不使用動物來源成分的蛋白a的製備和純化的製作方法

2023-06-01 00:20:41

專利名稱：：不使用動物來源成分的蛋白a的製備和純化的製作方法不使用動物來源成分的蛋白A的製備和純化
背景技術：
：蛋白A是金黃色葡萄球菌產生的細胞壁蛋白。蛋白A的用途源自其與大多數哺乳動物免疫球蛋白G(IgG)的Fc區和較小程度與具有VH3區的免疫球蛋白M(IgM)結合的能力，而不影響免疫球蛋白對抗原的親和力。商業上使用蛋白A純化單克隆抗體，所述抗體通常反過來用於治療人類疾病，如炎性疾病和癌症。而且，蛋白A自身可以用於治療。可將蛋白A給藥患者以結合如類風溼性關節炎的自身免疫疾病中的循環免疫複合物，或刺激感染患者中的特異性細胞因子產生。而且，當與色譜樹脂偶聯時，蛋白A可以作為治療吸收劑起作用以通過移除病症中的IgG複合物治療血漿或全血，所述病症如自身免疫疾病和移植器官排斥反應。最初，蛋白A源自金黃色葡萄球菌細胞壁，但是已經分離了分泌該蛋白的菌抹，且這些菌抹也用於得到蛋白A。然而，通過常規方法製備蛋白A在用於人類治療中存在問題。金黃色葡萄球菌在含有動物產品的培養基中生長，所述動物產品作為細菌的胺基酸源。尤其是，通常使用牛水解產物和提取物作為細菌生長培養基中的補充劑。因此，從含有動物源產物的生長培養基中得到的蛋白A導致動物產品如蛋白酶侵染子，狂牛症、綿羊瘋癢病和消耗性疾病中的病原體，可能在培養基中出現並傳遞到人類患者的可能性。在下遊純化過程中，蛋白A製劑也可能暴露於動物產品和被動物產品汙染。例如，在現已使用的方法中，使用IgG瓊脂糖色譜柱純化蛋白A，且偶聯到瓊脂糖色譜柱的IgG—般為動物源的。然而，在分離和純化過程中伴隨蛋白A製備出現的動物產品不容易通過當前已知的方法從製劑中純化。發明簡述本發明涉及製備沒有動物源產物汙染的蛋白A的方法，其包括通過在含有植物胺基酸或肽代替動物肽的培養基中發酵金黃色葡萄球菌分泌菌抹(secretorstain),收集含有蛋白A的培養基和純化蛋白A,並且將其施加到沒有動物肽的合成樹脂上和過濾來自樹脂的洗脫液。在本方法的一個實施方案中，所述金黃色葡萄球菌分泌菌抹為Staphaureus,varImre(S.Imre)。在本發明的另一個實施方案中，使用陰離子交換色語樹脂從培養基中純化蛋白A。在本發明另一個實施方案中，通過羥基磷灰石或陽離子交換色譜進一步純化從色譜樹脂中洗脫的蛋白A以除去非蛋白汙染。純化後，可以濃縮蛋白A並使其達到生理pH。本發明也涉及用於金黃色葡萄球菌發酵的植物培養基，其由酵母提取物、植物胺基酸和肽、葡萄糖和必需的鹽組成。在一個實施方案中，植物胺基酸或肽為大豆肽。而且本發明涉及通過在植物培養基中生長細菌而製備植物蛋白A的方法，所述才直物蛋白A(vegetarianproteinA)即為沒有動物產品汙染的蛋白A製劑。本發明還涉及通過本發明方法製備的植物蛋白A製劑。本發明還涉及含有植物蛋白A和適當載體的藥物組合物。在一個實施方案中，在治療所需患者的治療方法中使用所述藥物組合物。尤其是，在治療需要通過給予患者植物蛋白A藥物組合物刺激細胞因子或冷球蛋白產生的患者的方法中使用所述藥物組合物。本發明也涉及固定在色譜樹脂以生成植物蛋白A-色譜樹脂的植物蛋白A。在一個實施方案中，在結合抗體或抗體片段的方法中使用所述植物蛋白A-色譜樹脂。在尤其優選的實施方案中，所述植物蛋白A-色譜樹脂用於純化抗體。本發明也涉及包含純化的抗體和適合載體的藥物組合物。在一個實施方案中，使用純化的抗體的藥物組合物以治療所需患者，且在優選實施方案中抗體用於治療患有癌症的患者。本發明還涉及包含植物蛋白A-色譜樹脂和適合載體的藥物組合物和其中使用所述藥物組合物治療所需患者的方法。在本方法的一個實施方案中，所述藥物組合物用於治療獲得性血友病。在另一個實施方案中，在治療自身免疫疾病或免疫相關問題的方法中使用所述藥物組合物。在本方法的另一個實施方案中，所述藥物組合物用於治療自身免疫疾病類風溼性關節炎或擴張型心肌病。在本方法的一個實施方案中，所述藥物組合物用於治療移植物抗宿主疾病(graft-versus-hostdisease)的免疫相關問題。此，本發明以防止動物蛋白汙染的方式提供了用於製備蛋白A的方法。