幹擾Bx-cpl-1基因表達的dsRNA載體及其在松材線蟲防治和研究中的應用的製作方法

2023-05-31 16:26:21

專利名稱：幹擾Bx-cpl-1基因表達的dsRNA載體及其在松材線蟲防治和研究中的應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於植物病蟲防治技術領域，特別是涉及一種幹擾Βχ-cpl-l基因表達的 dsRNA載體及在松材線蟲防治和研究中的應用。
背景技術：
松材線蟲(Bursaphelenchus xylophilu)是一種對森林具有極大危害的寄生線蟲，它主要危害松屬樹種為代表的針葉樹木。二十世紀，日本的松樹感染上松材線蟲後，遭到了毀滅性的破壞。在我國，松材線蟲病於1982年在南京首次被發現。之後，疫情迅速蔓延，對我國的松林資源照成了極大的破壞，其經濟損失難以估量，松材線蟲病甚至已經直接對我國的張家界等世界自然文化遺產景觀造成了威脅。松材線蟲病素有「松樹的癌症」之稱，因為其蔓延異常迅速，一旦發病，樹木會很快死亡，因而防治難度非常之大。由於該病疫的傳播和人類的活動有密切的關係，因此不少國家將其列為A類植物檢疫對象。為了避免松材線蟲病對我國的森林資源照成危害，對於松材線蟲病的防治迫在眉睫。松材線蟲病的傳播異常迅速，一旦疫情發生就難以控制。該病到目前為止仍然沒有得到有效的控制。因此，要始終堅持以預防為主的政策，對於已經受災的地區要嚴格控制松材線蟲的蔓延。目前，主要可以通過兩種方法治療松材線蟲病。由於松材線蟲在樹幹內部，因此可以將殺蟲劑注射到樹幹或澆灌到根部，另一種是用飛機噴撒化學藥劑來防治天牛。這兩種方法有一定療效，但是其性價比較低。對於樹幹注射治療，其成本高，因此不適合大面積推廣；而用飛機噴撒化學藥劑來防治天牛，成本也比較昂貴，並且具有一定負面效應。由於化學防治具有較多缺陷，因此人們開始更多地關注松材線蟲的生物防治。研究顯示許多真菌對線蟲的生存有抑制作用，如總狀共頭黴和日本亮耳菌等，但是由於松材線蟲的繁殖速度驚人，生物防治的作用遠遠趕不上其擴散速度。因此，已有的防治措施都無法有效防治松材線蟲。我們只能寄希望於致病機理研究上的突破。目前，最經濟有效的途徑是利用分子生物學技術，對松樹的抗性基因進行篩選，然後再通過轉基因技術使松樹獲得對松材線蟲的抗性。半胱氨酸蛋白酶的活性位點含有半胱氨酸殘基。該酶廣泛存在於自然界的各種生物當中，例如細菌、真菌、植物、哺乳動物和人類等。因此，關於該酶的研究比較多。研究表明，半胱氨酸蛋白酶在線蟲入侵組織或細胞、提供胚胎發育所需的營養成分、蛻皮、消化宿主蛋白、調節免疫反應以及逃避宿主免疫反應的清除等過程中發揮著至關重要的作用。半胱氨酸蛋白酶屬於蛋白水解酶的一類。該酶在生物體內最開始合成時為一種前體物質，該物質包括兩個區前體區和催化區。半胱氨酸蛋白酶家族中有高度保守的典型的三聯體催化活性中心Cys-His-Asn。線蟲半胱氨酸蛋白酶為線蟲的主要「消化酶」，通常表達在線蟲的食道腺和腸細胞中，發揮著蛋白水解活性。線蟲攝取食物、入侵宿主細胞以及免疫等方面的功能均與半胱氨酸蛋白酶有密切關係，因此，近年來對該酶的研究愈加廣泛深入。研究發現，半胱氨酸蛋白酶存在於多種線蟲體內，不同的線蟲，分泌這種酶的部位不同，而且酶的分布部位也有所差異。有些線蟲的卵母細胞中包含L型半胱氨酸蛋白酶，如秀麗隱杆線蟲；在很多線蟲的不同發育期，蟲體腸腔內中都發現了 B型和L型半胱氨酸蛋白酶，如捻轉血矛線蟲(Haemonchus controtus)和南方根結線蟲(Meloidyne incognita)。呂春花(呂春花.相似穿孔線蟲S型半胱氨酸蛋白酶基因克隆與序列分析[J]. 