一種生產人源膠原蛋白Ⅱ型的方法

2023-06-01 00:34:46 1

一種生產人源膠原蛋白Ⅱ型的方法
【專利摘要】本文發明公開了一種生產重組人源膠原蛋白Ⅱ型的方法，屬於基因工程的【技術領域】。其特徵在於：利用杆狀病毒多基因表達系統，用轉化了該杆狀病毒多基因表達系統的細菌感染昆蟲細胞，產生一種表達多基因的杆狀病毒，將病毒液侵染昆蟲細胞或注射入家蠶幼蟲體內，由此生產重組人源膠原蛋白Ⅱ型全長蛋白，其蛋白結構為3條具有(G-X-Y)n重複序列的肽鏈形成三股螺旋結構，保持天然膠原蛋白Ⅱ型的構象，具有天然膠原蛋白Ⅱ型的活性。採用本發明的方法，能表達多個基因，利於生產膠原蛋白Ⅱ型全長蛋白；本發明工藝方法簡單，操作簡便，工藝路線短。
【專利說明】一種生產人源膠原蛋白N型的方法

【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種生產重組人源膠原蛋白II型的方法，屬於基因工程的【技術領域】。

【背景技術】
[0002] 膠原蛋白又稱膠原，是哺乳動物體內含量最豐富的蛋白質，約佔體內蛋白質總量 的25%-30%。其廣泛存在於動物的皮、骨、軟骨、牙齒、肌腱、韌帶和血管中，是結締組織的 重要結構蛋白，具有支撐器官和保護機體的功能。
[0003] 目前研究報導顯示，自Miller和Matukas於1969年發現II型膠原蛋白以來，在 脊椎動物中已發現超過28種不同類型的膠原蛋白，它們由至少46種截然不同的多肽鏈組 成。這些不同類型的膠原蛋白都至少包含一個三重螺旋的結構域，有的多達96% (I型）， 少則10% (XII型）。膠原蛋白的基本組成大同小異，在胺基酸序列上都含有（Gly-X-Y) η重複序列，這些重複序列是構成三聚體結構基礎，其中X通常為Pro, Y通常為Hy-Pro或 Hy-Lys。在膠原蛋白中，脯氨酸（Pro)與賴氨酸（Lys)含量尤為豐富，而這正是α肽鏈能 形成三螺旋的關鍵組分。羥基脯氨酸（Hyp)是在膠原蛋白一級結構形成後由特定的酶-脯 氨酸-4-羥化酶（Ρ4Η)作用於序列中的脯氨酸（Pro)形成的，Hyp羥基通過通過分子間氫 鍵對穩定膠原蛋白的三重螺旋結構起著重要的作用。
[0004] 人源II型膠原蛋白是人體透明軟骨、玻璃體、胚胎角膜和神經視網膜的主要成 分，此外，II型膠原對於軟骨的修復是很有用的，而且有望用於人造軟骨及人造角膜等生物 醫學材料中。但目前這些材料都來自於動物，而動物源的膠原會產生免疫反應而且有病毒 隱患，此外，缺乏大量的組織及大規模純化膠原蛋白所面臨的挑戰使利用這些材料很難，重 組表達技術可解決上述問題。目前雖已在哺乳細胞、昆蟲、酵母、大腸桿菌、菸草、老鼠和蠶 中成功表達了重組膠原，但只有在哺乳細胞中在不表達脯氨醯4-羥化酶基因時，膠原蛋白 基因可表達出羥基化的膠原蛋白，但由於其表達水平太低，無法進行大規模的生產。


【發明內容】

[0005] 為克服現有技術中的上述缺點，本發明通過對載體基因上遊改造，構建能同時表 達膠原蛋白II型、紅色螢光蛋白、脯氨酸羥化酶的病毒，並且提供了一種表達效率高、工藝 簡單的膠原蛋白II型的表達方法。
[0006] 本發明主要目的在於：利用多基因杆狀病毒表達系統表達人源II型膠原蛋白。
[0007] 具體地，本發明提供一種生產重組人源膠原蛋白II型的方法，所述方法包括下述 步驟：
[0008] (1)人工合成SEQ ID No. 1所示的人源膠原蛋白II型a 1鏈全長基因，並連接至 轉移載體PFBDM(圖7)中構建重組質粒pFBDM-col II，具體地，可以插入載體pFBDM的MCSl 中的位點中；