而且，本發明有利地提供了植物蛋白A製劑和蛋白A藥物組合物，其不與動物產品接觸，確保蛋白A不被它們汙染。對於在使用蛋白A對人類的治療中這點尤其重要。圖1為表示從植物蛋白A得到的級分的SDS-PAGE凝膠圖，所述植物蛋白A是從MacroPrepHighQ陰離子交換柱中洗脫出來的。圖2為表示植物蛋白A中級分6的線性色鐠圖，所述植物蛋白A是從MacroPrepHighQ陰離子交換柱中洗脫出來的。圖3為表示與標準蛋白A製劑相比的植物蛋白A活性的蛋白印跡圖，所述植物蛋白A是通過MacroPrepHighQ陰離子交換色譜中純化的。圖4為表示植物蛋白A的級分的SDS-PAGE凝膠圖，所述植物蛋白A是從陶瓷羥基磷灰石柱中洗脫出來的。圖5為表示植物蛋白A中級分3的每條帶成分的線性色譜圖，所述植物蛋白A是從陶瓷羥基磷灰石柱中洗脫出來的。發明詳述本發明的優選實施方案的描述如下。蛋白A可以從任何產生蛋白A的金黃色葡萄球菌菌抹中獲得，所述菌林包括那些天然存在的、分離的(isolated)或遺傳工程的菌抹。產生蛋白A的金黃色葡萄球菌菌抹也可以包括那些其中蛋白A包含在細胞壁中的菌林和那些分泌蛋白A到生長培養基中的菌抹，優選例如S.aureus,varImre。從金黃色葡萄球菌細胞壁中回收蛋白A的方法(例如酶消化)是本領域技術人員公知的。可以純化以這種方式回收的蛋白A以除去消化的細胞成分。然而優選從葡萄球菌抹得到蛋白A，所述葡萄球菌抹分泌蛋白A到培養基中使得僅需要從培養基中收集蛋白A。發酵和收集在沒有動物源肽條件的培養基中發酵金黃色葡萄球菌菌林以防止蛋白A被動物產品汙染。本文所用的"動物產品，，是指從非人動物傳播或產生的任何物質，所述物質包括肽、蛋白、胺基酸、類蛋白物質、核酸、病毒等。本文所用的"植物蛋白A"是指沒有被動物產品或任何動物源肽汙染的蛋白A組合物，其是從發酵培養基或純化培養基中產生的。相似地，術語"植物培養基"是指沒有被動物產品或任何動物源肽汙染的發酵培養基。本文中所用的術語"植物胺基酸或肽"是指不是來自非人動物的任何肽、蛋白、胺基酸或類蛋白物質。分泌細菌可以在任何足以使細菌生長和產生所需量蛋白A的量的植物培養基中發酵。最優選的是，在發酵罐中大批量生長金黃色葡萄球菌。發酵條件(即氣流、溫度、攪動、pH和壓力)可以用如微機或通過任何其它電子工具控制的和/或電子監測。一些尤其優選的條件包括在約37'C和每升培養基約1升/分鐘無菌空氣的氣流下發酵金黃色葡萄球菌。培養基可以由本領域中已知的用於以金黃色葡萄球菌生長為條件的培養基成分組成，一般為酵母提取物、葡萄糖和必需的鹽，且在本發明的一些情況中包括植物胺基酸和肽(如大豆、豌豆水解產物或棉籽水解肽)作為胺基酸源。例如植物胺基酸或肽可以來源於任何非動物(如植物或類植物)或合成(如化學合成)源，且在本發明的一個實施方案中，植物胺基酸和肽源自大豆。所述成分可以為濃度約為50克/升(g/L)的酵母提取物、15g/L的大豆肽和5至10g/L的葡萄糖，這些成分溶解於純化的去離子水中，發酵時視需要加入稀磷酸和稀氫氧化鈉以控制pH在約7至8之間。所述培養基還可以含有至少0.67毫升/升(mL/L)的聚乙二醇以防止在發酵混合物中起泡。在優選實施方案中，為大批量製備在發酵培養液中接種大約5xl(^的StaphImre菌抹的金黃色葡萄球菌。為確保蛋白A製劑中完全沒有動物產品汙染，將用於接種到發酵培養液中的金黃色葡萄球菌種也保持在植物培養基中。優選金黃色葡萄球菌在37。C發酵13至14小時以得到高密度的細菌，在560納米(nm)下檢測濃度大於50(或大於5.2x108S.aureus/mL),但是可以在任何地方發酵10至24小時以得到所需細菌濃度，由本領域技術人員確定合適的生長時間。通過在MuellerHintonAgar(其有利於革蘭氏陰性菌的生長)上，生長特定控制的發酵培養液樣品，進一步檢測證實培養物純度，且對於簡單代謝產物如穀氨醯胺、半乳糖、mellobiose等，根據代謝產物鑑別生長或非生長的固定圖形。市售用於進行這種鑑定和純化分析的試劑盒，例如來自BioM6rieux。可以在顯微鏡下可視地評估發酵培養液以確保所述培養液沒有被其它微生物汙染。