人腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體突變蛋白、其製法及其藥物組合物的製作方法
2023-05-31 12:49:51
專利名稱：人腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體突變蛋白、其製法及其藥物組合物的製作方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域。具體地說，本發明涉及一種親和力和表達量有所提高的人腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體突變蛋白。另外，本發明還涉及該突變蛋白的製備方法以及含有該突變蛋白的藥物組合物。
背景技術：
目前臨床上對腫瘤患者的治療仍大多採用手術切除聯合化學療法和放射療法，這一傳統療法雖然能去除瘤體並殺死部分癌細胞，但由於其非特異性殺傷作用，使得患者的大量正常組織細胞被殺死，導致患者的機體健康受到重大損傷，同時也無法防治腫瘤的復發和轉移。
當前興起的生物治療和基因治療為徹底根治腫瘤帶來了曙光，近期研究發現了一種能特異性殺傷腫瘤細胞的蛋白-TRAIL(TNF related apoptosis inducing ligand，腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體)，由於其獨特的抗癌作用而為世人矚目。
人TRAIL基因位於染色體3q26，由美國科學家Wiley等人首先發現並於1995年克隆、命名。TRAIL屬於腫瘤壞死因子家族成員，為典型的II型跨膜蛋白，整個分子由281個胺基酸組成，C端細胞外區域形成同源三聚體的亞結構，而N端胺基酸為疏水區並形成跨膜結構，其受體分為五種，其中R1、R2為壞死受體(necrosisreceptor)，R3、R4為誘騙受體(seduction receptor)，R5為一種分泌性受體。TRAIL與死亡受體R1、R2結合將導致細胞凋亡，而與誘騙受體R3、R4結合，則可使細胞逃脫TRAIL誘導的細胞凋亡。
現在實驗表明正常細胞可同時表達死亡受體與誘騙受體，而腫瘤及轉化細胞僅能表達死亡受體或約高於正常細胞100倍的死亡受體和低於正常細胞10倍的誘騙受體。因此TRAIL能特異性地誘導多種腫瘤細胞死亡，而對正常組織細胞無影響。許多實驗已證實純化的人TRAIL能引起白血病9D細胞和EB病毒轉化的人B細胞數量明顯減少；在2小時內可誘導人急性白血病Jurkat細胞、9D細胞的DNA片段化而導致細胞死亡。同樣TRAIL對Burkitt’s淋巴瘤B細胞系、急性人白血病T細胞系有相同的殺傷作用。同時TRAIL對人腫瘤細胞如Hela、U937、A549和ME180人宮頸癌細胞的殺傷作用比對照顯著增強。在體內，TRAIL能誘導突變的T淋巴細胞凋亡，如惡變的T細胞、HIV(愛滋病毒)感染的T細胞等。綜上所述，由於TRAIL具有顯著地特異性殺傷腫瘤細胞的功能，許多科學家預計，其社會效益及經濟效益不可估量。
然而，目前的TRAIL仍然存在著親和力不夠高的問題。在生產過程中，其表達量也很低，只有5％(參見Wiley SR，等人，1995，「誘導凋亡的TNF家族新成員的鑑定和特性分析」，Immunity，3(6)673-682)。
因此，本領域中仍迫切需要提供一種親和力以及表達量有所改善的TRAIL。
發明內容
為了滿足上述發明目的，本發明的一個方面提供了一種分離的人腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體突變蛋白，該突變蛋白具有Ser52Asn和Trp82Gln突變。
在一個較佳的實例中，該突變蛋白具有如SEQ ID NO1所示的胺基酸序列。
本發明另一方面提供了一種編碼本發明上述突變蛋白的DNA序列。在一個較佳的實例中，該DNA序列具有如SEQ ID NO2所示的核苷酸序列。
本發明第三方面提供了含有本發明DNA序列的表達載體。
本發明第四方面提供了經上述表達載體轉化的宿主細胞。在一個較佳的實例中，所述宿主細胞是大腸桿菌、枯草桿菌或酵母細胞。
本發明第五方面提供了一種藥物組合物，該藥物組合物含有藥學上有效量的上述人腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體突變蛋白以及藥學上可接受的載體。