[0009] (2)向步驟（1)構建的重組質粒pFBDM-col II中插入IRES序列和螢光蛋白編碼 序列，具體地，可以插入載體PFBDM的MCS2中的位點中；應該理解，IRES序列和螢光蛋白編 碼序列與人源膠原蛋白II型α 1鏈全長基因是符合閱讀框地插入到載體PFBDM中；
[0010] (3)人工合成SEQ ID No. 2所示的人源脯氨酸羥化酶α亞基和SEQ ID No. 3所 示的人源脯氨酸羥化酶β亞基序列，共同符合閱讀框地連接至轉移載體PUCDM(圖8)，獲 得重組質粒PUCDM-P4H α -P4H β，具體地，P4H α可以插入載體pUCDM的MCSl中的位點中， Ρ4Ηβ可以插入載體pUCDM的MCS2中的位點中；
[0011] (4)將步驟（2)構建的重組質粒和步驟（3)構建的重組質粒pUCDM-P4Ha -Ρ4Ηβ 通過轉座的方式導入asd營養缺陷型宿主大腸桿菌SW106感受態細胞，構建生產人源膠原 蛋白的重組基因病毒DNA的重組大腸桿菌SW106細胞；
[0012] (5)將步驟（4)製備的重組大腸桿菌SW106細胞感染昆蟲細胞（例如，家蠶細胞 BmN，SF9細胞）產生杆狀病毒，再利用所述杆狀病毒上清液感染昆蟲細胞，進行重組蛋白的 表達；並且
[0013] (6)收集感染的昆蟲細胞的培養液上清，親和純化得到所述重組人源膠原蛋白II 型，並進行測活。
[0014] 其中，當使用家蠶進行重組蛋白表達時，上述步驟（5)和（6)可以相應地修改為下 述步驟（5'）和出'）：
[0015] (5'）將步驟（4)製備的重組大腸桿菌SW106細胞感染家蠶細胞BmN細胞產生杆 狀病毒，並利用所述杆狀病毒上清液注射感染家蠶5齡期幼蟲，感染4天後收穫顯現所述熒 光蛋白顏色（可通過體視螢光顯微鏡觀察）的蠶體的表皮；並且
[0016] (6'）將步驟（5'）的表皮破碎離心收集上清，將表達的重組人源膠原蛋白II型通 過親和純化，得到所述重組人源膠原蛋白II型，並進行測活。
[0017] 其中，SEQ ID No. 1所示的人源膠原蛋白II型a 1鏈全長基因可以通過人工合成 獲得，或者可以通過以ΕΧ-5512-Β31為模板PCR擴增得到。
[0018] 所用的螢光蛋白編碼序列可以選自編碼紅色或綠色螢光蛋白的基因序列，例如， 但不限於，編碼GFP、YFP、mCh erry的基因序列。其中，在螢光蛋白基因開放閱讀框前端加入 IRES序列（內部核糖體進入位點），這樣改造的目的是通過IRES的特性提高所述螢光蛋白 的表達量。IRES序列如SEQ ID No. 5所示。
[0019] 人源脯氨酸羥化酶P4Hci和Ρ4Ηβ亞基基因的序列可以通過人工合成獲得，或者 通過選用帶有該基因的序列作為模板通過PCR擴增得到。
[0020] 在本發明的技術方案中，實現了重組人源膠原蛋白II型和人源脯氨酸羥化酶以 及螢光蛋白的共表達，其中共表達人源脯氨酸羥化酶的目的是將表達的人源膠原蛋白II 型中的脯氨酸羥基化，從而獲得高質量的膠原蛋白II型（膠原蛋白脯氨酸被羥基化的程度 是決定膠原蛋白質量高低的標準，脯氨酸羥化酶與膠原蛋白共表達，能夠最大化地使膠原 蛋白的脯氨酸被羥基化成羥脯氨酸），共表達螢光蛋白的目的是在家蠶中表達時便於篩選 帶有表達的人源膠原蛋白II形的家蠶（會顯現螢光蛋白的顏色，可通過體視螢光顯微鏡觀 察）。
[0021] 在一個優選的實施方案中，所述生產重組人源膠原蛋白II型的方法包括下述步 驟：