相似地，可以使用顯微鏡觀察培養物中金黃色葡萄球菌的適當形態，其包括具有革蘭氏陽性球菌的形狀、多形態(即單菌落(singlecolonies)、杆狀(chains)或玫瑰花形(roseates))和大約0.6微米的大小。也可以通過檢測是否它們在血液瓊脂平皿上呈現為圓形、突起、淺灰色形態；48小時後他們有引起羊血的p-溶血的能力；和對於酶凝固酶和過氧化氫酶的檢測陽性，來評估所培養的金黃色葡萄球菌的品質和健康。優選在所需的條件下培養液的發酵將導致植物蛋白A產物的濃度為0.68毫克/毫升(mg/mL)培養基。然後可以通過使培養液通過使用0.1微米過濾器的過濾系統(例如MilliporeProstak過濾系統)收集發酵培養基中的植物蛋白A。也可以使用其它適合的過濾方法以除去細菌細胞，例如任何有基質輔助劑，如硅藻土的深層過濾方法。也可以通過金黃色葡萄球菌發酵培養基的連續高速離心消除葡萄^求菌細胞，離心使細菌細胞沉澱且使培養基富含分泌的蛋白A。然後進一步純化前，將沒有細胞的培養液(cell-freebroth)通過無菌0.22微米過濾器或其類似物。純化植物蛋白A通過下遊一些方法步驟以產生純化的植物蛋白A製劑。因此，本發明的方法也涉及植物蛋白A的純化。在一個實施方案中，含有植物蛋白A的培養基可以通過滲濾(diafiltration)以降低溶液的電導率並移除與植物蛋白A同時存在的非蛋白物質。優選降低植物蛋白溶液的電導率使得其不大於2毫西門子/釐米(mS/cm)。可以使用過濾器和所需的緩沖液對溶液進行滲濾，且在本發明的實施方案中使用10,000分子量截止點(molecularweightcut-off)(MWCO)的膜在pH7.8的10毫摩爾(mM)TrisHCl緩沖液中完成滲濾。滲濾的方法是本領域中已知的，且可以包括MWCO膜(如MilliporePROCON)、中空纖維透析過濾器(如FreseniusOptiFlux)或任何其它分子量截止點適合得到最大和/或所需產率的植物蛋白A的過濾系統。然後可以使用色譜方法純化含有植物蛋白A的培養基，其中色譜材料不含動物源的物質。在本發明的一個實施方案中，通過將含有植物蛋白A的溶液施加到陰離子交換色譜樹脂上而純化蛋白A。可以使用多種陰離子交換樹脂，且適合的材料包括纖維素、丙烯醯胺和矽膠。市售有許多陰離子交換色譜系統，且在本發明的最優選實施方案中，使用MacroPrepHighQ陰離子交換樹脂純化含有植物蛋白A的溶液。通過本領域公知的方法可以將蛋白A施加到陰離子交換色譜基質上。一般，使色譜柱與含有植物蛋白A的溶液(即pH7.5至8.5)的pH和電導率保持平衡，且含有植物蛋白A的培養基通過柱子，柱子與植物蛋白由於分子間相互作用結合。在一個實施方案中，用平衡緩衝液洗滌與柱子結合的植物蛋白A,且可以用任何適合pH和電導率的緩衝液洗滌。色譜優選在高度為約24釐米的柱子上以5.7至7.9cm/分鐘的流速進行。然後使用帶適當電荷的緩衝液從柱子中洗脫出植物蛋白A，且在本發明的具體實施方案中，使用20mM的TrisHCl和電導率為約18mS/cm的氯化鈉(NaCl)。在本發明的一個實施方案中，植物蛋白A培養基的陰離子交換色譜產生含有至少95%純蛋白A的植物蛋白A洗脫液。在優選實施方案中，蛋白A洗脫液含有的蛋白A純度高於95。/c,且最優選純度為97至99%。在本發明的另一個實施方案中，滲濾來自陰離子交換色譜柱的植物蛋白A洗脫液以調節該溶液的pH和電導率。最優選使用10,000MWCO的膜進行滲濾以產生pH為約6.5至7.1且電導率為1至2mS/cm的植物蛋白濾液。在本發明另一個實施方案中，然後可以任選通過羥基磷灰石色譜進一步純化植物蛋白A以去除非蛋白汙染物。羥基磷灰石是混合型離子交換色譜樹脂，其使蛋白(蛋白A)先洗脫出來而含糖化合物在蛋白之後洗脫出來。優選在色譜柱中，羥基磷灰石樹脂具有高度為20cm的樹脂床。一旦將植物蛋白施加到羥基磷灰石樹脂上，便用緩衝液洗滌，且在本發明的實施方案中，緩沖液為pH6,8的14mM的磷酸鈉。在優選實施方案中，然後使用pH6.8的370mM的磷酸鈉將植物蛋白A從羥基磷灰石柱子中洗脫出來。純化後，可將植物蛋白A濃縮到所需體積和/或適合存儲或使用的濃度。