利用微桿菌J‑1修復DEHP汙染土壤並降低種植蔬菜中DEHP含量的方法與流程
2023-06-01 02:48:52 1
本發明涉及環境汙染物生物處理技術領域，具體地，涉及利用微桿菌J-1修復DEHP汙染土壤並降低種植蔬菜中DEHP含量的方法。
背景技術：
隨著社會經濟和城市化的快速發展，大量「三廢」的不合理排放導致農田土壤有機汙染物汙染日趨嚴重，對農產品質量安全造成嚴重威脅。其中，農田土壤的毒性有機物汙染以鄰苯二甲酸酯(PAEs)汙染程度較高，含量在μg/kg～mg/kg數量級，遠高於多環芳烴、多氯聯苯等持久性有機汙染物。PAEs主要被用作塑料工業的增塑劑，目前已成為全球最普遍的汙染物之一，被美國環境保護局(EPA)和中國環境監測總站列為優先控制汙染物。PAEs屬於環境內分泌幹擾物，對人體具有較強的毒性，包括肝/腎毒性、神經毒性、生殖發育毒性，甚至致癌效應等。根據美國國家癌症研究所的研究結果，其中鄰苯二甲酸二甲酯(DMP)，鄰苯二甲酸二乙酯(DEP)、甲酸二正丁酯(DBP)、鄰苯二甲酸丁苄酯(BBP)、鄰苯二甲酸二正辛酯(DOP)和鄰苯二甲酸二異辛酯(DEHP)等6種鄰苯二甲酸酯被美國EPA列為優先控制汙染物。已有的調查數據顯示，我國農業土壤中PAEs化合物有不同程度的超標，部分土壤的個別PAEs化合物超標嚴重。土壤中PAEs會被蔬菜等作物吸收並在體內累積，居民食用含PAEs的農產品導致長期低劑量暴露，嚴重危害人體健康，因此PAEs汙染土壤中農作物生產及食品安全問題亟待解決。
環境中的PAEs可通過水解、光解和生物降解而消失，其中生物降解是其消失的主要途徑。近年來，PAEs的細菌降解已經得到廣泛的研究，大量高效降解PAEs的菌株已經從各類環境中分離得到，包括紅樹林、土壤、海洋、河流與廢水處理廠的活性汙泥等。然而，大多數已報導的PAEs降解菌僅限於實驗室內進行搖瓶降解研究，很少應用到汙染農田土壤的安全生產中。
技術實現要素：
本發明的目的是為了克服現有技術的上述不足，提供一種修復DEHP汙染土壤同時降低汙染土壤種植蔬菜中DEHP含量的方法。
為了實現上述目的，本發明是通過以下技術方案予以實現的：
一種修復DEHP汙染土壤同時降低汙染土壤種植蔬菜中DEHP含量的方法，具體為，在DEHP汙染土壤中栽種菜心，在菜心根系周圍接種Microbacterium sp.J-1菌株。
Microbacterium sp.J-1菌株是發明人前期開發的一株DEHP高效降解菌，該該菌株於2015年1月22日保藏在中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO：M2015055。發明人對於該菌株的應用研究僅僅局限在實驗室內進行搖瓶降解研究，沒有應用到汙染農田土壤的安全生產中。本發明的研究發現，僅僅將Microbacterium sp.J-1菌株接種到DEHP汙染土壤中，並不能實現持續性的修復作用，因為，隨著接種時間的增加，Microbacterium sp.J-1菌株會死亡。但是如果在DEHP汙染土壤中接種Microbacterium sp.J-1菌株，並同時種植菜心，蔬菜根系環境為Microbacterium sp.J-1菌株提供了可利用的有機質，使接種的菌株可以長期存活於土壤中，對汙染土壤實現持續性的修復作用，同時還可以種植質量安全達標的菜心，做到「邊生產邊修復」的模式。