[0022] (1)合成人源膠原蛋白II型α 1鏈全長基因（序列如SEQ ID No. 1所示）；
[0023] (2)合成基因 IRES (序列如 SEQ ID No. 5 所示）與 mCherry (序列如 SEQ ID No. 6 所不）；
[0024] (3)將步驟（1)所合成的人源膠原II型α 1鏈全長基因 （SEQ ID No. 1)連接到轉 移載體pFBDM (購至深圳市寶珠生物科技有限公司，貨號zt323)，構建pFBDM-col II，將步 驟（2)所合成的IRES以及mCherry共同連接入pFBDM-col II，構建重組質粒pFBDM-M-col II，構建載體時需轉化大腸桿菌感受態細胞（例如Top 10);
[0025] (4)合成人源脯氨酸羥化酶Ρ4Ηα和Ρ4Ηβ亞基基因（序列分別為SEQ ID No. 2 和 SEQ ID No. 3);
[0026] (5)將步驟（4)所合成的人源脯氨酸羥化酶P4HCI與β亞基基因共同（此處的 "共同"應該理解不論同時還是先後，只要將α與β亞基基因都連接到同一個pUCDM載 體中並且二者的連接符合閱讀框就行）連接至轉移載體pUCDM(Sun, Jingchen，et al，A High Efficient Method of Constructing Recombinant Bombyx mori(Silkworm)Multiple Nucleopolyhedrovirus Based on Zero-Background Tn7_Mediated Transposition in Escherichia coli，Biotechnol. Prog. ,2009，Vol. 25，No. 2，pp524_529)，獲得重組質粒 PUCDM-P4Hα -P4Hβ ；
[0027] (6)將重組質粒pFBDM-M-col II和pUCDM-P4Ha-P4H3分別通過轉座的方式導 入asd營養缺陷型宿主大腸桿菌SW106感受態細胞（本實驗室按照常規方法改造，改造方 法參見 Sun，Jingchen et al,Biotechnol. Appl. Biochem. (2010), 57,117-125 (Printed in Great Britain)doi :10. 1042/BA20100148)，構建生產人源膠原蛋白的重組基因病毒DNA : BmMNPV-pFBDM-IM-col II-pUCDM-P4Hα -P4Hβ ；
[0028] (7)對步驟（5)構建的重組大腸桿菌在Grace培養基（購自Gibco)中直接感染家 蠶細胞BmN(ATCC CRL-8910)產生杆狀病毒BmMNPV-hcol II。利用杆狀病毒注射感染5齡 期家蠶幼蟲，飼養環境為28°C，溼度60%至70%之間，每天給予足夠的桑葉以及每天及時 清除蠶糞，4天後，蠶出現螢光後收穫，確立了一種利用家蠶蠶體能有效生產人源膠原蛋白 的培養方式。
[0029] (8)將蠶體處死，去掉絲腺、中腸以及頭前部口器，加入胰蛋白酶抑制劑（購自 Biosharp,濃度100ug/ml)，研磨破碎，15000rpm離心10分鐘，取上清，通過鎳親和層析柱、 分子篩純化出膠原蛋白II型。
[0030] (9)純化後的蛋白樣品凍幹濃縮，在96孔板裡加入40ul經過0· 22nm的微孔濾膜 過濾的膠原蛋白樣品，在超淨臺內吹乾過夜。陰性組為生理鹽水以及超純水。利用balb/ c3T3(ATCC CCL-163)細胞懸液接種到底層鋪有類人膠原蛋白膜的培養皿中，培養4h。用 MTT法比較各組細胞數，測定膠原蛋白活性。
