糧食、飼料中蛋白質含量的測定方法

2023-06-01 03:41:06

糧食、飼料中蛋白質含量的測定方法
【專利摘要】本發明公開了一種糧食、飼料中蛋白質含量的測定方法，包括建立標準曲線、樣品前處理、檢測蛋白質含量等步驟。本發明準確、簡便。通過實際樣品測定、與凱氏定氮法結果比較、添加幹擾試驗、重複性試驗等，本方法法具有靈敏度高、結果比較準確、不受大多數幹擾物影響，操作簡便、適合大量樣品測定等優點。該法測定結果與凱氏定氮法比較數據基本相近，符合度從95.2%(大豆)至110%(玉米)不等，其他大多數種類樣品接近100%。實際樣品測定結果的變異係數小於5%，大多在3%以內，重複性好。
【專利說明】糧食、飼料中蛋白質含量的測定方法

【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種糧食、飼料中蛋白質含量的測定方法。

【背景技術】
[0002] 2007年3月中旬起的幾個月內，美國發生多起貓、狗寵物中毒死亡事件。美國食品 藥品管理局（FDA)調查發現從山東、江蘇等地進口的部分小麥蛋白粉和大米蛋白粉中檢出 三聚氰胺，並初步認為寵物食品中含有的三聚氰胺是導致貓、狗中毒死亡的原因。
[0003] 三聚氰胺（melamine)是一種氮雜環化合物，分子式C3N6H6,分子量126. 12,含氮 量66. 624%，其來源自石油或煤炭的有機化工原料。主要作為浴缸、粘合劑，餐具等塑料制 品的生產原料，還會添加到化肥中。對三聚氰胺加熱，就會產生毒性物質--氨成分。
[0004] 其實，很長時間以來，飼料中就有添加尿素、硫酸銨等非蛋白氮化合物，以提高飼 料中蛋白質的檢出量，從而使飼料價格得到提高。反芻動物瘤胃內微生物將飼料中的大部 分蛋白質和含氮化合物分解為氨，再利用氨合成菌體蛋白，菌體蛋白質進入後段消化道被 吸收利用，因此反芻動物飼料中補充一定量的非蛋白含氮化合物可以部分節省飼料中的蛋 白質。然而，氨化物並不能被單胃動物（如豬、禽等）利用，給非反芻動物添加非蛋白含氮 化合物或給反芻動物添加過量，一方面會發生氨中毒，另一方面這種冒充蛋白飼料使動物 得不到足夠的蛋白質供給，出現營養障礙，最為令人擔憂的是汙染動物性食品，危害人類健 康。
[0005] 目前，測定糧食、飼料以及食品等蛋白質含量的方法，國標和相關行業標準一般均 採用凱氏定氮法。如GB/T5009. 5 - 2003食品中蛋白質的測定，GB2905 - 1982穀類、豆 類作物種子粗蛋白測定法，GB6432 - 1986和GB/T6432 - 1994飼料蛋白質測定法，SN/ T0800. 3 - 1999進出口糧食、飼料粗蛋白質檢驗方法，等等，與美國FDA規定的用於營養標 籤的法定蛋白質分析方法基本相同。凱氏定氮法最大的問題是如果樣品中存在非蛋白含氮 物時，一同被蒸餾而測出並折算成了蛋白質，嚴重影響蛋白質測定結果。目前還沒有"適用 於添加無機含氮物質、有機非蛋白質含氮物質的食品測定"的方法。
[0006] 因此，需要建立一種準確測定糧食、飼料中真蛋白質含量的方法，以杜絕添加非蛋 白含氣物質冒充1?蛋白廣品。