本發明第六方面提供了本發明的人腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體突變蛋白的製備方法，該方法包括a)提供一表達載體，該表達載體含有編碼上述突變蛋白的DNA序列以及與該DNA序列操作性相連的表達調控序列；b)用步驟a)中的表達載體轉化宿主細胞；c)在適合表達上述突變蛋白的條件下培養步驟b)所得的宿主細胞；和d)分離純化所表達出的突變蛋白。
本發明的優點在於上述人TRAIL突變蛋白的親和力比天然的TRAIL蛋白更高，而且其在宿主細胞中的表達量也有所提高。本發明的其它目的和優點可通過下面的詳細描述得知。
發明詳述本發明提供了一種具有Ser52Asn和Trp82Gln突變的分離的人腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體突變蛋白。本文所用的術語「人腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體蛋白(TRAIL)」可以是具有天然野生型序列的人TRAIL蛋白，也可以是具有突變序列的衍生型或重組人TRAIL蛋白，只要該突變序列中不包括Ser52Asn和Trp82Gln突變即可。天然的人腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體蛋白的胺基酸序列及其編碼序列如SEQ ID NO3和SEQ ID NO4所示。
本發明者通過研究發現，通過將該蛋白質胺基酸序列的52位絲氨酸(Ser)和82位色氨酸(Trp)分別突變成天冬醯胺(Asp)和谷醯胺(Gln)，可使突變後的蛋白的親和力及其在宿主中的表達量均大大提高。本文中所用的術語「Ser52Asn」和「Trp82Gln」即表示52位胺基酸由Ser變為Asn，82位胺基酸由Trp變為Gln。不希望受理論的束縛，認為上述兩處胺基酸很可能構成了該蛋白質的活性中心，因此，將這兩處胺基酸突變成疏水性強的胺基酸導致了該蛋白的親和力提高。另外，還發現上述突變蛋白在宿主細胞中的表達量也得到大大提高。在本發明的一個較佳實例中，本發明的突變蛋白具有SEQ ID NO1所示的胺基酸序列。
本文所用的術語「分離的」在用於核酸或蛋白質時，表示核酸或蛋白質基本上不含其它在天然狀態下相關的細胞成分，其最好呈均質狀態，但也可以是幹的或水溶液。純度和均一性通常可用分析化學方法如聚丙烯醯胺凝膠電泳或高效液相色譜法來測定。
本發明還提供了一種編碼本發明上述腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體突變蛋白的DNA序列。在一個較佳的實例中，所述DNA序列具有SEQ ID NO2所示的核苷酸序列，其中核苷酸序列中第154-156位鹼基TCT和第244-246位鹼基TGG分別替代了編碼天然TRAIL蛋白的DNA序列中的鹼基AAT和GAT。當然，本領域技術人員也可利用本領域中熟知的遺傳密碼的簡併性獲得編碼上述胺基酸序列的所有其它核酸序列。
本發明的突變蛋白可通過以下方法來進行製備。首先，提供含有編碼本發明突變蛋白的核苷酸序列以及與該序列操作性相連的表達調控序列的表達載體。
本文所用的術語「表達調控序列」通常指參與控制核苷酸序列表達的序列。表達調控序列包括與目標核苷酸序列操作性相連的啟動子和終止信號。它們通常還包括核苷酸序列適當翻譯所需的序列。「操作性相連」是指線性DNA序列的某些部分能夠影響同一線性DNA序列其他部分的活性。例如，如果啟動子或增強子增加了編碼序列的轉錄，則它與編碼序列是操作性相連的。
上述編碼突變型TRAIL蛋白的DNA序列可用本領域技術人員熟知的常規手段來獲得，例如，根據已經公開的人TRAIL蛋白的DNA序列來合成引物進行PCR法擴增，或用諸如定點誘變、盒式誘變和聚合酶鏈反應(PCR)誘變等方法進行誘變。
在獲得了具有定點突變後的DNA序列後，就可通過本領域熟知的各種方法將其連入合適的表達載體中。本發明中所用的表達載體是本領域技術人員已知的各種市售的表達載體，例如購自Qiagen和Promega公司的表達載體。
然後，用上述獲得的表達載體轉化合適的宿主細胞。在本發明中，術語「宿主細胞」包括原核細胞和真核細胞。常用的原核宿主細胞的例子包括大腸桿菌、枯草桿菌等。常用的真核宿主細胞包括酵母細胞，昆蟲細胞、和哺乳動物細胞。較佳地，該宿主細胞是大腸桿菌、枯草桿菌或酵母細胞。
最後，在適合本發明突變蛋白表達的條件下，培養轉化所得的宿主細胞，然後用離子交換層析、疏水層析和分子篩層析等本領域技術人員熟知的常規分離純化手段純化得到本發明的新的突變蛋白。