[0031] 換言之，本發明提供一種生產重組人源膠原蛋白II型的方法，其特徵在於：利用 杆狀病毒載體表達系統，構建出載體pFBDM-M-col II和pUCDM-P4Ha -Ρ4Ηβ，通過轉座的 手段，將帶有目的基因的片段整合入BmMultiBacNPV基因組中；將攜帶有外源基因的重組 杆狀病毒DAP營養缺陷型大腸桿菌SW106菌液直接添加到BmN細胞培養基裡，細菌入侵細 胞後，因為缺乏必需營養不能自身繁殖而死亡，裂解後病毒基因組被動進入細胞，從而構建 出重組病毒BmMNPV-hcol II;利用構建出的重組病毒BmMNPV-hcol II注射感染家蠶幼蟲， 通過體視螢光顯微鏡觀察紅色螢光（即由mCherry表達的螢光蛋白）來判斷人源膠原蛋白 是否表達。
[0032] 其中asd營養缺陷型宿主大腸桿菌SW106通過在大腸桿菌基因組上引入嗜血桿菌 入侵inv基因，缺失asd基因改造獲得，其特徵在於具有入侵細胞昆蟲細胞的功能（即，inv 基因的功能），並在缺失DAP情況下死亡（S卩，缺失asd基因引起）。關於asd營養缺陷型 宿主大腸桿菌 SW106 的改造方法參見 Sun，Jingchen et al，Biotechnol. Appl. Biochem. (2010)，57，117-125(Printed in Great Britain)doi :10.1042/BA20100148。
[0033] 本發明的生產重組人源膠原蛋白II型的方法特徵在於利用杆狀病毒表達系統表 達全長的人源II型膠原蛋白。杆狀病毒是有囊膜的dsDNA大形病毒，宿主僅限於無脊椎動 物。杆狀病毒基因組是大小為80到160kb的單一閉合環狀雙鏈DNA分子，其基因組能在 昆蟲細胞核複製和轉錄。DNA複製後會組裝在杆狀病毒殼衣內，殼衣具有較大的柔韌性，可 容納大片段外源DNA的插入，是理想的表達大片段DNA的載體。現階段多用核型多角體病 毒（nuclear polyhedrosis virus, NPV)作為外源基因表達載體的杆狀病毒。杆狀病毒表 達系統相對於其它表達系統具有下述特點：①杆狀病毒所表達的重組蛋白具有完整的生物 學功能，杆狀病毒表達系統可為表達的外源蛋白在細胞內進行二硫鍵的搭配、正確摺疊及 寡聚物的形成提供良好的環境，可使表達產物在功能與結構上更加接近天然蛋白。②能進 打翻譯後的加工修飾。杆狀病毒表達系統具有對蛋白質完整的翻譯後加工能力，包括憐Ife 化、糖基化、磷酸化、信號肽切除、切割和分解等，所修飾的位點與天然蛋白在細胞內的修飾 位點完全一樣。③能容納大分子的插入片段。杆狀病毒自身毒粒可以擴大，能包裝較大的 基因片段。④具有同時表達多個基因的能力。杆狀病毒表達系統具有在同一細胞內表達多 個基因的能力，YAO等所建立的杆狀病毒表達系統具有能同時表達10個基因的能力。⑤表 達水平高。與其它真核表達系統比較，杆狀病毒表達系統能獲得高量表達的重組蛋白，最高 可使目的蛋白的表達量達到細胞總蛋白的50 %。
[0034] 在本發明的生產人源膠原蛋白II型全長的方法中，其利用家蠶幼蟲表達全長的 人源Π 型膠原蛋白。家香核型多角體病毒（Bombyx mori multicapsid Polyhedrosis Virus，BmMNPV)是一種帶外殼的雙鏈DNA病毒，可以感染多種鱗翅目昆蟲，被用作基因表達 系統的載體。利用帶有外源目的基因的BmMNPV(BmMNPV-hc 〇l II)感染家蠶蠶體表達目的 蛋白。