濃縮蛋白的機理是本領域中公知的，且一般包括過濾或離心。在本發明的一個實施方案中，通過陰離子交換色譜後濃縮植物蛋白A溶液，而在另一個實施方案中通過羥基磷灰石色譜後濃縮植物蛋白A溶液。在本發明的優選實施方案中，可以使用10,000MWCO的過濾器濃縮植物蛋白A洗脫液使植物蛋白A製劑達到5至20mg/mL。為了在要求生理pH的應用中使用植物蛋白A,可以將濃縮的植物蛋白A的pH調節到中性pH，優選使用磷酸緩沖液。組合物和治療方法本發明還涉及通過本發明的方法製備的植物蛋白A。可以將植物蛋白A直接給予患者或更優選地與適合載體組合給藥。因此，本發明也涉及包含植物蛋白A和適合載體的藥物組合物。適合藥學載體(如Eupergit或Glyoxal瓊脂珠)是本領域中已知的且根據給藥途徑改變。本發明還涉及用植物蛋白A藥物組合物治療患者的方法。在一個實施方案中，給予所需患者植物蛋白A藥物組合物以刺激細胞因子或冷球蛋白產生。最優選的，以這種方式治療患者以抵抗感染或增強缺乏免疫力的免疫系統。本領域技術人員合適地確定給予植物蛋白A藥物組合物，但是更合適的給藥方法是通過注射到患者的血流中。本發明也涉及固定到色譜樹脂的植物蛋白A。植物蛋白A固定的樹脂可以小至40微米或大至300微米。在本發明的一個實施方案中，所述樹脂為合成聚合物(如，聚曱基丙烯酸酯)、半合成聚合物(如，聚半乳糖)或無定形物質(如，硅藻土或二氧化矽)。本發明的另一個實施方案，可以通過將植物蛋白A上的羧基或氨基與色譜樹脂上的化學官能團反應產生植物蛋白A-樹脂。在本發明的一個優選實施方案中，將植物蛋白A的羧基與樹脂上的氨基反應以產生植物蛋白A-樹脂。在另一個實施方案中，用三。秦活化樹脂且蛋白A與結合到樹脂的三。秦反應。在另一個實施方案中，使用醛活化的基質或糖基質可以得到非常高的蛋白A結合效價，方法是首先通過用高碘酸鈉氧化樹脂，然後使用抗壞血酸或硼氫化鈉還原基質上的蛋白A。在最優選的實施方案中，在蛋白中多個位點將植物蛋白A連接到樹脂上以使蛋白A從樹脂上的脫離最小化。本發明也涉及將抗體或抗體片段與植物蛋白結合的方法。術語"抗體"和"抗體片段"指包括多克隆和單克隆抗體。而且，本文所用的術語抗體也包括多種抗體，其包括人抗體、嵌合抗體、人化抗體、靈掌源抗體、veneered或單鏈抗體。可以通過本領域公知的方法將抗體或抗體片段施加到植物蛋白A-樹脂上而將抗體或抗體片段與植物蛋白A-樹脂結合。例如，一般用下述方法將抗體與樹脂結合，通過在抗體與樹脂結合的條件下將抗體溶液應用到樹脂上，並用適合的緩沖液洗滌抗體結合樹脂以除去未結合的材料。在一個實施方案中，為了純化抗體，將抗體或抗體片段與植物蛋白A-樹脂結合。本發明還涉及包含使用植物蛋白A-樹脂純化的抗體或抗體片段和適合載體(如，DohkaiMicrosphere矽珠)的藥物組合物。可以通過本領域技術人員已知的方法純化抗體。事實上，使用蛋白A-色譜樹脂純化抗體是最廣泛使用的方法和本領域公知的方法(參見，如Harlow,E.,和Lane,D.P.，Antibodies,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NewYork物組合物治療所需患者。存在許多疾病，其可以使用純化的抗體治療，所述疾病包括炎性疾病(如，克羅恩病、貝切特氏病和結腸炎)、風溼性疾病、多發性硬化症、阿爾茨海默病、狼痦、癌症、皮膚病和過敏症。在具體實施方案中，治療癌症患者。本發明也涉及包含植物蛋白A-樹脂和適合載體的藥物組合物和通過給予植物蛋白A-樹脂藥物組合物治療所需患者的方法。在本發明的一個實施方案中，治療獲得性血友病患者。在本發明的另一個實施方案中，治療自身免疫疾病和免疫相關問題的患者。在本發明的另一個實施方案中，自身免疫疾病為類風溼性關節炎和擴張型心肌病。在本發明的另一個實施方案中，免疫相關問題為移植物抗宿主疾病和移植器官的排斥反應。適合載體和給藥方式根據所述方法，可以通過合適的途徑，單獨或與其它藥物組合給藥藥學植物蛋白A組合物或純化的抗體或抗體片段至患者。給予患者有效量的藥物組合物(如，植物蛋白A、固定到色譜樹脂上的植物蛋白A或使用植物蛋白A-樹脂純化的抗體)。