植物保護，2008，34 (5) :17-22.)等從松材線蟲中分離到半胱氨酸蛋白酶家族的兩個基因 (Bx-cpl-U Bx-cpl-2)並在大腸桿菌中初步表達，但並未揭示並證明這兩個基因在線蟲生活史中的功能。RNA幹擾(RNAi)，是指由雙鏈RNA引發的轉錄後基因沉默的機制。隨著技術的發展，RNA幹擾技術越來越受研究人員的關注。目前，RNA幹擾技術已經廣泛應用於線蟲基因分析。R)rd等通過RNA幹擾分析組織蛋白類半胱氨酸蛋白酶基因在馬來絲蟲成蟲中的作用。用絲蟲CPL基因家族的Bm-cpl-1和Bm-cpl_5處理馬來絲蟲雌雄成蟲，或者用Bm-cpz-1 dsRNA處理，均導致了微絲蚴數量下降。通過Bm-cpl-5或Bm_cpl的dsRNA和siRNA處理雌蟲子宮，結果顯示胚胎發育受到明顯影響，導致晶胚畸形和不同的胚胎階段。通過對秀麗杆線蟲L型組織蛋白酶(Ce-cpl-Ι)和Z型組織蛋白酶(Ce-cpz-Ι)進行功能分析，確定了控制它們的兩種基因在早期的胚胎發育中都是必要的，Ce-cpl-Ι在卵黃蛋白分解期間起調控作用，Ce-cpz-Ι在蛻皮中起重要作用。對於RNA幹擾的介導，目前，細菌介導的RNAi技術在模式線蟲基因功能的研究中起到了重要的作用，成為模式線蟲基因功能研究的主要方法。目前RNAi的手段也成為松材線蟲基因功能的一種重要方法，但是目前所採用的都是浸泡法，體外轉錄合成dsRNA浸泡松材線蟲來分析基因的功能，該方法存在著極大地不足，主要表現在不能持續幹擾，而且極其不穩定，如何實現RNA的穩定幹擾也是本發明進一步需要實現的目的。

發明內容
本發明根據上述領域存在的空白和松材線蟲防治的需要，提供幹擾Βχ-cpl-l基因表達的dsRNA載體及在松材線蟲防治和研究中的應用。幹擾松材線蟲Βχ-cpl-l基因表達的dsRNA幹擾載體，其特徵在於，在骨架載體的多克隆位點上按順序正向插入有Βχ-cpl-l基因的完整或部分正義鏈和與所述正義鏈互補的反義鏈。所述骨架載體為農桿菌介導的表達載體。所述正義鏈的核苷酸序列如kq ID No. 2所示，所述正義鏈的核苷酸序列如所示 Seq IDNo. 3所示，所述農桿菌介導的載體為PHDT-RH，所述正義鏈插入在PHDT-RH的LB和 RB之間的5，端多克隆位點，所述反義鏈插入在PHDT-RH的LB和RB之間的3，端多克隆位點，得到的dsRNA幹擾載體為PHD-RH-CPL1。轉入有上述dsRNA幹擾載體的菌株。所說菌株指絲狀真菌。所述真菌指轉入有PHD-RH-CPL1的灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)。上述dsRNA幹擾載體在松材線蟲防治中的應用。
一種研究Βχ-cpl-l基因功能的新方法，其特徵在於，將上述dsRNA幹擾載體轉化到絲狀真菌中，然後通過絲狀真菌轉化子的菌絲體飼餵松材線蟲，觀察松材線蟲的表型。所述絲狀真菌指灰葡萄孢菌。本發明的發明人對前人獲得的半胱氨酸蛋白酶基因Βχ-cpl-l在線蟲生活史中的作用進行研究，採用該基因的部分片段構建成RNA幹擾載體，並通過農桿菌介導轉入灰葡萄孢菌中，該轉基因灰黴菌絲飼養松材線蟲對松材線蟲的CPL進行幹擾試驗，採用螢光定量PCR檢測被幹擾的松材線蟲的半胱氨酸蛋白酶基因Βχ-cpl-l的轉錄後表達量，結果顯示，隨著幹擾時間的增加，半胱氨酸蛋白酶基因的轉錄水平逐漸降低，與對照相比，感染效果具有顯著差異。半胱氨酸蛋白酶的活性測定顯示，Βχ-cpl-l基因的表達連續被幹擾10代的松材線蟲，其半胱氨酸蛋白酶的活性降低20.9%，其5天內的繁殖量降低40%，線蟲體長也有明顯縮短。