[0035] 在本發明的生產人源膠原蛋白II型全長的方法中，大腸桿菌宿主菌SW106具有入 侵細胞昆蟲細胞BmN的功能，並在缺失DAP情況下死亡。目前本實驗室在杆狀病毒載體表 達系統的發展中也取得了一些成果，例如：利用零背景Tn7轉座菌株構建重組Bacmid ;利 用侵染蛋白介導的營養缺陷型的大腸桿菌進行無脂質體轉染系統等。（龍虎等，南方醫科 大學學報，1673-4254 (2010) 07-1491-05 ;Sun，Jingchen，et al，，Biotechnol. Prog.，2009， Vol.25, No. 2, pp524-529 ；Sun, Jingchen et al, Biotechnol. Appl. Biochem. (2010),57, 117-125(Printed in Great fcitain)doi:10.1042/BA20100148)。其中，利用侵染蛋白介 導的營養缺陷型的大腸桿菌asd缺失型rSW106-inv，直接將細菌加入細胞中感染，細菌中 所表達的侵染蛋白會入侵到細胞內，又因為其自身不能合成其細胞壁的主要成分DAP(二 氨基庚二酸），不能繼續繁殖而死亡，細菌內的bacmid釋放出來，在昆蟲細胞內進行轉錄進 而表達組裝出杆狀病毒。
[0036] 在本發明的生產人源膠原蛋白II型全長的方法中，構建出的病毒感染細胞後，通 過構建入載體的螢光蛋白標籤（例如，紅色或者綠色的螢光蛋白標籤等）作為判定細胞是 否感染成功與人源膠原蛋白II型是否表達。其中上述所用的螢光蛋白標籤可以選自gfp、 yfp、mCherry等。在本發明中，在mCherry突光蛋白基因開放閱讀框前端加入IRES序列 (內部核糖體講入位點），這樣改造的目的是通過IRES的特性提高mCherry的表達量。
[0037] 利用本發明的方法生產的重組人源膠原蛋白II型具有由3條⑴^^重複序列 的肽鏈形成三股螺旋結構，其中X表示Pro, Y表示Hy-Pro或Hy-Lys，η表示多段重複。換 言之，利用本發明的方法生產的重組人源膠原蛋白II型保持天然膠原蛋白II型的構象，具 有天然膠原蛋白II型的活性。
[0038] 本研究基於杆狀病毒表達系統能夠多基因表達，承載大基因片段及高水平表達的 優點，通過基因改造實現了重組人源膠原蛋白II型和人源脯氨酸羥化酶的共表達，其中膠 原蛋白脯氨酸被羥基化的程度是決定膠原蛋白質量高低的標準，脯氨酸羥化酶與膠原蛋白 共表達，能夠最大化地使膠原蛋白的脯氨酸被羥基化成羥脯氨酸。而這種技術，只需要一種 病毒，即可表達多個基因。基於這種思路，本發明人建立了一種簡便、快速和高效的膠原蛋 白生產工藝，為其實際應用提供理論基礎，因此本發明的工作具有一定的理論和實際意義。
[0039] 本發明具有以下優點：
[0040] (1)本發明採用膠原蛋白II型，表達其全長序列，表達產物具有膠原蛋白特徵的 三股螺旋結構。
[0041] (2)生產的人源膠原蛋白II型全長具有非常好的穩定性與親水性，其胺基酸序列 與天然人源膠原蛋白II型完全相同。應用人體不產生排斥反應與過敏反應，可用於醫療美 容領域。
[0042] (3)方法簡單、操作容易、成本低廉、容易實現規模產業化的優點。
[0043] 綜上所述，本發明提供下述技術方案：
[0044] 1. 一種生產重組人源膠原蛋白II型的方法，所述方法包括下述步驟：
[0045] (1)獲得SEQ ID No. 1所示的人源膠原蛋白II型α 1鏈全長基因，並連接至轉移 載體pFBDM中構建重組質粒pFBDM-col II ;