有效量為在給藥條件下足以實現所需治療或預防作用的量，如足以刺激免疫細胞或結合疾病相關蛋白的量。可以以單劑量或多劑量給藥藥物組合物以確保在治療期間患者維持植物蛋白A藥物組合物或被植物蛋白A純化的抗體的高血漿含量。可以通過本領域已知的方法確定劑量，且劑量依賴於例如特定的試劑選擇、受試者的年齡、體重、對藥物的敏感性和耐受性和整體健康狀況。對於含有植物蛋白A的藥物組合物的適合劑量為每次治療約0.001毫克/千克(mg/kg)至約10mg/kg體重，且對於用植物蛋白A純化的抗體的劑量為每次治療約0.01mg/kg至約100mg/kg體重。根據試劑和所要治療的疾病或病症，多種給藥途徑是可能的，其包括例如口服、飲食、局部、經皮、直腸、胃腸外(如，靜脈內、動脈內、肌內、皮下注射、真皮內注射)和吸入(如，氣管內(intrabonchial)、鼻內或口腔吸入、滴鼻劑)的給藥途徑。根據指示，給藥可以是局部或全身的。給藥的優選方式可以根據具體選擇的試劑和所要治療的具體疾病而改變；然而，一般優選口服或胃腸外給藥。植物蛋白A藥物組合物和純化的抗體的製劑將根據所選擇的給藥途徑(如溶液、乳劑或膠囊)而改變。適合的藥學載體可含有惰性成分，其不與植物蛋白A藥物組合物或植物蛋白A純化的抗體相互作用。可以使用標準藥學製劑才支術，如在Remington'sPharmaceuticalSciences,MackPublishingCompany,Easton，PA.中所述。用於胃腸外給藥的適合藥學載體包括，例如無菌水、生理鹽水、抑菌鹽水(鹽水含有約0.9。/。mg/ml的苯曱醇)、磷酸鹽緩衝的鹽水、漢克溶液、林格乳液等。包裹組合物的方法(如在硬明膠或環葡聚糖中的包衣)是本領域中已知的。對於吸入劑，試劑可以溶解或裝載到用於給藥的適合的分配器中(如噴霧器或霧化器或加壓的氣霧劑分配器)。以本發明的示例的方式給出下述實施例，且並不是為了以任何方式限制本發明。實施例實施例1其中培養金黃色葡萄球菌以製備植物蛋白A的發酵培養液(fermentationbroth)的成分為濃度約50克/升的酵母提取物、15克/升的大豆肽和5至10克/升的葡萄糖。具體地，為了製備分批發酵，植物培養基含有的物質的濃度見於表1。表l.用於發酵培養液的物質tableseeoriginaldocumentpage14實施例2在製備分批發酵製備中，用於發酵產生植物蛋白A的金黃色葡萄球菌的條件列於表2。表2.發酵罐參數tableseeoriginaldocumentpage15實施例3植物蛋白A活性檢測通過使用簡單的試驗測定每階段蛋白A的活性和產率。驗證小IgG-瓊脂糖柱對於使用通過標準方法製備的蛋白A的結合活性和結合能力。使用含有亞飽和量蛋白A的樣品，洗滌柱子，用pH2.2的甘氨酸緩沖液洗脫蛋白A，且用OD"s檢測蛋白A的濃度。始終使用該試驗以檢測植物蛋白A的活性和產率。或者，使用HPLC和反相離子交換或空間排阻柱色譜(sizeexclusioncolumnchromatograph)幾乎可以更方便地定量檢測粗提取物。MacroPrepHighQ陰離子交換色語經過評估許多市售的色譜樹月旨(Mallinckrodt、EMD、BioRad、Millipore)後，選擇BioRadMacroPrepHighQ(uarternary)陰離子交換樹脂。使用PharmaciaBiotechBioPilot自動化色譜系統將滲濾後的培養液施加到小的67mL柱上，使用Unicorn軟體用於配製管理(1.5cmx38cm柱；12mL/分)並收集數據。施加滲濾後的培養液後，用6倍柱體積的pH7.8的10mM的TrisHCl洗滌柱子。使用6倍柱體積的pH7.8的20mM的TrisHCl+NaCl至8mS/cm(分步梯度)洗脫活性植物蛋白A。隨後用pH7.8的20mM的TrisHCl+0.5M的NaCl洗滌柱子以除去粘附在柱子上半部分的褐色物質。定期地，使用幾倍柱體積的0.1M的NaOH完全淋洗柱子，然後用幾倍柱體積的pH7.8的0.2M的TrisHCl洗滌以調節pH並用10mM的TrisHCl調節電導率。將150mL含有大約0.5克(gm)蛋白的滲濾/濃縮的培養液施加到含有106mg植物蛋白A的67mL柱子上。