【發明內容】

[0007] 本發明的目的在於提供一種準確、簡便的糧食、飼料中蛋白質含量的測定方法。
[0008] 本發明的技術解決方案是：
[0009] -種糧食、飼料中蛋白質含量的測定方法，其特徵是：包括下列步驟：
[0010] (一）建立標準曲線：
[0011] (1)試劑配製
[0012] 標準蛋白溶液0. lmg/mL :以1. Omg/mL標準蛋白溶液稀釋10倍，使用前配製；
[0013] 福林一酚試劑甲液：由A、B兩種溶液組成：
[0014] A液：4%碳酸鈉溶液與0. 2mol/L氫氧化鈉溶液等體積混合；
[0015] B液：1 % CuS04 · 5H20溶液與2 %酒石酸鉀鈉溶液等體積混合；
[0016] 使用前將A與B按50:1的體積比混合即成，此試劑只能在使用當天配製；
[0017] 福林一酚試劑乙液：稱取鎢酸鈉 Na2W04 · H20100g，鑰酸鈉 Na2Mo04 · 2H2025g，加蒸 餾水700mL溶解，置於1500mL的圓底燒瓶中；加入85% H3P0450mL，濃HCllOOmL，按上回流 裝置，加熱使其沸騰、回流蒸餾l〇h ;冷卻後加入硫酸鋰Li2S04. H20150g，蒸餾水50mL，溴水 2?3滴，打開瓶口煮沸15min，以逐出過量的溴，冷卻後溶液呈黃色，並稀釋至lOOOmL，過濾 入棕色瓶中保存；使用時加水使最終濃度相當於lmol/L酸度，使用前應進行標定；
[0018] (2)製作曲線
[0019] 取7支試管，加入不同量的標準蛋白和蒸餾水混勻後，每管加入4mL酚試劑甲液， 混勻，於37°C下放置10min ;再向試管中加入0. 4mL酚試劑乙液，立即振蕩混勻，在37°C下 準確保溫30min，用lcm光徑比色皿在750nm下測定吸光度；以蛋白質濃度為橫坐標，以吸 光度為縱坐標繪製標準曲線；
[0020] (二）樣品前處理：
[0021] (1)樣品：
[0022] 麵粉、大米、大豆、玉米、苜蓿乾草、玉米秸杆、鮮豬肉、火腿；大米、大豆、玉米、苜蓿 乾草、玉米秸杆，用小型臺式粉碎機進行粉碎，取粉末裝瓶，置於乾燥器內保存備用；鮮豬 肉、火腿用刀片式絞碎機絞成肉泥狀，裝瓶備用；
[0023] (2)樣品的處理
[0024] 消化條件的選擇：
[0025] 麵粉樣品，稱取0. 3g，NaOH終濃度0. 25mol/L16mL，50°C水浴消化0. 5h ;其他樣 品，粉碎或絞成泥狀後取〇. 3g，NaOH終濃度1. 0mol/L16mL，置50°C水浴中消化，大米粉、玉 米粉、鮮肉、火腿消化lh，大豆粉消化2h，苜蓿乾草、玉米秸杆消化4h ;消化結束後，搖勻，除 大豆消化液以蒸餾水作60倍稀釋外，其它消化液以蒸餾水作30倍稀釋；4000r/min離心 5min ；
[0026] (三）檢測蛋白質含量：
[0027] 取上清液放入試管，並在試管中加入4mL酚試劑甲液，混勻，於37°C下放置10min ; 再向試管中加入〇. 4mL酚試劑乙液，立即振蕩混勻，在37°C下準確保溫30min，用lcm光徑 比色皿在750nm下測定吸光度，並根據測定結果與標準曲線對比得到樣品蛋白質含量。
[0028] 步驟（1)試劑配製中所述的使用前應進行標定，其標定方法：取5mL福林-酚試 劑乙液放入錐形瓶內，用lmol/L標準氫氧化鈉溶液滴定，酚酞作指示劑，當溶液突然變紅 再轉灰綠時，即為滴定終點；計算其相當的酸度，用鹽酸或氫氧化鈉溶液調至相當於lmol/ L的酸度。
[0029] 本發明準確、簡便。通過實際樣品測定、與凱氏定氮法結果比較、添加幹擾試驗、重 復性試驗等，本方法法具有靈敏度高、結果比較準確、不受大多數幹擾物影響，操作簡便、適 合大量樣品測定等優點。該法測定結果與凱氏定氮法比較數據基本相近，符合度從95. 2% (大豆）至110% (玉米）不等，其他大多數種類樣品接近100%。實際樣品測定結果的變 異係數小於5%，大多在3%以內，重複性好。
[0030] 樣品添加幹擾試驗表明，非蛋白含氮物中三聚氰胺、硫酸銨、尿素、生物蛋白精較 大劑量時對本方法基本無幹擾作用。添加縮二脲66. 7g/kg時無幹擾，添加333. 3g/kg時結 果增加14.91%。在飼料、糧食成分或可能添加成分中，氯化鈉、蔗糖在高劑量時基本無幹 擾；檸檬酸鈉、維生素 C、維生素 B1、肌醇、除酪氨酸外的多種胺基酸等在常規用量至高於其 數倍或數十倍添加時不產生明顯幹擾。
[0031] 對本方法幹擾比較明顯的有酪氨酸、葡萄糖、麥芽糖和維生素 B1。因為維生素 B1 常規推薦最大劑量僅為6mg/kg，而添加2g/kg以內時沒有明顯幹擾。
[0032] 下面結合實施例對本發明作進一步說明。