[0046] (2)向步驟（1)構建的重組質粒pFBDM-col II中插入IRES序列和螢光蛋白編碼 序列；
[0047] (3)獲得SEQ ID No. 2所示的人源脯氨酸羥化酶α亞基和SEQ ID No. 3所示的 人源脯氨酸羥化酶β亞基序列，共同符合閱讀框地連接至轉移載體PUCDM，獲得重組質粒 PUCDM-P4Hα -P4Hβ ；
[0048] (4)將步驟（2)構建的重組質粒和步驟（3)構建的重組質粒pUCDM_P4Ha -Ρ4Ηβ 通過轉座的方式導入asd營養缺陷型宿主大腸桿菌SW106感受態細胞，構建生產人源膠原 蛋白的重組基因病毒DNA的重組大腸桿菌SW106細胞；
[0049] (5)將步驟（4)製備的重組大腸桿菌SW106細胞感染昆蟲細胞產生杆狀病毒，再利 用所述杆狀病毒上清液感染昆蟲細胞，進行重組蛋白的表達；並且
[0050] (6)收集感染的昆蟲細胞的培養液上清，親和純化得到所述重組人源膠原蛋白II 型，並進行測活；
[0051] 其中步驟（5)的昆蟲細胞為家蠶細胞BmN或SF9細胞。
[0052] 2. -種生產重組人源膠原蛋白II型的方法，所述方法包括下述步驟：
[0053] (1)獲得SEQ ID No. 1所示的人源膠原蛋白II型a 1鏈全長基因，並連接至轉移 載體pFBDM-IM中構建重組質粒pFBDM-col II ;
[0054] (2)向步驟（1)構建的重組質粒pFBDM-col II中插入IRES序列和螢光蛋白編碼 序列；
[0055] (3)獲得SEQ ID No. 2所示的人源脯氨酸羥化酶α亞基和SEQ ID No. 3 所示的人源脯氨酸羥化酶β亞基序列，共同連接至轉移載體PUCDM，獲得重組質粒 PUCDM-P4Hα -P4Hβ ；
[0056] (4)將步驟（2)構建的重組質粒和步驟（3)構建的重組質粒pUCDM_P4Ha -Ρ4Ηβ 通過轉座的方式導入asd營養缺陷型宿主大腸桿菌SW106感受態細胞，構建生產人源膠原 蛋白的重組基因病毒DNA的重組大腸桿菌SW106細胞；
[0057] (5)將步驟（4)製備的重組大腸桿菌SW106細胞感染家蠶細胞BmN，產生杆狀病 毒，並利用所述杆狀病毒上清液注射感染家蠶5齡期幼蟲，感染4天後收穫在體視螢光顯微 鏡下顯現所述螢光蛋白顏色的蠶體的表皮；並且
[0058] (6)將步驟（5)的表皮破碎離心收集上清，將表達的重組人源膠原蛋白II型通過 親和純化，得到所述重組人源膠原蛋白II型，並進行測活。
[0059] 3.根據第1或2項所述的方法，其中所述人源膠原蛋白II型α?鏈全長基因插入 載體pFBDM的MCSl中的位點中，並且所述IRES序列和螢光蛋白編碼序列插入載體pFBDM 的MCS2中的位點中，並且所述IRES序列和螢光蛋白編碼序列與人源膠原蛋白II型a 1鏈 全長基因是符合閱讀框地插入到載體pFBDM中。
[0060] 4.根據第1或2項所述的方法，其中在步驟（3)中，所述人源脯氨酸羥化酶α亞 基序列插入載體PUCDM的MCSl中的位點中，並且所述人源脯氨酸羥化酶β亞基序列可以 插入載體PUCDM的MCS2中的位點中。
[0061] 5.根據第1或2項所述的方法，其中步驟（2)所用的螢光蛋白編碼序列編碼選自 GFP、YFP或mCherry的突光蛋白。
[0062] 6.根據第5項所述的方法，其中步驟（2)所用的螢光蛋白編碼序列編碼mCherry 螢光蛋白。