本發明還提供了一種藥物組合物，該組合物含有藥學上有效量的本發明突變蛋白以及藥學上可接受的載體。本文所用的術語「藥學上可接受的」是指當分子本體和組合物適當地給予動物或人時，它們不會產生不利的、過敏的或其它不良反應。本文所用的「藥學上可接受的載體」應當與本發明的突變蛋白相容，即能與其共混而不會在通常情況下大幅度降低藥物組合物的效果。可作為藥學上可接受的載體或其組分的一些物質的具體例子是糖類，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；澱粉，如玉米澱粉和土豆澱粉；纖維素及其衍生物，如羧甲基纖維素鈉、乙基纖維素和甲基纖維素；西黃蓍膠粉末；麥芽；明膠；滑石；固體潤滑劑，如硬脂酸和硬脂酸鎂；硫酸鈣；植物油，如花生油、棉籽油、芝麻油、橄欖油、玉米油和可可油；多元醇，如丙二醇、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；海藻酸；乳化劑，如Tween；潤溼劑，如月桂基硫酸鈉；著色劑；調味劑；壓片劑、穩定劑；抗氧化劑；防腐劑；無熱原水；等滲鹽溶液；和磷酸鹽緩衝液等。
本發明的藥物組合物可根據需要製成各種劑型，並可由醫師根據患者種類、年齡、體重和大致疾病狀況、給藥方式等因素確定對病人有益的劑量進行施用。
下面將結合實施例進一步詳細地描述本發明。然而應當理解，列舉這些實施例只是為了起說明作用，而並不是用來限制本發明。
實施例1可溶性片段編碼基因的人工合成將如SEQ ID NO2所示的序列及其互補鏈拆分成26個長度約為83～88鹼基長度的寡核苷酸片段，然後人工合成。然後，利用PCR方法獲得TRAIL可溶性基因片段，具體操作如下(1)反應體系在0.2毫升PCR管中加入以下各物質。
10×PCR緩衝液5微升寡核苷酸片段(100毫微克/微升) (每種)各1微升50×dNTP混合物 1微升50×TaqDNA聚合物 1微升PCP-級水 至40微升反應體積為 50微升(2)反應條件預變性94℃2分鐘；主循環95℃ 1分鐘，60℃ 40秒，72℃ 1分鐘，循環35次；後延伸72℃ 10分鐘。
觀察電泳結果，並凝膠回收TRAIL全長基因片段。將回收得到的基因片段克隆於質粒pGEM-T Easy(Promega公司，Madison，WI)上並用美國ABI自動測序儀測定進行基因測序。根據測序結果鑑定出一個序列完全正確的克隆，記作TRAIL/N。
另外設計合成下列突變引物5』-TGCAGGACAAATACTCTAAAAACGGTATCGCTTGCTTCCTGAAAGAAGACGACTCTTACTGGGACCCGAACGACGAAGAATCTATGAACTCTCCGTGCTGGCAGGTTAAACAGCAGCTGCGTCAGCTGGTTCG-3』(SEQ ID NO5)突變方法採用常規T7 DNA聚合膜/Dpn I突變方案，詳細操作方法見《分子克隆實驗室手冊》或Promega公司的使用說明。突變過程採用Promega公司的基因定點突變試劑盒進行。經測序鑑定，獲得正確的突變克隆，記作TRAIL/M。
實施例2 表達載體的構建將上述TRAIL/N和TRAIL/M的DNA序列經BamHI及HindIII酶切後分別連接於原核表達載體pET32a(Qiagen公司)上。
首先，用BamHI及HindIII酶切表達質粒pET32a。在微量離心管中加入以下各物質pET32a質粒(3微克)、10×限制性酶緩衝液(3微升)、BamHI和HindIII各15單位、1毫克/毫升乙醯化BSA(3微升)，然後加入無核酸酶的水至40微升。37℃孵育4小時，以DNA標記物作為對照進行電泳，凝膠回收酶切的質粒pET32a，置於-20℃保存待用。
然後，用BamHI及HindIII酶切攜帶目的基因的質粒pGEM-TEasy，切下目的基因並用凝膠回收，方法同上。
隨後，連接酶切表達質粒pET32a及目的基因片段。在0.2毫升PCR管中加入以下各物10×連接酶緩衝液(2微升)、100mM DTT(2微升)、10mM ATP(1微升)、50毫微克/微升上述製得的pET32a載體(2微升)、T4連接酶(0.2-0.4 Weise單位/微升，1微升)、上述製得的目的基因(0.2pmol)和無核酸酶的水，反應總體積為20微升。4℃下連接過夜。
隨後，將連接構建好的質粒pET32a分別轉化入大腸桿菌BL21(DE3)和AD494(DE3)(Promega公司)中。
如下方式酶切鑑定轉化質粒。挑取氨苄青黴素培養皿上單個表達工程菌菌落進行擴增培養。抽提質粒，用BamHI及HindIII酶切鑑定，方法同上。酶切產物在1％瓊脂糖電泳上進行鑑定，初步確定TRAIL/N有11個克隆、TRAIL/M有8個克隆帶有目的插入序列。每種基因選取其中2個正確克隆進行測序，根據測序結果確認兩種基因各有1個克隆的插入序列是完全正確的，分別記作pTRAIL/N和pTRAIL/M。