在所選擇(收集的(cut))的級分中，回收58mg的植物蛋白A(55%)。在其它可用的級分中含有約28mg的植物蛋白A(26%)。而僅深入研究第一次收集的級分，SDS-PAGE表明後面的級分可能也是適合的。如果能夠收集所有洗脫液，那麼對於陰離子交換色譜步驟回收率將達到81%。圖1表示在無細胞培養液、滲濾的培養液(diafilteredbroth)、通過MacroPrepQ的液流和乂人MacroPrepHighQ色i普運4亍獲得的各級分的SDS-PAGE的圖譜。沒有調整上樣量，因此一些通道對於一個或多個條帶上樣過量。儘管一些條帶飽和，但是仍可以進行一些所關心的觀察。圖語分析表明植物蛋白A可以說明在培養液中存在差不多20%的蛋白。(儘管有二者的間接存在的化學證據，但沒有檢測存在的脂質或糖類的量。)第二，在培養液中一些蛋白明顯沒有與MacroPrepQ結合且通過了柱子(見通過柱子的液流)。稀釋級分5至11並將其施加到SDS-PAGENovex4至12%梯度凝膠。以前的研究已經證明了使用該系統對0.05微克((ig)至2.0(xg的樣品線性響應。在主條帶下，一些次級條帶是明顯的。這對蛋白A是典型的，且表示異構體(isoforms),其它研究已經證明了其存在於發酵產物中。異構體的存在不是因為下遊純化過程中的降解產生的，而很可能是因為發酵過程中金黃色葡萄球菌分泌的公知的蛋白酶的降解。圖2中出現了與級分6的行掃描相對的條帶掃描(更精確)。主峰佔90.2%的蛋白，另外異構體佔8.4%。級分7(圖譜中沒有表明)具有96.5%的主峰和1.9%的異構體。級分8(圖譜中沒有表明)具有97.4%的主峰和1.0%的異構體。參見圖3，通過進行蛋白A活性的蛋白印跡(westernblot)確定表明作為異構體的條帶含有蛋白A活性的證據。將100納克和10納克的雙份(induplicate)MacroPrepQ製備的植物蛋白A的合併樣品在NovesSDS-PAGE4至12%凝膠上進行電泳。凝膠上包含預染的分子量標準。當凝膠電泳完成後，該蛋白樣品被電泳(60V/300mAmp/lhr)轉移至Towbin轉移緩沖液中的0.2微米硝化纖維素膜(BioRad)。在TrisHCl緩衝的鹽水中洗滌印跡膜(blottedmembrane),然後用SuperBlock封閉1小時。用0.05%Tween-20的TrisHCl緩衝鹽水(TTBS)洗滌後，將該膜用兔抗鼠IgG-鹼性磷酸酶綴合物培育30分鐘。用TTBS洗滌2次(每次5分鐘)後，將該膜浸漬在來自VectorLabs的VectorBlack染色劑(BCIP/NBTSubstrateKit,5-溴-4-氯-3-口引哚基磷酸酯/硝基藍四唑)中。化學反應過程中底物與鹼性磷酸酶的反應副產物在膜中形成黑色沉澱，並且可以鑑定鹼性磷酸酶的位點。由於鹼性磷酸酶與兔IgG綴合，所以其位點與膜上的蛋白A活性位點相同。使用該技術不僅方便地染色植物蛋白A和通過標準方法(參見FreseniusSpA,圖3)製備的蛋白A的主條帶，而且主條帶下的一些次級條帶也很容易的顯示出來。而且，植物蛋白A的主條帶跑至50,000千道爾頓(KD)至38,000KD分子量之間的標記處。通過MALDITOF質譜檢測，通過標準方法製備的蛋白A具有47,000KD的分子量。因此，蛋白印跡法確認植物蛋白A為所需大小。實施例41型陶覺羥基磷灰石(ceramichydroxylapatite)用pH6.8的14mM的磷酸鈉(磷酸Na)將MacroPrepQ的合併級分滲濾至小於2mS/cm。將該樣品施加到8mL的用14mM磷酸鈉平衡的BioRad陶瓷羥基磷灰石色譜柱。在液流通過期間出現淺峰。(BioPilot使用大約260至290納米的UV帶寬過濾器(filter)。)因為該峰為淺峰，所以雖然其可能表示真實的物質，但其可能表示攜帶的緩沖液或一些其它緩衝系統的鬼峰(artifact)。然後用5倍柱體積pH6.8的14mM磷酸鈉(1.7mS/cm)洗滌柱子。然後用5倍體積pH6.8的370mM磷酸鈉(25mS/cm)洗脫植物蛋白A。