這些實驗數據說明，Βχ-cpl-l基因的表達在松材線蟲的胚胎發育過程中起著關鍵作用，因而幹擾該基因的表達可以達到生物防治松材線蟲的目的。基於這些實驗結果，本發明提供一種幹擾松材線蟲Βχ-cpl-l基因表達的dsRNA幹擾載體，其特點就是在骨架載體中插入有Βχ-cpl-l基因的完整的或部分片段的正義鏈和與該正義鏈完全互補的反義鏈，關於骨架載體，本領域技術人員可能選出很多用於RNA幹擾載體構建的常規骨架載體，構建方法也是順序構建入目的幹擾基因片段的正義鏈和反義鏈。可以是完整的Βχ-cpl-l基因，也可以是其中的部分片段，選取Βχ-cpl-l基因的完整片段還是其中的哪一部分片段與所選用的骨架載體所具備的酶切位點有關，這種選取工作是本領域技術人員所具備的常規技能。本發明優選骨架載體為農桿菌介導的表達載體，農桿菌能夠攜帶目的基因轉移到多種生物體內，除了自然界的植物之外，還包括酵母、絲狀真菌以及人的細胞等。與傳統的轉化方法相比，AMT技術轉化效率高且遺傳穩定性好的優點，因此，構建成農桿菌介導的 RNA幹擾載體有利於使幹擾片段轉入到較多種類的宿主中使其表達dsRNA，用於幹擾松材線蟲。本發明的優選實施方式中，以PHDT-RH為骨架載體，以Βχ-cpl-l基因中的如Seq ID No. 2所示的片段及其反義鏈為dsRNA幹擾載體的核心片段構建了 dsRNA幹擾載體 PHD-RH-CPL1。將本發明要求保護的dsRNA幹擾載體轉入到真菌中，用這些轉化的真菌飼餵松材線蟲，其表達dsRNA與松材線蟲的Βχ-cpl-l相互作用使Βχ-cpl-l基因的表達受到幹擾從而影響松材線蟲的生長發育，達到防治的目的。本發明的實施例中，將構建的dsRNA幹擾載體PHD-RH-CPL1轉入到灰葡萄孢菌 (灰黴)中，獲得了可用於幹擾松材線蟲Βχ-cpl-l基因表達的灰黴轉化子。本發明的另一個貢獻還在於，提供了一種研究Βχ-cpl-l在松材線蟲生長發育過程中的功能的研究方法，即將上述dsRNA幹擾載體轉入到松材線蟲喜好的絲狀真菌中，然後用絲狀真菌轉化子的菌絲體飼餵各階段的松材線蟲，觀察松材線蟲的生長發育情況。


圖1.農桿菌介導絲狀真菌轉化載體PHDT結構示意圖；圖2.原生質體轉化絲狀真菌RNAi載體Psilent-I結構示意圖3.載體PHD-RH結構示意圖；圖4.松材線蟲CPL基因部分片段的克隆產物電泳圖，M =DNAMarker 2000 ；2 :Bx-cpl_l 基因正義鏈擴增結果；4 :Bx-cpl_l 基因反義鏈擴增結果；6 :Bx-cpl-2基因正義鏈擴增結果；8 :Bx-cpl-2基因反義鏈擴增結果；其餘為對照。圖5.菌液PCR電泳圖M :DNA Marker 2000 ；2-6，Βχ-cpl-l 基因正義鏈擴增結果；8-12 :Bx-cpl_l 基因反義鏈擴增結果；14-18 :Bx-cpl-2基因正義鏈擴增結果；其餘為對照。圖6. Hind III和Xba I雙酶切目的片段M =DNAMarker 2000 ； 1-6 含有插入片斷的載體pGM_T的酶切產物。圖7. HindIII和Bgl II雙酶切檢測正義鏈圖8. HindIII和Bgl II雙酶切檢測反義鏈圖9.潮黴素PCR電泳圖M =DNA Marker 2000 ； 1-3 潮黴素引物 PCR ；4 對照。圖10.目的片段PCR電泳圖M =DNAMarker 2000 ； 1-2 目的片段引物 PCR ；3 對照。圖11.幹擾2代後Βχ-cpl-l基因的轉錄水平(Bar值為標準誤)圖12.幹擾30代後Βχ-cpl-l基因的轉錄水平(Bar值為標準誤)圖13.幹擾2代後Bx-cpl-2基因的轉錄水平(Bar值為標準誤)圖14.幹擾30代後Bx-cpl-2基因的轉錄水平(Bar值為標準誤)圖15.幹擾10代後以GLUpNA為底物的酶活性測定 對照；·幹擾 CPLl ；Δ 幹擾 CPL2圖16.幹擾35代後以GLUpNA為底物的酶活性測定 對照；·幹擾 CPLl ；Δ 幹擾 CPL2圖17. RNA幹擾影響松材線蟲成蟲的繁殖能力(Bar值為標準誤)圖18.幹擾後的松材線蟲體長變化(Bar值為標準誤)。