實施例3誘導目的基因表達及其生物活性檢測a)目的基因的表達取正確克隆pTrail/N和pTRAIL/M的菌液100微升分別接種到5毫升含氨苄青黴素(100微克/毫升)的LB液體培養基中，37℃、300rpm振蕩培養至OD值達0.4-1.0。加入異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)至終濃度1毫摩爾/升。37℃培養3小時，從每種培養物中取出1毫升轉移到離心管中，離心去上清；裂解菌體，進行SDS蛋白電泳，用考馬斯亮藍對SDS聚丙烯醯胺進行染色，檢測目的蛋白的表達。
b)目的蛋白純化按照上述方法在LB培養基中誘導該基因表達並經過離子交換層析、疏水層析和分子篩層析純化，經過常規方法復性，獲得純度在92％以上的重組人腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體突變蛋白。
c)表達量的鑑定如下所示，利用ELISA法鑑定表達量。在96孔板上每孔中加入50微克純化的TRAIL蛋白按照常規方法包被，然後加入0.1毫升鼠抗TRAIL單克隆抗體(購自晶美公司)(預先稀釋至1∶100)，室溫下處理30分鐘後，用PBS洗滌5次，然後加入1微升辣根過氧化物酶標記的兔抗鼠抗體(1∶5000稀釋)，37℃溫育30分鐘。加入DAB顯色液200微升，室溫下處理45分鐘後在酶標儀上讀取495nm處的光吸收，據此計算表達量。
結果發現其表達量高達菌體可溶性蛋白的30％以上，比Wiley SR，等人，1995，「誘導凋亡的TNF家族新成員的鑑定和特性分析」，Immunity，3(6)673-682中報導的表達量(5％)高出至少6倍。
d)活性檢測在本實施例中，所用的TRAIL測活細胞株為具有自我增殖能力的對TRAIL敏感的Jarket細胞。在96孔板上每孔加入1×106細胞，培養基為FCS RPMI-1640。每孔中加入上述重組人TRAIL蛋白至200毫微克/毫升，然後在第2、4、6、8、10和12小時取樣進行如下檢測1)細胞計數。從上述樣品中取出0.2毫升進行細胞計數，結果以存活細胞百分數表示，結果列在下表1中。
表1
從表1結果可以看出，TRAIL具有明顯的殺傷Jarket細胞的作用，而突變的TRAIL比天然產物具有更強的殺傷力。這說明突變明顯導致了產物親和力的提高。
2)DNA片段檢測。取出0.5毫升樣品抽提DNA，並加入10％(體積)濃度為5毫克/毫升的MTT，在2％的瓊脂糖凝膠電泳上進行檢測。結果發現其DNA發生明顯片段化，經天然型TRAIL處理的樣品中大部分DNA分子集中在3～5kb大小範圍，而經突變型處理的樣品中大部分DNA分子集中在2～4.5kb的範圍內。與未經TRAIL處理的對照(DNA分子主要集中在20～22kb)相比，兩種處理均導致了DNA分子量的明顯降低。上述結果說明，經過TRAIL處理後，Jarket細胞可以發生明顯的DNA片段化。突變型TRAIL處理所得的DNA分子量範圍比天然型處理所得的DNA分子量範圍更低，說明突變型的作用更為強烈。
3)MTT檢測。取經過天然型TRAIL和突變型TRAIL處理的細胞0.2毫升，加入1/10體積的濃度為5毫克/毫升的MTT溶液，37℃培養30分鐘後在酶標儀上讀取570nm處的光吸收。結果發現，經過TRAIL處理的細胞的光吸收明顯低於未經處理的對照的光吸收。8小時後，經天然型TRAIL處理過的讀數只有對照的30.6％；而經突變型TRAIL處理的比經天然型TRAIL處理的更低，8小時後的讀數只有對照的11.1％。這說明本發明的TRAIL突變蛋白的親和力有大大提高，從而使光學上讀數更低。
儘管本發明描述了具體的例子，但是有一點對於本領域技術人員來說是明顯的，即在不脫離本發明的精神和範圍的前提下可對本發明作各種變化和改動。因此，所附權利要求覆蓋了所有這些在本發明範圍內的變動。
