規模化原核和真核細胞體內抗體和抗原文庫構建及篩選的製作方法
2023-06-01 06:03:26 2
專利名稱：規模化原核和真核細胞體內抗體和抗原文庫構建及篩選的製作方法
技術領域：
本發明涉及基因組學、蛋白組學、分子生物學、免疫學、細胞生物學、抗體工程、基因工程以及臨床醫學如疾病治療和診斷等領域，具體地，本發明涉及在原核細胞和真核細胞如大腸桿菌和酵母體內構建了規模化抗體和抗原文庫，以抗原-抗體相互作用為基本原理，進行大規模篩選高特異性、高親和力抗體篩選方法。
2.構建適於規模化抗體篩選的高豐度、高多樣性的原核細胞和真核細胞體內抗原文庫，包括以下步驟(1)從所研究生物包括人類和其他生物的器官、組織、細胞(包括細胞株)、血液、細胞成分等抽提RNA。(2)RNA可用多種方法處理，以獲得大量不同基因開放閱讀框架(ORF)中的編碼抗原表位的cDNA。但不限於以下方法。處理方法包括a.RNA逆轉錄後，超聲波隨機將打斷成長度100-1000鹼基對(bp)的cDNA；b.以RNA為模板，利用混合的5』和3』端隨機引物或僅5』端為隨機引物，多聚酶鏈反應(PCR)擴增RNA，取長度為100-1000bp的擴增產物；c.先利用RNA帽狀結構設計PCR引物或抗體富集含有全長cDNA，而後用以上方法處理；d.根據研究需要，利用保守序列設計非隨機引物和PCR擴增特定基因家族或含有特定功能結構域(domain)和模體(motif)的基因。(3)用限制性內切酶、連接酶等和/或同源重組等分子生物學和遺傳學的方法，將上一步驟獲得的不同長度cDNA插入特殊的重組質粒，並與重組質粒中特殊編碼基因如特殊蛋白編碼基因如λcl蛋白或者腺苷酸環化酶的部分序列或者或者lexA等其他能與DNA結合的功能結構域形成融合蛋白，從而形成質粒抗原文庫。
3.原核細胞和真核細胞內大規模篩選抗體所利用的質粒具有重要特徵(1)裝載抗原cDNA文庫的質粒除含有一般質粒共有特徵外，還含有編碼特殊蛋白基因如編碼λcl蛋白基因、Gal4和lexA的DNA結合的功能結構域能等，這些基因能與抗原基因形成融合基因；(2)裝載抗體cDNA文庫的質粒含有一般質粒共有特徵外，也含有編碼特殊蛋白的基因如RNA多聚酶α亞單位、Gal4和VP16基因的轉錄活化結構域產物等，這些基因能與抗體可變區形成融合基因；(3)在抗原-抗體相互作用時，裝載抗原質粒所編碼特殊蛋白能與裝載抗體cDNA文庫的質粒所編碼的特殊蛋白如λcl蛋白和RNA多聚酶α亞單位、Gal4 DNA結合的功能結構域和轉錄活化結構域、DNA結合的功能結構域與VP16基因的轉錄活化結構域，形成完成轉錄因子樣作用，結合啟動子(promoter)啟動報導基因轉錄或形成完整蛋白如腺苷酸環化酶，引起相應報導基因轉錄；(4)宿主菌或酵母含有所含有的報導基因可以是耐抗生素基因，也可以是起顏色反應的基因如β-半乳糖苷酶等，可以含有胺基酸合成酶等，可以多個報導基因合用。
4.在原核細胞和真核細胞內規模化篩選特異性抗體的方法，包括以下步驟(1)將按方法2所構建的抗原文庫與方法1所構建抗體文庫按一定比例混合如抗原質粒數是抗體質粒數105-109倍；(2)加入含有報導基因的感受態大腸桿菌或酵母進行共轉化；(3)將從步驟(2)所得的大腸桿菌鋪在含有抗生素和能與β-半乳糖苷酶起化學反應呈現顏色的試劑X-gal的細菌培養平板，孵育過夜；或者所獲得的酵母在營養缺陷的X-gal培養平板，孵育過夜；(4)能在培養平板生長並有顏色反應的是陽性(細菌或酵母)克隆，含有抗原基因和相應的抗體或抗體片段如scFv、Fv和Fab等。顏色反應的強度與抗原-抗體間的親和力成正相關。(5)從步驟(4)獲得的含抗原和侯選抗體的質粒可以通過再次共轉化至上述感受態大腸桿菌或酵母，觀察生長和顏色反應證實其特異性。(6)所獲得的陽性克隆，可以通過多聚酶鏈反應(PCR)分別擴增抗原cDNA和抗體可變區，DNA測序後分析抗原基因和抗體順序。