為了方便應用，作為優選的實施方式，所述Microbacterium sp.J-1菌株做成凍幹活性菌劑後再接種到汙染土壤中，凍幹活性菌劑的製備方法如下：
(1)將Microbacterium sp.J-1菌株活化後進行發酵培養，發酵的溫度為30～32℃，pH為8.0～8.3，接種量OD600＝0.6～0.8；
(2)步驟(1)得到的發酵液在4500～5000rpm的轉速下離心8～12min，收集菌體，菌體加入保護劑後進行預凍，預凍好的菌體進行真空冷凍乾燥，獲得凍幹菌劑，凍幹菌劑復水後即可接種到DEHP汙染土壤中。
更優選地，步驟(1)中所述發酵的溫度為32℃，pH為8.3，接種量OD600＝0.8。在這樣的發酵條件下，菌株的發酵量和活力最大。
不同的離心條件會影響菌株的活性和收率，優選地，步驟(2)中所述發酵液在5000rpm的轉速下離心10min。
不同的保護劑對於Microbacterium sp.J-1菌株凍幹過程中的保護力度不同，優選地，步驟(2)中保護劑為葡萄糖、蔗糖、海藻糖或澱粉。
更優選地，所述保護劑的添加量為4.8～9.6mg保護劑/g菌體。
作為優選實施方案，製備的凍幹活性菌劑按照2～3mg凍幹菌劑/g汙染土壤的量接種到DEHP汙染土壤中。
更優選地，製備的凍幹活性菌劑按照2.5mg凍幹菌劑/g汙染土壤的量接種到DEHP汙染土壤中。
更優選地，所述Microbacterium sp.J-1菌株以滴管的方式接種到菜心根系周圍土壤中。
與現有技術相比，本發明具有如下有益效果：
本發明在DEHP汙染土壤中接種Microbacterium sp.J-1菌株，並同時種植菜心，菜心根系環境為Microbacterium sp.J-1菌株提供了可利用的有機質，使接種的菌株可以長期存活於土壤中，對汙染土壤實現持續性的修復作用，同時還可以種植質量安全達標的菜心，做到「邊生產邊修復」的模式。
附圖說明
圖1為發酵條件(溫度、pH和接種量)對DEHP降解效果的模型方程響應面3D分析。
圖2為不同轉速和時間對菌體存活率的影響。
圖3為加入不同種類濃度凍幹保護劑後凍幹菌體存活率。
圖4為不同處理下的土壤中DEHP殘留(a)和蔬菜中DEHP含量及其生物量(b)變化。
圖5為利用DGGE檢測不同處理下的土壤中接種菌株J-1在接種後7,21和35天的變化，圖中箭頭所指為菌株J-1的DNA條帶；條帶1-3，4-6,7-9和10-12分別為對照、接種菌株、種植菜心和種植菜心+接種菌株的土壤在接種後7,21和35天的微生物群落DNA條帶變化；條帶13為菌株J-1的DNA條帶。
具體實施方式
下面結合說明書附圖和具體實施例對本發明作出進一步地詳細闡述，所述實施例只用於解釋本發明，並非用於限定本發明的範圍。下述實施例中所使用的試驗方法如無特殊說明，均為常規方法；所使用的材料、試劑等，如無特殊說明，為可從商業途徑得到的試劑和材料。
實施例中涉及的培養基配方如下：
計數和斜面培養基：牛肉膏5.0g，蛋白腖10.0g，氯化鈉10.0g，瓊脂15.0g，加超純水至1L，調節pH＝7.0。121℃滅菌20分鐘。
種子液培養基：即牛肉膏蛋白腖培養基，牛肉膏5.0g，蛋白腖10.0g，氯化鈉10.0g，加超純水至1L，調節pH＝7.0。121℃滅菌20分鐘。