【具體實施方式】
[0033] -種糧食、飼料中蛋白質含量的測定方法，包括下列步驟：
[0034] (一）建立標準曲線：
[0035] ⑴試劑配製
[0036] 標準蛋白溶液0. lmg/mL :以1. Omg/mL標準蛋白溶液稀釋10倍，使用前配製；
[0037] 福林一酚試劑甲液：由A、B兩種溶液組成：
[0038] A液：4%碳酸鈉溶液與0. 2mol/L氫氧化鈉溶液等體積混合；
[0039] B液：1 % CuS04 · 5H20溶液與2 %酒石酸鉀鈉溶液等體積混合；
[0040] 使用前將A與B按50:1的體積比混合即成，此試劑只能在使用當天配製；
[0041] 福林一酚試劑乙液：稱取鎢酸鈉 Na2W04 · H20100g，鑰酸鈉 Na2Mo04 · 2H2025g，加蒸 餾水700mL溶解，置於1500mL的圓底燒瓶中；加入85% H3P0450mL，濃HCllOOmL，按上回流 裝置，加熱使其沸騰、回流蒸餾l〇h ;冷卻後加入硫酸鋰Li2S04. H20150g，蒸餾水50mL，溴水 2?3滴，打開瓶口煮沸15min，以逐出過量的溴，冷卻後溶液呈黃色，並稀釋至lOOOmL，過濾 入棕色瓶中保存；使用時加水使最終濃度相當於lmol/L酸度，使用前應進行標定；其標定 方法：取5mL福林-酚試劑乙液放入錐形瓶內，用lmol/L標準氫氧化鈉溶液滴定，酚酞作指 示劑，當溶液突然變紅再轉灰綠時，即為滴定終點；計算其相當的酸度，用鹽酸或氫氧化鈉 溶液調至相當於lmol/L的酸度。
[0042] (2)製作曲線
[0043] 取7支試管，加入不同量的標準蛋白和蒸餾水混勻後，每管加入4mL酚試劑甲液， 混勻，於37°C下放置10min ;再向試管中加入0. 4mL酚試劑乙液，立即振蕩混勻，在37°C下 準確保溫30min，用lcm光徑比色皿在750nm下測定吸光度；以蛋白質濃度為橫坐標，以吸 光度為縱坐標繪製標準曲線；
[0044] 表1標準曲線操作步驟和結果
[0045]