序列表110上海蘭生國健藥業有限公司120人腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體突變蛋白、其製法及其藥物組合物1300160161605170PatentIn version 3.02101211281212PRT213智人(Homo sapiens)4001Met Ala Met Met Glu Val Gln Gly Gly Pro Ser Leu Gly Gln Thr Cys1 5 10 15Val Leu Ile Val Ile Phe Thr Val Leu Leu Gln Ser Leu Cys Val Ala20 25 30Val Thr Tyr Val Tyr Phe Thr Asn Glu Leu Lys Gln Met Gln Asp Lys35 40 45Tyr Ser Lys Asn Gly Ile Ala Cys Phe Leu Lys Glu Asp Asp Ser Tyr50 55 60Trp Asp Pro Asn Asp Glu Glu Ser Met Asn Ser Pro Cys Trp Gln Val65 70 75 80Lys Gln Gln Leu Arg Gln Leu Val Arg Lys Met Ile Leu Arg Thr Ser85 90 95Glu Glu Thr Ile Ser Thr Val Gln Glu Lys Gln Gln Asn Ile Ser Pro100 105 110Leu Val Arg Glu Arg Gly Pro Gln Arg Val Ala Ala His Ile Thr Gly115 120 125Thr Arg Gly Arg Ser Asn Thr Leu Ser Ser Pro Asn Ser Lys Asn Glu130 135 140Lys Ala Leu Gly Arg Lys Ile Asn Ser Trp Glu Ser Ser Arg Ser Gly145 150 155 160His Ser Phe Leu Ser Asn Leu His Leu Arg Asn Gly Glu Leu Val Ile165 170 175His Glu Lys Gly Phe Tyr Tyr Ile Tyr Ser Gln Thr Tyr Phe Arg Phe180 185 190Gln Glu Glu Ile Lys Glu Asn Thr Lys Asn Asp Lys Gln Met Val Gln195 200 205Tyr Ile Tyr Lys Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Pro Ile Leu Leu Met Lys210 215 220Ser Ala Arg Asn Ser Cys Trp Ser Lys Asp Ala Glu Tyr Gly Leu Tyr225 230 235 240Ser Ile Tyr Gln Gly Gly Ile Phe Glu Leu Lys Glu Asn Asp Arg Ile245 250 255Phe Val Ser Val Thr Asn Glu His Leu Ile Asp Met Asp His Glu Ala260 265 270Ser Phe Phe Gly Ala Phe Leu Val Gly275 2802102211846212DNA213智人(Homo sapiens)4002atggctatga tggaagttca gggtggtccg tctctgggtc agacctgcgt tctgatcgtt 60atcttcaccg ttctgctgca gtctctgtgc gttgctgtta cctacgttta cttcaccaac120gaactgaaac agatgcagga caaatactct aaatctggta tcgcttgctt cctgaaagaa180gacgactctt actgggaccc gaacgacgaa gaatctatga actctccgtg ctggcaggtt240aaatggcagc tgcgtcagct ggttcgtaaa atgatcctgc gtacctctga agaaaccatc300tctaccgttc aggaaaaaca gcagaacatc tctccgctgg ttcgtgaacg tggtccgcag360cgtgttgctg ctcacatcac cggtacccgt ggtcgttcta acaccctgtc ttctccgaac420tctaaaaacg aaaaagctct gggtcgtaaa atcaactctt gggaatcttc tcgttctggt480cactctttcc tgtctaacct gcacctgcgt aacggtgaac tggttatcca cgaaaaaggt540ttctactaca tctactctca gacctacttc cgtttccagg aagaaatcaa agaaaacacc600aaaaacgaca aacagatggt tcagtacatc tacaaataca cctcttaccc