具體實施例方式以下通過試驗及數據具體說明本發明的實施和其取得的有益效果。生物材料松材線蟲(Bursaphelenchus xylophilus) (USl)來自美國，本實驗室已進行多年的傳代培養。灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)，由中國科學院微生物研究所提供。根癌農桿菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株 EHA105，商購。農桿菌介導絲狀真菌轉化載體PHD-T(見圖1)，已知載體，由中國科學院微生物研究所劉杏忠研究員惠贈。I^silent-l，為現有已知載體，由中國科學院微生物研究所劉杏忠研究員惠贈。申請人:聲明，以上生物材料均在申請人實驗室有保存，可向公眾發放用於驗證試驗。
主要儀器和試劑儀器01ympus實體顯微鏡、美國Polyscience冷凍離心機(9500)、恆溫培養箱、冰箱、電子天平、高壓滅菌鍋、PCR儀、電泳儀、凝膠成像系統、水浴鍋、移液器、勻漿器、離心管、 槍頭、燒杯和PH計等。試劑提RNA用的Trizol Reagent, RT-PCR反轉錄試劑盒購自hvitrogen公司；SanPrep柱式DNA小量抽提試劑盒和Sarfrep柱式DNA膠回收試劑盒均購自生工生物工程有限公司；TA克隆試劑盒、Tag DNA聚合酶、DNA Marker 2000和克隆所用的大腸桿菌感受態細胞均購自天根生物公司；限制性內切酶HindIII、Bgl II、Xba I和Spe I等均購自Takara生物公司。TAE 緩衝液(50X) =Tris 鹼 242g，冰醋酸 57. Iml,0. 5mol/L EDTA(ρΗ8· 0) 100ml。土豆培養基(PDA)，用於培養灰葡萄孢菌稱取IOOg去皮馬鈴薯，切碎，加500ml 蒸餾水，煮沸30min。用紗布濾去馬鈴薯，補足500ml裝入三角瓶，調整pH值為6.0。再稱取IOg葡萄糖，7.5g瓊脂粉，加入三角瓶後搖勻。12rC，20min高壓蒸汽滅菌後倒入平板。LB培養基，用於大腸桿菌藍白斑篩選。酵母粉5g/L，蛋白腖10g/L，NaCl 10g/L。YEM培養基，分為固體和液體兩種，用於農桿菌菌體的活化酵母粉0. 2g，甘露醇 5g, MgS04 · 7H20 0. lg, K2HP040. 25g, NaCl 0. 05g,瓊脂 6g,溶於水，定容至 500ml (液體培養基不加瓊脂)。匪培養基，為擴大培養根癌農桿菌時所用的基本培養基，500ml的配方如 T :5mlK"buffer(pH 7.0) :KH2P04145g/L, K2HP04200g/L ； IOml M-N =NaCl 7. 5g/ L，MgS04. 7H2015g/L ； 5ml葡萄糖20g/L(過濾滅菌後置於4 °C冰箱儲存)；5ml FeS040. 01g/L(過濾滅菌後置於 4°C冰箱儲存)；0. 5ml CaC12. 2H20 lg/L ；2. 5ml Spore Elements(CuS04. 5H200. lg/L, ZnS04.7H20 0.lg/L, Na2Mo04. 2H200. lg/L, MnS04. H20 0. lg/L, H3B030. lg/L) ；1. 