【權利要求】
1. 一種糧食、飼料中蛋白質含量的測定方法，其特徵是：包括下列步驟： (一） 建立標準曲線： (1) 試劑配製 標準蛋白溶液0. lmg/mL :以1. 0 mg/mL標準蛋白溶液稀釋10倍，使用前配製； 福林一酚試劑甲液：由A、B兩種溶液組成： A液：4%碳酸鈉溶液與0. 2mol/L氫氧化鈉溶液等體積混合； B液：1% CuS04 · 5H20溶液與2%酒石酸鉀鈉溶液等體積混合； 使用前將A與B按50:1的體積比混合即成，此試劑只能在使用當天配製； 福林一酚試劑乙液：稱取鎢酸鈉 Na2W04 · H20100g，鑰酸鈉 Na2Mo04 · 2H2025g，加蒸餾水 700mL溶解，置於1500mL的圓底燒瓶中；加入85% H3P0450mL，濃HC1 100 mL，按上回流裝 置，加熱使其沸騰、回流蒸餾l〇h ;冷卻後加入硫酸鋰Li2S04. H20150g，蒸餾水50mL，溴水2~3 滴，打開瓶口煮沸15min，以逐出過量的溴，冷卻後溶液呈黃色，並稀釋至lOOOmL，過濾入棕 色瓶中保存；使用時加水使最終濃度相當於lmol/L酸度，使用前應進行標定； (2) 製作曲線 取7支試管，加入不同量的標準蛋白和蒸餾水混勻後，每管加入4mL酚試劑甲液，混勻， 於37°C下放置10min ;再向試管中加入0. 4mL酚試劑乙液，立即振蕩混勻，在37°C下準確保 溫30min，用lcm光徑比色皿在750nm下測定吸光度；以蛋白質濃度為橫坐標，以吸光度為 縱坐標繪製標準曲線； (二） 樣品前處理： (1) 樣品： 麵粉、大米、大豆、玉米、苜蓿乾草、玉米秸杆、鮮豬肉、火腿；大米、大豆、玉米、苜蓿幹 草、玉米秸杆，用小型臺式粉碎機進行粉碎，取粉末裝瓶，置於乾燥器內保存備用；鮮豬肉、 火腿用刀片式絞碎機絞成肉泥狀，裝瓶備用； (2) 樣品的處理 消化條件的選擇： 麵粉樣品，稱取〇. 3g，NaOH終濃度0. 25mol/L 16mL，50°C水浴消化0. 5h ;其他樣品， 粉碎或絞成泥狀後取〇. 3g，NaOH終濃度1.0 mol/L 16mL，置50°C水浴中消化，大米粉、玉 米粉、鮮肉、火腿消化lh，大豆粉消化2h，苜蓿乾草、玉米秸杆消化4h ;消化結束後，搖勻，除 大豆消化液以蒸餾水作60倍稀釋外，其它消化液以蒸餾水作30倍稀釋；4000r/min離心 5min ； (三） 檢測蛋白質含量： 取上清液放入試管，並在試管中加入4mL酚試劑甲液，混勻，於37°C下放置10min ;再向 試管中加入〇. 4mL酚試劑乙液，立即振蕩混勻，在37°C下準確保溫30min，用lcm光徑比色 皿在750nm下測定吸光度，並根據測定結果與標準曲線對比得到樣品蛋白質含量。
2. 根據權利要求1所述的糧食、飼料中蛋白質含量的測定方法，其特徵是： 步驟（1)試劑配製中所述的使用前應進行標定，其標定方法：取5mL福林-酚試劑乙液 放入錐形瓶內，用lmol/L標準氫氧化鈉溶液滴定，酚酞作指示劑，當溶液突然變紅再轉灰 綠時，即為滴定終點；計算其相當的酸度，用鹽酸或氫氧化鈉溶液調至相當於lmol/L的酸 度。
【文檔編號】G01N21/79GK104215604SQ201410473499
【公開日】2014年12月17日 申請日期:2014年9月16日 優先權日:2014年9月16日
【發明者】趙煒, 王捍東, 殷烈, 洪華, 王紅衛 申請人:中華人民共和國南通出入境檢驗檢疫局