ggacccgatc660ctgctgatga aatctgctcg taactcttgc tggtctaaag acgctgaata cggtctgtac720tctatctacc agggtggtat cttcgaactg aaagaaaacg accgtatctt cgtttctgtt780accaacgaac acctgatcga catggaccac gaagcttctt tcttcggtgc tttcctggtt840ggttag 8462103211281212PRT213智人(Homo sapiens)4003Met Ala Met Met Glu Val Gln Gly Gly Pro Ser Leu Gly Gln Thr Cys1 5 10 15Val Leu Ile Val Ile Phe Thr Val Leu Leu Gln Ser Leu Cys Val Ala20 25 30Val Thr Tyr Val Tyr Phe Thr Asn Glu Leu Lys Gln Met Gln Asp Lys35 40 45Tyr Ser Lys Ser Gly Ile Ala Cys Phe Leu Lys Glu Asp Asp Ser Tyr50 55 60Trp Asp Pro Asn Asp Glu Glu Ser Met Asn Ser Pro Cys Trp Gln Val65 70 75 80Lys Trp Gln Leu Arg Gln Leu Val Arg Lys Met Ile Leu Arg Thr Ser85 90 95Glu Glu Thr Ile Ser Thr Val Gln Glu Lys Gln Gln Asn Ile Ser Pro100 105 110Leu Val Arg Glu Arg Gly Pro Gln Arg Val Ala Ala His Ile Thr Gly115 120 125Thr Arg Gly Arg Ser Asn Thr Leu Ser Ser Pro Asn Ser Lys Asn Glu130 135 140Lys Ala Leu Gly Arg Lys Ile Asn Ser Trp Glu Ser Ser Arg Ser Gly145 150 155 160His Ser Phe Leu Ser Asn Leu His Leu Arg Asn Gly Glu Leu Val Ile165 170 175His Glu Lys Gly Phe Tyr Tyr Ile Tyr Ser Gln Thr Tyr Phe Arg Phe180 185 190Gln Glu Glu Ile Lys Glu Asn Thr Lys Asn Asp Lys Gln Met Val Gln195 200 205Tyr IIe Tyr Lys Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Pro Ile Leu Leu Met Lys210 215 220Ser Ala Arg Asn Ser Cys Trp Ser Lys Asp Ala Glu Tyr Gly Leu Tyr225 230 235 240Ser Ile Tyr Gln Gly Gly Ile Phe Glu Leu Lys Glu Asn Asp Arg Ile245 250 255Phe Val Ser Val Thr Asn Glu His Leu Ile Asp Met Asp His Glu Ala260 265 270Ser Phe Phe Gly Ala Phe Leu Val Gly275 2802104211846212DNA213智人(Homo sapiens)4004atggctatga tggaagttca gggtggtccg tctctgggtc agacctgcgt tctgatcgtt 60atcttcaccg ttctgctgca gtctctgtgc gttgctgtta cctacgttta cttcaccaac 120gaactgaaac agatgcagga caaatactct aaaaatggta tcgcttgctt cctgaaagaa 180gacgactctt actgggaccc gaacgacgaa gaatctatga actctccgtg ctggcaggtt 240aaagatcagc tgcgtcagct ggttcgtaaa atgatcctgc gtacctctga agaaaccatc 