25ml, NH4N0320g/L ；470. 75ml 無菌水。IM培養基，用於誘導培養根癌農桿菌，IL的配方0. 8ml 1. 25M K-buffer, UfpH 調至4.9) ；20ml M-N =NaCl 15g/L，MgS04. 7H20 30g/L ；Iml CaCl2. 2H20 2g/L ； 10ml 50%甘油；2. 5ml NH4N0320g/L ；5ml Spore Elements ；40ml MES IM (將 pH 調至 5· 5)，用 NaOH 調節PH值(過濾滅菌，4°C儲藏)；10ml FeS04 0. 01g/L (過濾滅菌，4°C儲藏)；10ml葡萄糖 20g/L(過濾滅菌)；2ml AS IOOmM(用無水乙醇溶解，放置於_20°C ) ；898. 7ml水。共培養培養基(Co-IM)，用於灰葡萄孢菌和根癌農桿菌進行共培養。配製時將誘導培養基IM中的葡萄糖用量減半。卡那黴素溶於水中，配製濃度為10mg/ml，儲存於-20°C，使用時稀釋為IOyg/ ml ；利福平溶於甲醇中，配製濃度為10mg/ml，儲存於-20°C，使用時稀釋為34yg/ ml ；潮黴素50mg/ml，避光儲存於4°C，使用時稀釋為200 μ g/ml ；頭孢黴素溶於水中，200mg/ml，儲存於_20°C，使用時稀釋為400μ g/ml。MES 緩衝液(pH5. 5) :MES 0. 15M, DTT 4Mm, EDTA 4mM
底物GLUpNA (0. 5mg/mL) :1. 5mg 底物溶於 lmlDMSO，用 MES 緩衝液稀釋為 0. 5mg/ ml οSYBR Premix Ex Taq 購自 TaKaRa 公司。SYBRMix 與染料混勻Mix lml, DyeII 200 μ 1。實施例1 構建農桿菌介導絲狀真菌表達dsRNA的載體-PHD-RH農桿菌介導絲狀真菌轉化載體PHD-T，原生質體轉化絲狀真菌RNAi載體 I^ilent-I (圖2)為已知載體，由中國科學院微生物研究所劉杏忠研究員惠贈。載體PHD-RH的構建主要以農桿菌介導絲狀真菌轉化載體PHDT為骨架，對其T-DNA 區加以改造，由上海生物工程公司合成了一段DNA序列(Seq ID No. 1)，其結構為KpnI酶切位點、構巢麴黴色氨酸啟動子、5』多克隆位點、內含子、3』多克隆位點、構巢麴黴色氨酸終
止子、Bstx I酶切位點(5，------3，)。將該合成的序列插入載體PHDT的Kpn I和Bstx
I位點之間，經過陽性克隆鑑定後測序驗證，得到的載體命名為PHD-R。其5』多克隆位點依次含有》io I,Snab I, HindIII, Xba I酶切位點，3，多克隆位點含有Mu I，Spe LBglII, ApaI酶切位點。在載體PHD-R上添加潮黴素抗性基因作為選擇標記。設計引物HYG-F和 HYG-R (兩端添加KPN I酶切位點)以載體PHDT為模板擴增得到潮黴素抗性基因HPH。擴增產物連接於載體PHD-R，測序確認後插入到載體PHD-R的Kpn I酶切位點，即獲得載體 PHD-RH(圖3)，酶切鑑定陽性克隆後測序確認。HYG-F :5』 -TGGTA CCTA GA CGTTA A CTGATATTGA A-3』HYG-R :5』 -TGGTACCTAAACCCAGGGCTGGTGACGGA-3』實施例2松材線蟲的培養和分離1.松材線蟲的培養松材線蟲用生長在PDA培養基上的灰葡萄孢菌培養。將PDA培養基在121°C高壓蒸汽滅菌20min，60°C左右時倒入培養皿；培養基冷卻後，在超淨臺中接入灰葡萄孢菌，置於25°C恆溫培養箱中培養；3到4天後， 用雙氧水將松材線蟲消毒後接入培養皿，置於25°C恆溫培養箱中培養；6到7天後，從溫箱中取出培養皿置於4°C保存。