液體發酵培養基：酵母粉5.0g，蛋白腖10.0g，氯化鈉10.0g，無機鹽溶液1.0mL(g/L，含K2HPO4：5.8；KH2PO4,4.5；(NH4)2SO4,2.0；MgCl2,0.16；CaCl2,0.02；Na2MoO4·2H2O：0.0024；FeCl3,0.0018；MnCl2·2H2O：0.0015)，土壤浸液100mL，加超純水至1L，調節pH＝7.0。121℃滅菌20分鐘。
實施例1
Microbacterium sp.J-1降解菌的發酵條件優化與凍幹菌劑的製備，具體方法如下：
1、發酵條件優化：取4℃下保存菌種用斜面培養基於30℃下活化24h。將活化菌種用10mL無菌水製成菌懸液，以OD600＝1.0的接種量接於種子液培養基，於30℃、180rpm下恆溫震蕩培養24h；以OD600＝1.0的接種量將種子液接入搖瓶液體發酵培養基中(含200mg/L DEHP)，於30℃、180rpm下培養，每隔24h取樣1次，對菌株活化條件初始pH(6～10)、溫度(20～40℃)、接種量(0.2～1.0)進行響應曲面(RSM)優化。採用Box-Behnken實驗設計，對上述三個因素採用高、中、低三個水平，見表1。採用SPSS統計學軟體，以顯著因素為自變量，以DEHP降解菌為響應值採用3因素3水平15組試驗進行響應面優化(見表2)，以確定最佳降解發酵條件。
方差分析結果見表3，回歸項模型P<0.001，說明回歸效果顯著。對各試驗因子進行，回歸方程擬合，擬合結果如下：
Y＝8811.1+248.65X1+334.4788X2+1283.826X3-1903.369X12-2879.356X22-1103.506X2
回歸方程相關係數R2＝0.9936。進一步說明回歸方程擬合度較好。綜合響應曲面分析和回歸方程繪製相應曲面圖形(見圖1)，獲得最佳發酵條件溫度為32℃，pH為8.3，接種量OD600＝0.8。
按此最佳發酵條件進行菌體發酵，獲得大量菌體。
表1採用Box-Behnken實驗設計參數水平
表2RSM實驗設計及結果
表3各因素顯著性及效應評價
2、凍幹菌劑的製備
(1)菌體濃縮條件的確定：取上述發酵菌液50mL裝於滅菌的離心管中，以3500、5000、6500rpm轉速分別配以10、20min離心時間，考察不同離心參對菌體存活能力的影響，檢測在不同的離心條件下的離心損失率、離心存活率，從而選取最佳的離心條件，減少菌體的損傷。離心前稱取管體總質量(m2)及離心去上清液後管體總質量(m1)，計算每管獲得菌泥質量。菌種計數採用平板稀釋塗布法進行計數。計算公式如下：
離心損失率(％)＝上清液活菌總數/發酵液活菌總數×100
離心存活率(％)＝菌泥活菌總數/(發酵液活菌總數-上清液活菌總數)×100
如圖2所示，相同轉速下，隨著離心時間的增加，離心損失率下降，離心存活率也隨之下降，說明雖然增加離心時間可以減少菌體隨上清液的流失，但是對菌體活性的活性也造成了相應的危害。相較離心損失率而言，不同離心時間對菌體存活率影響較大。從經濟角度應選擇較小離心力和較短離心時間，因此選取5000rpm，10min離心參數，來保證最佳的離心存活率，此時菌體存活率為80.7％。每組實驗設三個重複取平均值。同時經測三次定取平均值後得知，離心每50mL發酵液獲菌泥的平均質量為3.8g。
(2)真空冷凍乾燥方法及不同保護劑對冷凍乾燥保護效果的影響