首先，將要通過活性試驗檢測的26mg植物蛋白A上樣到柱子上，且回收了27mg活性植物蛋白A，即在試驗誤差內完全回收。為適合上樣至NOVEX4至12%的SDS-PAGE(參見圖4)上，將主峰的樣品進行稀釋或不稀釋。再次出現一條主條帶，就在主植物蛋白A條帶下有的一些次級條帶。接近染色前沿的凝膠的接近底部處的次級條帶是明顯的。通過蛋白印跡法檢測級分2樣品的蛋白A活性。如圖3所示，主條帶和異構體是非常明顯的。在蛋白印跡上沒有其它的蛋白A活性。圖5中，對SDS-PAGE上的級分3的每條條帶進行圖譜分析。各圖主條帶分別表示存在的94.9%和94.6%的蛋白。異構體分別為2.8%和2.6%。因此，植物蛋白A表示存在約為97%至98%的蛋白。通過對優選實施方案的引用具體說明和描述了本發明，本領域的技術人員將理解在不脫離從屬權利要求包括的本發明範圍內可以在形式和細節上進行不同的修改。權利要求1.製備植物蛋白A的方法，其包括在包含植物胺基酸或肽的培養基中發酵金黃色葡萄球菌(S.aureus)的分泌菌株以製備蛋白A，所述培養基中沒有動物產品；收集含有蛋白A的培養基；和純化蛋白A，其通過將含蛋白A的培養基施加到不含動物產品的合成色譜樹脂上和從樹脂中洗脫蛋白A。2.權利要求1的方法，其中所述金黃色葡萄球菌為分泌菌林StaphImre。3.權利要求2的方法，其中將所述用於接種到發酵罐的金黃色葡萄球菌菌種保持在植物培養基中。4.權利要求3的方法，其中將所述金黃色葡萄球菌發酵10至24小時。5.權利要求4的方法，其中將所述金黃色葡萄球菌發酵13至14小時。6.權利要求5的方法，其中通過使用10毫摩爾的羥曱基氨基曱烷和NaCl滲濾，將含蛋白A的培養基的pH調節到約7.5至8.5且將電導率調節到小於2毫西門子/釐米。7.權利要求6的方法，其中將所述含蛋白A的培養基施加到用於純化的陰離子交換色譜樹脂上。8.權利要求7的方法，其中所述色譜在約24釐米高的柱子上，以線流速約5.7至7.9釐米/分鐘進行。9.權利要求8的方法，其中使用至少20毫摩爾的TrisHCl和NaCl在約8毫西門子/釐米的電導率下，從色譜柱中洗脫所述蛋白A。10.權利要求9的方法，其中通過使用14毫摩爾的pH6.8的磷酸鈉滲濾，將所述蛋白A洗脫液的pH調節到約pH6.5至7.1,且將電導率調節到約1至2毫西門子/釐米。11.權利要求10的方法，其中使用具有IO，OOO分子量截止點的膜滲濾所述蛋白A。12.權利要求11的方法，其還包括使用10,000分子量的濾膜將所述蛋白A濾液濃縮至約5至20毫克/毫升，和調節所述蛋白A溶液至中性pH。13.權利要求10的方法，其中使用磷酸鹽緩衝液將蛋白A溶液的pH調節到中性pH。14.權利要求11的方法，其還包括將所述蛋白A濾液施加到羥基磷灰石色譜柱上以除去非蛋白汙染並從柱子中洗脫出蛋白A。15.權利要求14的方法，其中用pH6.8的14毫摩爾磷酸鈉洗滌所述施加到柱子上的蛋白A，並用pH6.8約370mM的磷酸鈉洗脫。16.權利要求15的方法，其中柱子中樹脂床的高度為約20釐米。17.權利要求16的方法，其還包括使用10,000分子量的濾膜將來自羥基磷灰石色譜柱的蛋白A洗脫液濃縮至約5至20毫克/毫升，並將所述蛋白A溶液調節到中性pH。18.權利要求17的方法，其中使用磷酸鹽緩沖液將所述蛋白A溶液的pH調節到中性pH。19.用於發酵金黃色葡萄球菌的植物培養基，其基本上由下列組成酵母提取物、植物胺基酸和肽、葡萄糖和必需的鹽。20，權利要求19的植物培養基，其中所述植物胺基酸和肽為大豆肽。21.權利要求20的植物培養基，其中所述酵母提取物的濃度為約50克/升，所述大豆肽的濃度為約15克/升，且所述葡萄糖的濃度為約5至10克/升。22.製備植物蛋白A的方法，其包括在基本上由酵母提取物、大豆肽、葡萄糖和必需鹽的組成的培養基中發酵St叩hImre以製備蛋白A;收集含有蛋白A的培養基；通過將含蛋白A的培養基施加到沒有動物產品的強陰離子交換樹脂上和從樹脂中洗脫蛋白A而純化蛋白A。23.權利要求22的方法，其中將所述用於接種到發酵罐的金黃色葡萄球菌菌種保持在植物培養基中。24.權利要求23的方法，其中將所述金黃色葡萄球菌發酵10至24小時。25.