300tctaccgttc aggaaaaaca gcagaacatc tctccgctgg ttcgtgaacg tggtccgcag 360cgtgttgctg ctcacatcac cggtacccgt ggtcgttcta acaccctgtc ttctccgaac 420tctaaaaacg aaaaagctct gggtcgtaaa atcaactctt gggaatcttc tcgttctggt 480cactctttcc tgtctaacct gcacctgcgt aacggtgaac tggttatcca cgaaaaaggt 540ttctactaca tctactctca gacctacttc cgtttccagg aagaaatcaa agaaaacacc 600aaaaacgaca aacagatggt tcagtacatc tacaaataca cctcttaccc ggacccgatc 660ctgctgatga aatctgctcg taactcttgc tggtctaaag acgctgaata cggtctgtac 720tctatctacc agggtggtat cttcgaactg aaagaaaacg accgtatctt cgtttctgtt 780accaacgaac acctgatcga catggaccac gaagcttctt tcttcggtgc tttcctggtt 840ggttag 8462105211133212DNA213引物4005tgcaggacaa atactctaaa aacggtatcg cttgcttcct gaaagaagac gactcttact 60gggacccgaa cgacgaagaa tctatgaact ctccgtgctg gcaggttaaa cagcagctgc 120gtcagctggt tcg 13權利要求
1.一種分離的人腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體突變蛋白，其特徵在於，它含有Ser52Asn和Trp82Gln突變。
2.根據權利要求1所述的突變蛋白，其特徵在於，所述突變蛋白具有SEQ IDNO1所示的胺基酸序列。
3.一種分離的DNA序列，其特徵在於，它編碼權利要求1所述的人腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體突變蛋白。
4.根據權利要求3所述的分離的DNA序列，其特徵在於，它具有SEQ ID NO2所示的核苷酸序列。
5.一種表達載體，其特徵在於，它含有權利要求3所述的DNA序列。
6.一種宿主細胞，其特徵在於，它被權利要求5所述的表達載體轉化。
7.根據權利要求6所述的宿主細胞，其特徵在於，所述宿主細胞是大腸桿菌、枯草桿菌或酵母細胞。
8.一種藥物組合物，其特徵在於，它含有藥學上有效量的權利要求1所述的人腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體突變蛋白以及藥學上可接受的載體。
9.一種製備權利要求1所述的人腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體突變蛋白的方法，其特徵在於，該方法包括a)提供一表達載體，該表達載體含有編碼權利要求1所述的人腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體突變蛋白的DNA序列以及與該DNA序列操作性相連的表達調控序列；b)用步驟a)中的表達載體轉化宿主細胞；c)在適合表達所述突變蛋白的條件下培養步驟b)所得的宿主細胞；和d)分離純化獲得所表達出的突變蛋白。
10.根據權利要求9所述的方法，其特徵在於，所述DNA序列具有SEQ ID NO2所示的核苷酸序列。
全文摘要
本發明公開了一種新的具有Ser52Asn和Trp82Gln突變的人腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體突變蛋白，編碼該突變蛋白的DNA序列，含有該DNA序列的表達載體，用該表達載體轉化的宿主細胞，含有該突變蛋白的藥物組合物，以及該突變蛋白的製備方法。該突變蛋白的親和力大大高於天然蛋白，而且其在宿主細胞中的表達量也有所提高。
文檔編號C12N15/63GK1417229SQ01132158
公開日2003年5月14日 申請日期2001年11月9日 優先權日2001年11月9日
發明者胡輝, 劉慶法 申請人:上海中信國健藥業有限公司