將Microbacterium sp.J-1濃縮菌液放入到低溫冷凍冰箱中進行預凍，凍結完全和形成小冰晶後將預凍好的菌液放入冷阱溫度為-30℃的真空冷凍乾燥機內凍幹24h，收集凍幹菌體。
選取蔗糖、葡萄糖、澱粉、海藻糖、甘油作為單一凍幹保護劑，研究其在凍幹過程中對菌株Microbacterium sp.J-1的保護效果。其中，蔗糖、葡萄糖、澱粉、海藻糖和甘油的添加濃度分別為0.9、4.8、9.6mg保護劑/g溼菌，以添加等量水為對照。結果如圖3所示，為加入不同種類和濃度的凍幹保護劑後的菌株Microbacterium sp.J-1凍幹存活率。結果顯示菌株的存活率在加入保護劑後均有不同程度的提高，保護劑均對菌株有一定的保護作用。在試驗的保護劑中，葡萄糖保護效果最為顯著，凍幹保護率達77.6％。另外，蔗糖、海藻糖和澱粉等也對Microbacterium sp.J-1具有良好的保護效果。
(3)凍幹菌劑的復水
復水是凍幹細胞復甦重要的一個步驟，復甦所用的溶劑以及復甦條件都會影響最後的菌體存活率。一般採用最適合該菌生長的培養液或生理鹽水作為復水介質進行復水。由於用於一般灌溉用水中存在Ca2+、Mg2+等金屬離子，可以滿足細胞復水需要。取等量的凍幹菌劑分別加入自來水、灌溉河水、生理鹽水稀釋到凍幹前原有體積後，放置1h，測定復甦後菌體存活率，實驗重複三次取平均值。結果顯示，經復水後，在自來水、灌溉河水、生理鹽水中凍幹菌劑的存活率分別為87.5％、89.4.53％、89.7％。可見，不同水質用於凍幹菌劑的復水，菌體存活率相差不大。
實施例2
Microbacterium sp.J-1菌劑對汙染土壤中DEHP降解效果和種植菜心體內DEHP含量影響的實驗
1、供試土壤製備與種植蔬菜選擇：土壤為華南農業大學農場水稻土，風乾後過60目篩，pH為6.7，向其中添加DEHP達到50mg/kg，並加雙蒸水調至田間持水量(約30％)，避光老化15天。我們前期研究顯示菜心(Brassica parachinensis L.)品種華冠油青具有高累積DEHP的特性，給食品安全和人體健康帶來嚴重威脅。
2、實驗處理：共設置四個處理：空白汙染土壤(CK)、接菌的汙染土壤(接種菌株)、種植菜心汙染土壤(種植菜心)、同時接菌和種植菜心的汙染土壤(種植菜心+接種菌株)。採用溫室盆栽方法，每個陶盆裝4kg汙染土壤，添加6g的化肥。菜心經育苗至3～4片真葉後，移栽到盆內，每盆5棵。菌劑按每盆10mg/盆量經復水後滴灌於汙染土壤或菜心根際土壤中，每隔3天滴灌一次，共滴灌3次。每個處理設置三個重複，隨機排列。溫室溫度為25～32℃，澆灌自來水維持土壤自然溼度，共培育45天。分別於接菌後1、7、14、21、28和35收集四個處理的土樣，儲存於-80度冰箱待檢測DEHP含量；於接菌後35天收穫菜心，洗淨擦乾後分別稱重地上部和根，然後凍幹保存於-20度冰箱，待檢測DEHP含量。
3、土壤與菜心樣品抽提：稱取1g風乾磨碎的土壤或菜心樣品於35mL玻璃離心管中，加入20mL的二氯甲烷並超聲萃取10min，然後經3500rpm離心收集上清液。土樣沉澱中再加入20mL的二氯甲烷相同方法超聲萃取3次，合併上清液。然後經旋轉蒸發濃縮上清液，用二氯甲烷超聲清洗後過柱子(1.0cm×35cm，填料自上而下為無水Na2SO4，矽膠和氧化鋁)，用雞心瓶收集濾液經N2吹乾後，用色譜純二氯甲烷重新溶解並定容至1mL，待GC/MS測定。