權利要求22的方法，其中將所述金黃色葡萄球菌發酵13至14小時。26.權利要求25的方法，其中使用10毫摩爾的三羥曱基氨基曱烷和NaCl，將含蛋白A的培養基的pH調節到約7.5至8.5且將電導率調節到小於2.0毫西門子/釐米。27.權利要求26的方法，其中所述色語在約24釐米高的柱子上，以線流速約5.7至7.9釐米/分鐘進行。28.權利要求27的方法，其中使用至少20毫摩爾的TrisHCl和NaCl在約18毫西門子/釐米的電導率下，從色譜柱中洗脫所述蛋白A。29.權利要求28的方法，其中通過使用14毫摩爾pH6，8的磷酸鈉滲濾，將所述蛋白A洗脫液的pH調節到約pH6.5至7.1，且將電導率調節到約1.0至2.0毫西門子/釐米。30.權利要求29的方法，其中使用具有10,000分子量截止點的膜滲濾所述蛋白A洗脫液。31.權利要求30的方法，其還包括使用10,000分子量的濾膜將所述蛋白A濾液濃縮至約5至20毫克/毫升，和調節所述蛋白A溶液至中性pH。32.權利要求31的方法，其中使用磷酸鹽緩沖液將蛋白A溶液的pH調節到中性pH。33.權利要求30的方法，其還包括將所述蛋白A濾液施加到羥基磷灰石色譜柱上以除去非蛋白汙染物並從柱子中洗脫出蛋白A。34.權利要求33的方法，其中所述施加到柱子上的蛋白A濾液用pH6.8的14毫摩爾磷酸鈉洗滌，並用pH6.8約370mM的磷酸鈉洗脫。35.權利要求34的方法，其中柱子中樹脂床的高度為約20釐米。36.權利要求34的方法，其還包括使用10,000分子量截止點的濾膜將來自羥基磷灰石色譜柱的蛋白A洗脫液濃縮至約5至20毫克/毫升，並將所述蛋白A溶液調節到中性pH。37.權利要求36的方法，其中使用磷酸鹽緩沖液將所述蛋白A溶液的pH調節到中性pH。38.通過權利要求1的方法製備的植物蛋白A。39.植物蛋白A。40.藥物組合物，其包括權利要求39的植物蛋白A和適當的載體。41.通過給藥權利要求40的藥物組合物治療所需的患者的方法。42.權利要求41的方法，其中治療患者以刺激細胞因子或冷球蛋白產生。43.權利要求41的方法，其中治療感染或免疫系統缺乏的患者。44.權利要求43的方法，其中通過注射到患者的血流給予所述藥物組45.權利要求39的植物蛋白A，其固定到色譜樹脂上以得到植物蛋白A-色譜樹脂。46.權利要求45的植物蛋白A-色語樹脂，其中所述色譜樹脂為合成聚合物或無定形物質。47.權利要求46的植物蛋白A-色譜樹脂，其中所述合成聚合物為聚甲基丙烯酸酯或聚半乳糖。48.權利要求46的植物蛋白A-色語樹脂，其中所述無定形物質為二氧化矽或硅藻土。49.權利要求45的植物蛋白A-色譜樹脂，其通過將植物蛋白A上的羧基或氨基與色譜樹脂上的化學官能團反應而製備。50.將抗體或抗體片段結合到色譜樹脂上的方法，其包括將抗體或抗體片段施加到權利要求45的植物蛋白A-色譜樹脂上。51.權利要求50的方法，其中將所述抗體或抗體片段施加到植物蛋白A-色譜樹脂上以純化抗體或抗體片段。52.藥物組合物，其包括通過權利要求51的方法製備的純化的抗體或抗體片段和適當的載體。53.通過給予權利要求52的藥物組合物治療所需患者的方法。54.權利要求53的方法，其中治療癌症患者。55.藥物組合物，其包括權利要求45的植物蛋白A-色譜樹脂和適當的載體。56.通過給藥權利要求55的藥物組合物治療所需患者的方法。57.權利要求56的方法，其中治療獲得性血友病的患者。58.權利要求56的方法，其中治療自身免疫疾病或免疫相關問題的患者。59.權利要求58的方法，其中所述自身免疫疾病為類風溼性關節炎或擴張型心肌病。60.權利要求58的方法，其中所述免疫相關問題為移植物抗宿主疾病。全文摘要本發明涉及製備沒有被動物產品汙染的蛋白A的方法。本發明也涉及植物發酵培養基，金黃色葡萄球菌在其中生長以產生植物蛋白A。本發明還涉及植物蛋白A和植物蛋白A在治療和預防方法中的用途。文檔編號C12N1/20GK101268182SQ200680034739公開日2008年9月17日申請日期2006年9月12日優先權日2005年9月20日發明者丹尼爾·N·拉福,南都·德奧卡,託馬斯·R·利裡申請人:馬林克羅特貝克公司