2.松材線蟲的分離將養有松材線蟲的培養基用四層紗布包裹後，懸浮在盛有滅菌蒸餾水的燒杯中； 將燒杯置於25°C恆溫培養箱中靜置Mh ；移走紗布和培養基，倒去上清；將剩餘液體倒入滅菌的培養皿中，用移液器在顯微鏡下挑取松材線蟲，即可進行後續實驗。3.總RNA的提取採用Trizol Reagent (購自Invitrogen)提取，操作參照說明書。4. cDNA第一鏈的合成合成cDNA時使用RT-PCR試劑盒(購自hvitrogen)，操作參照說明書，合成的 cDNA保存備用。5.引物設計Βχ-cpl-l 的 cDNA 全長為 1220bp, GenBank ID 為 EU651860。Bx-cpl-2 的 cDNA 全長為 1161bp, GenBank ID 為 EU659123。這兩個基因均由2個內含子和3個外顯子組成。
利用DNAMAN軟體分析目的片段與載體PHDT-RH上的酶切位點，篩選出目的基因中沒有而載體上有的酶切位點。在481bp處設計Βχ-cpl-l正義鏈引物和Βχ-cpl-l反義鏈引物，正義鏈引物插入 HindIII和Xba I酶切位點，反義鏈引物插入Spe I和BglII酶切位點。在830bp處設計Bx-cpl-2正義鏈引物和Bx-cpl-2反義鏈引物，正義鏈引物插入 HindIII和Xba I酶切位點，反義鏈引物插入Spe I和BglII酶切位點。表1.為Βχ-cpl-l和Bx-cpl-2基因引入酶切位點的引物
權利要求
1.幹擾松材線蟲Βχ-cpl-l基因表達的dsRNA幹擾載體，其特徵在於，在骨架載體的多克隆位點上按順序正向插入有Βχ-cpl-l基因的完整或部分正義鏈和與所述正義鏈互補的反義鏈。
2.根據權利要求1所述的dsRNA幹擾載體，所述骨架載體為農桿菌介導的表達載體。
3.根據權利要求2所述的dsRNA幹擾載體，所述正義鏈的核苷酸序列如kqID No. 2所示，所述正義鏈的核苷酸序列如所示^^ ID似^所示，所述農桿菌介導的載體為？皿！「-冊， 所述正義鏈插入在PHDT-RH的LB和RB之間的5，端多克隆位點，所述反義鏈插入在PHDT-RH 的LB和RB之間的3』端多克隆位點，得到的dsRNA幹擾載體為PHD-RH-CPL1。
4.轉入有權利要求1 3任一所述dsRNA幹擾載體的菌株。
5.根據權利要求4所述的菌株，指轉入有PHD-RH-CPL1的灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)0
6.權利要求1 3任一所述dsRNA幹擾載體在松材線蟲防治中的應用。
7.一種研究Βχ-cpl-l基因功能的新方法，其特徵在於，將權利要求1 3任一所述 dsRNA幹擾載體轉化到絲狀真菌中，然後通過絲狀真菌轉化子的菌絲體飼餵松材線蟲，觀察松材線蟲的表型。
8.根據權利要求7所述的新方法，所述絲狀真菌指灰葡萄孢菌。
全文摘要
本發明「幹擾Bx-cpl-1基因表達的dsRNA載體及其在松材線蟲防治和研究中的應用」，屬於植物病蟲防治技術。所述dsRNA幹擾載體，其特徵在於，在骨架載體的多克隆位點上按順序正向插入有Bx-cpl-1基因的完整或部分正義鏈和與所述正義鏈互補的反義鏈。可用於松材線蟲的防治和研究。
文檔編號A01K67/033GK102286509SQ20111017491
公開日2011年12月21日 申請日期2011年6月27日 優先權日2011年6月27日
發明者成新躍, 王殿東, 白婷, 許鷗, 謝丙炎, 陳國華 申請人:中國農業科學院蔬菜花卉研究所