[0063] 7.根據第1或2項所述的方法，其中asd營養缺陷型宿主大腸桿菌SW106通過在 大腸桿菌基因組上引入嗜血桿菌入侵inv基因，缺失asd基因改造獲得。
[0064] 8.根據第1項所述的方法，其中步驟（5)中得到的感染成功的家蠶細胞BmN或SF9 細胞的培養條件為：商業化Grace培養基成分，PH 6. 4,添加濃度為80ug/ml的抗壞血酸鹽， 溫度28°C，靜止培養3天。
[0065] 9.根據第1或2項所述的方法，其中步驟￠)的親和純化利用鎳柱進行。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0066] 從下面結合附圖的詳細描述中，本發明的上述特徵和優點將更明顯，其中：
[0067] 圖1 :載體EX-5512-B21雙酶切圖（Xba I和Avr II)。泳道I :lkb分子量標記， 從下至上依次為 lkb、2kb、3kb、4kb、5kb、6kb、7kb、8kb、9kb、10kb ;泳道 2 :載體 EX-5512-B21 雙酶切，箭頭所示的目標條帶為膠原蛋白II型，大小為4635bp。
[0068] 圖2 :重組質粒pFBDM-col II雙酶切鑑定圖。泳道I :lkb分子量標記（同圖1); 泳道2 :pFBDM-c〇l II雙酶切，箭頭所示的目標條帶為膠原蛋白II型，大小為4635bp。
[0069] 圖3 :用本發明的方法製備的膠原II型表達產物PAGE圖以及Western Blot檢測 圖。泳道1 :蛋白分子量標記，從上往下分別為97. 2、66. 4、44. 3KD ;泳道2 :空白對照；泳道 3-4 :膠原II型BmN細胞蛋白表達，目的蛋白條帶如箭頭所示；泳道5-6 :Western Blot檢 測條帶，目的蛋白條帶如箭頭所示。
[0070] 圖4 :攜帶紅色螢光標籤的BmMNPV-hcol II病毒感染細胞的紅色螢光圖。
[0071] 圖5 :膠原蛋白活性測定，分別為0· 2mg/ml、0. lmg/ml、0. 05mg/ml用本發明的方法 製備的膠原蛋白II型、牛纖連蛋白陽性對照（〇.〇〇4mg/ml)以及空白陰性對照（生理鹽水） 處理的細胞的粘連情況。
[0072] 圖6 :用本發明的方法製備的膠原蛋白II型的掃描電鏡（SEM)觀察。
[0073] 圖 7 :pFBDM 質粒圖譜（MultiBac Expression System User Manual，2004)。
[0074] 圖 8 :pUCDM 質粒圖譜（MultiBac Expression System User Manual，2004)。
[0075] 序列表說明

【權利要求】
1. 一種生產重組人源膠原蛋白II型的方法，所述方法包括下述步驟： (1) 獲得SEQ ID No. 1所示的人源膠原蛋白II型a 1鏈全長基因，並連接至轉移載體 pFBDM中構建重組質粒pFBDM-col II ; (2) 向步驟（1)構建的重組質粒pFBDM-col II中插入IRES序列和螢光蛋白編碼序列； (3) 獲得SEQ ID No. 2所示的人源脯氨酸羥化酶a亞基和SEQ ID No. 3所示的人 源脯氨酸羥化酶P亞基序列，共同符合閱讀框地連接至轉移載體PUCDM，獲得重組質粒 PUCDM-P4Ha -P4H^ ； (4) 將步驟（2)構建的重組質粒和步驟（3)構建的重組質粒pUCDM-P4Ha-P4H0通過 轉座的方式導入asd營養缺陷型宿主大腸桿菌SW106感受態細胞，構建生產人源膠原蛋白 的重組基因病毒DNA的重組大腸桿菌SW106細胞； (5) 將步驟（4)製備的重組大腸桿菌SW106細胞感染昆蟲細胞產生杆狀病毒，再利用所 述杆狀病毒上清液感染昆蟲細胞，進行重組蛋白的表達；並且 (6) 收集感染的昆蟲細胞的培養液上清，親和純化得到所述重組人源膠原蛋白II型， 並進行測活； 其中步驟（5)的昆蟲細胞為家蠶細胞BmN或SF9細胞。
