LIC-A和SPC盒式結構兩端引入了 20bp的同源序列，擴增獲得的SPC盒式結構，通過無酶克隆的方式(Zhu D, Zhong X，Tan R, ChenL,Huang G, Li J, et al.High-throughput cloning of human liver complete openreading frames using homologous recombination in Escherichia col1.[J]AnalBiochem.2010; 397 (2): 162-7)克隆到載體骨架LIC-A上。經過限制性內切酶酶切和測序鑑定得到正確的LIC-A載體質粒(序列列表對應為N03)，命名為LIC-A載體質粒(構建過程見圖1)。
[0009]表1骨架載體LIC-A構建中使用的引物
[0010]
【權利要求】
1.一種在大腸桿菌中一步法合成DNA片段並組裝合成基因的方法，其特徵在於主要步驟包括:構建LIC載體質粒LIC-A ；LIC-A線性載體的製備；構建組裝DNA片段的受體載體puc-Kana;選擇目標基因，劃分300bp左右的小片段進行合成；多個小片段DNA用金門克隆反應組裝成大片段基因。
2.根據權利要求1所述的一種在大腸桿菌中一步法合成DNA片段並組裝合成基因的方法，其特徵在於具體步驟為: 1)、構建LIC載體LIC-A 以商品化的pet23a和pLP_VSVG載體用常規方法構建T7_sfgfp質粒，以sfgfp-PF/PBR - PR、T7-sfgfp質粒為模板，通過PCR擴增得到線性載體骨架LIC ;設計SPC-PF/SPC-PR為兩對引物，以T7-sfgfp為模板，通過PCR擴增得到SPC盒式結構；擴增好的SPC盒式結構的兩端都帶上了一個限制性酶切位點BciVI和13bp的片段填充序列和T7啟動子下遊的10個鹼基的序列；其次，在載體骨架LIC和SPC盒式結構兩端引入20bp的同源序列，擴增獲得的SPC盒式結構，通過無酶克隆的方式克隆到載體骨架LIC上；經過限制性內切酶酶切和測序鑑定得到正確的LIC-A載體質粒； 2)、LIC-A線性載體的製備(如圖2所示)，把測序正確的LIC-A質粒先用限制性內切酶BciVI在37°C酶切，並凝膠回收後的產物，然後再用T4DNA聚合酶3次分別在加dGTP、dCTP、dTTP的保護下12°C利用T4DNA聚合酶消化30min，溶液回收後備用，這樣處理的載體在其3』端各突出13nt ； 3)、構建組裝DNA片段的受體載體puc-Kana 首先，以PBR322-PF/PBR322-PR為引物，以商品化的puc_19質粒為模板，通過PCR擴增獲得線性骨架載體片段PBR322 ;以gfp-PF/gfp-PR為引物，以pGSilG-Lic為模板，通過PCR獲得兩端帶有BspQI酶切位點和EarI酶切位點的gfp盒式結構；以Kana-PF/Kana-PR為引物，以pGSilG-Lic為模板通過PCR擴增，獲得Kana盒式結構；其次，通過重疊延伸PCR(Overlap Extension PCR)將gfp盒式結構和Kana盒式結構拼接成gfp-Kana單元； 最後，將gfp-Kana單元和線性骨架載體片段PBR322進行1:3混合通過無酶克隆方式轉化大腸桿菌XL-Gold進行克隆；挑取在藍光儀下發綠光的菌落，通過質粒電泳、質粒酶切鑑定和質粒測序等方式得到了正確的大小為3686bp的puc-Kana質粒； 4)、選擇目標基因，劃分300bp左右的小片段進行合成 先選擇確定目標基因XY，將需要合成的目標基因的DNA序列按照每300bp左右進行劃分為G1、G2、G3、G4、G5……多個小片段，分別設計彼此重疊(over lapping) 17bp左右且無縫的引物序列對，每個300bp左右的片段需要合成12條長度為40-45nt左右的寡核苷酸引物；再分別將合成好的12條寡核苷酸序列稀釋成終濃度10 μ Μ，然後分別取0.5 μ L至一 PCR管內， 加2ul的LA Taq Buffer最後加雙蒸水至終體積20 μ L混合；分別讓其按照94°C 5min, 94°C a37°C slope20min, 37°C 7min的逐步降溫的程序退火,且首尾兩條引物的5』端分別引入13nt與線性載體同源互補的序列； 將步驟2)準備好的線性載體與退火形成的小DNA片段混合，37°C放置30min後轉化大腸桿菌感受態細胞，通過重構T7啟動子啟動下遊報告基因sfgfp的表達，將篩選後測序正確重組子分別命名為XYG1、XYG2、XYG3、XYG4、XYG5......; 5)、多個小片段DNA組裝成大片段基因要合成大於300bp以上的DNA片段，需要用步驟4的XYG1、XYG2、XYG3、XYG4、XYG5......質粒作為供體質粒，再另加切好的受體載體質粒puc-Kana做金門克隆反應，這樣就合成了與目標基因相同的合成基因 。
【文檔編號】C12N15/70GK103725674SQ201310753413
【公開日】2014年4月16日 申請日期:2013年12月31日 優先權日:2013年12月31日
【發明者】馬立新, 陳晚蘋, 陳羽西, 汪曉娟, 楊琥, 餘先紅 申請人:湖北大學