4、樣品檢測：採用島津公司QP2010Plus型GC/MS串聯質譜儀。色譜柱為安捷倫HP-5柱子(0.25μm×0.25mm×30m)，進樣溫度為250℃，離子源(EI)溫度為220℃，採用不分流進樣1μL，載氣為高純氦氣。升溫程序為：初始溫度為100℃，保持2min，15℃/min梯度上升至129℃，然後以40℃/min升溫至280℃，保持5min。
質量控制：採用外標法和六點校正標準物質製作標準曲線。土壤樣品中DEHP回收率為92.0％～96.5％，菜心樣品中DEHP回收率為87.4％～107.2％。
5、結果與分析：如圖4a所示，在接種後35天，對照處理(CK)土壤中僅有12％的DEHP去除率，而接種菌株、種植菜心和以上兩種同時處理(種植菜心+接種菌株)的土壤中DEHP含量去除率分別為88％、62％和97％，這表明接種菌株和種植菜心均能顯著促進土壤中DEHP的消除，而且菌株和菜心同時處理去除DEHP效率更高。
另外，如圖4b所示，與未接菌的菜心相比，接種菌株J-1能夠顯著降低(p0.05)影響。在接種後最初的第7天，接種菌株的土壤(59～69％降解率)中DEHP去除率遠高於僅種植菜心土壤(僅4％降解率)，這說明接種菜心體內DEHP低含量可能是由於菌株J-1對土壤中DEHP較高的降解效率。
為了檢測接種菌株J-1在土壤中的存活能力，利用PCR-DGGE方法檢測菌株DNA條帶變化。如圖4所示，在接種菌株J-1的土壤中，第7天和21天條帶較清晰，但是在第35天條帶最終消失(條帶4～6)，說明菌株J-1在土壤中無法長期存活，可能由於土壤中DEHP等碳源耗盡導致菌群數量減少。然而，當菌株接種於菜心根際，其DNA條帶在第35天仍然存在(條帶10～12)，說明菜心種植有利於菌株J-1的存活，可能是由於菜心根系環境為菌株J-1提供了可利用的有機質，使接種的菌株可以長期存活於菜心根際土壤中。
實施例3
一種修復DEHP汙染土壤同時降低汙染土壤種植蔬菜中DEHP含量的方法，包括如下步驟：
(1)將Microbacterium sp.J-1菌株活化後進行發酵培養，發酵的溫度為30℃，pH為8.0，接種量OD600＝0.7；
(2)步驟(1)得到的發酵液在5000rpm的轉速下離心10min，收集菌體，按照6mg葡萄糖/g菌體的加入量，向菌體中加入葡萄糖後放入低溫冷凍冰箱中進行預凍，凍結完全和形成小冰晶後將預凍好的菌液放入冷阱溫度為-30℃的真空冷凍乾燥機內凍幹24h，收集凍幹菌體。
(3)DEHP汙染土壤中栽種菜心後，在菜心根系周圍接種凍幹菌劑。凍幹菌劑的加入量為按照2.5mg凍幹菌劑/g汙染土壤的量。凍幹菌劑接種之前先用生理鹽水復水1h。
實施例4
一種修復DEHP汙染土壤同時降低汙染土壤種植蔬菜中DEHP含量的方法，包括如下步驟：
(1)將Microbacterium sp.J-1菌株活化後進行發酵培養，發酵的溫度為32℃，pH為8.3，接種量OD600＝0.8；
(2)步驟(1)得到的發酵液在4500rpm的轉速下離心10min，收集菌體，按照9mg蔗糖/g菌體的加入量，向菌體中加入蔗糖後放入低溫冷凍冰箱中進行預凍，凍結完全和形成小冰晶後將預凍好的菌液放入冷阱溫度為-30℃的真空冷凍乾燥機內凍幹24h，收集凍幹菌體。
(3)DEHP汙染土壤中栽種菜心後，在菜心根系周圍接種凍幹菌劑。凍幹菌劑的加入量為按照2mg凍幹菌劑/g汙染土壤的量。凍幹菌劑接種之前先用自來水復水1h。