2. -種生產重組人源膠原蛋白II型的方法，所述方法包括下述步驟： (1) 獲得SEQ ID No. 1所示的人源膠原蛋白II型a 1鏈全長基因，並連接至轉移載體 pFBDM-IM中構建重組質粒pFBDM-col II; (2) 向步驟（1)構建的重組質粒pFBDM-col II中插入IRES序列和螢光蛋白編碼序列； (3) 獲得SEQ ID No. 2所示的人源脯氨酸羥化酶a亞基和SEQ ID No. 3所示的人源脯 氨酸羥化酶P亞基序列，共同連接至轉移載體PUCDM，獲得重組質粒pUCDM-P4Ha-P4H3 ; (4) 將步驟（2)構建的重組質粒和步驟（3)構建的重組質粒pUCDM-P4Ha-P4H0通過 轉座的方式導入asd營養缺陷型宿主大腸桿菌SW106感受態細胞，構建生產人源膠原蛋白 的重組基因病毒DNA的重組大腸桿菌SW106細胞； (5) 將步驟（4)製備的重組大腸桿菌SW106細胞感染家蠶細胞BmN，產生杆狀病毒，並 利用所述杆狀病毒上清液注射感染家蠶5齡期幼蟲，感染4天後收穫在體視螢光顯微鏡下 顯現所述螢光蛋白顏色的蠶體的表皮；並且 (6) 將步驟（5)的表皮破碎離心收集上清，將表達的重組人源膠原蛋白II型通過親和 純化，得到所述重組人源膠原蛋白II型，並進行測活。
3. 根據權利要求1或2所述的方法，其中所述人源膠原蛋白II型a 1鏈全長基因插 入載體pFBDM的MCSl中的位點中，並且所述IRES序列和螢光蛋白編碼序列插入載體pFBDM 的MCS2中的位點中，並且所述IRES序列和螢光蛋白編碼序列與人源膠原蛋白II型a 1鏈 全長基因是符合閱讀框地插入到載體pFBDM中。
4. 根據權利要求1或2所述的方法，其中在步驟（3)中，所述人源脯氨酸羥化酶a亞 基序列插入載體PUCDM的MCSl中的位點中，並且所述人源脯氨酸羥化酶P亞基序列插入 載體pUCDM的MCS2中的位點中。
5. 根據權利要求1或2所述的方法，其中步驟（2)所用的螢光蛋白編碼序列編碼選自 GFP、YFP或mCherry的突光蛋白。
6. 根據權利要求5所述的方法，其中步驟（2)所用的螢光蛋白編碼序列編碼mCherry 螢光蛋白。
7. 根據權利要求1或2所述的方法，其中asd營養缺陷型宿主大腸桿菌SW106通過在 大腸桿菌基因組上引入嗜血桿菌入侵inv基因，缺失asd基因改造獲得。
8. 根據權利要求1所述的方法，其中步驟（5)中得到的感染成功的家蠶細胞BmN或SF9 細胞的培養條件為：商業化Grace培養基成分，PH6. 4,添加濃度為80ug/ml的抗壞血酸鹽， 溫度28°C，靜止培養3天。
9. 根據權利要求1或2所述的方法，其中步驟（6)的親和純化利用鎳柱進行。
【文檔編號】C12N15/866GK104313053SQ201410579575
【公開日】2015年1月28日 申請日期:2014年10月24日 優先權日:2014年10月24日
【發明者】孫京臣, 黃亞東, 梁智升, 齊琦, 黃秋生, 項琪, 貝煜 申請人:華南農業大學, 廣州暨南大學醫藥生物技術研究開發中心, 廣東凱利生物科技有限公司