5.在原核細胞和真核細胞內規模化篩選特異性抗體可用另一方法，包括以下步驟(1)對抗原cDNA文庫進行大規模DNA測序，分析抗原順序是否與裝載抗原質粒所含有的編碼特殊蛋白基因如編碼λcl蛋白基因、Gal4和lexA的DNA結合的功能結構域能等形成融合基因；(2)對能形成融合基因的抗原克隆篩選抗體文庫。將抗原質粒按一定排序如96孔或384孔陣列，加入抗體文庫混合；(3)加入含有報導基因的感受態大腸桿菌或酵母進行共轉化；(4)將從步驟(2)所得的大腸桿菌鋪在含有抗生素和能與β-半乳糖苷酶起化學反應呈現顏色的試劑X-gal的細菌培養平板，孵育過夜；或者所獲得的酵母在營養缺陷的X-gal培養平板，孵育過夜；(5)能在培養平板生長並有顏色反應的是陽性(細菌或酵母)克隆，含有抗原基因和相應的抗體或抗體片段如scFv、Fv和Fab等。顏色反應的強度與抗原-抗體間的親和力成正相關。(6)從步驟(5)獲得的含抗原和侯選抗體的質粒可以通過再次共轉化至上述感受態大腸桿菌或酵母，觀察生長和顏色反應證實其特異性；(7)所獲得的陽性克隆，可以通過多聚酶鏈反應擴增抗體可變區，DNA測序後分析抗原基因和抗體順序。
大規模篩選特異性抗體在原核細胞和真核細胞，主要指大腸桿菌和酵母，但不限於大腸桿菌和酵母；本發明所使用的質粒是用於原核細胞即細菌雙雜交的質粒或用於酵母雙雜交的質粒，這種質粒除含有一般質粒共有蛋白編碼基因外，還含有特殊蛋白編碼基因如λcl蛋白或者腺苷酸環化酶的部分序列，但不限於上述λcl蛋白或者腺苷酸環化酶的部分序列(細菌雙雜交)；或者用於酵母雙雜交質粒含有的特殊蛋白編碼基因如Gal4和lexA等，但不限於上述Gal4和lexA。在篩選抗體前，不需要純化抗原，僅需要含有抗原表位的基因DNA順序，這些抗原順序可隨機或可操作地將抗原基因的全部或部分開放閱讀框架(open readingframe，ORF)與特殊蛋白編碼基因形成融合基因。本發明所述裝載抗原基因的質粒可稱為「誘餌質粒」；「可操作地」指使用基因工程方法構建重組質粒；「融合基因」指特殊蛋白編碼基因如λcl蛋白或者腺苷酸環化酶或者Gal4或者lexA的部分序列與抗原基因形成一個完整閱讀框架，連續轉錄和翻譯，所形成的蛋白既含有特殊蛋白如λcl蛋白或者部分腺苷酸環化酶或者Gal4或者lexA又含有抗原蛋白。本發明所用質粒可以互換使用，如上述用於裝載抗體文庫的質粒也可以用於裝載抗原文庫，而原來配對使用的裝載抗原質粒可以用於裝載抗體文庫，互換使用適用於原核細胞和真核細胞雙雜交。本發明的規模化篩選特異性抗體的方法能最佳地與本發明的多種屬、高滴度、高豐度、高多樣性的抗體文庫聯用，但不限於二者聯用。該方法與其他已知的方法如噬菌體展示、小鼠免疫等技術比較具有快速、簡便、高通量等特點。
本發明還提供了上述載體轉化的宿主細胞。該宿主細胞是原核生物即大腸桿菌或真核細胞酵母，該宿主含有多個報導基因和調控元件，也可以是營養缺陷的菌株。報導基因是耐抗生素藥基因包括抗青黴素、氨苄青黴素、羧苄青黴素等以及β-半乳糖苷酶、特殊胺基酸合成酶等。調控元件含有與上述質粒中含有的特定蛋白如λcl蛋白、Gal4、LexA結合的DNA元件，或者含有能與活性蛋白酶如腺苷酸環化酶底物產物cAMP作用的元件。
在本發明所產生的人類抗體文庫，含有天然或人工合成或半人工合成的高滴度、高豐度、高多樣性的單鏈抗體片段(scFv)、Fv和Fab。這些天然的抗體和抗體片段來自未免疫的人類胎兒、健康成人以及不同疾病患者的外周血、淋巴結、脾臟、骨髓、肝臟等免疫相關組織、細胞等。不同疾病包括傳染病、腫瘤、白血病、免疫相關疾病、心腦血管疾病等；這些抗體和抗體片段也來自完全人工合成和半人工合成抗體片段。本發明所產生的人類抗體文庫可用於獲得高特異性、高親和力抗體，所獲得的抗體用於多種疾病的診斷和治療，也用於科學研究包括基因組學、蛋白組學、分子生物學、細胞生物學等研究。
在本發明所產生的小鼠、大鼠、兔等脊椎動物抗體文庫，含有天然或人工合成或半人工合成的高滴度、高豐度、高多樣性的單鏈抗體片段(scFv)、Fv和Fab。這些抗體和抗體片段是天然的，來自未免疫和抗原免疫後的胚胎、幼年、成年小鼠、大鼠、兔等脊椎動物的外周血、淋巴結、脾臟、骨髓等免疫相關組織、細胞等。這些抗體和抗體片段也來自完全人工合成和半人工合成抗體片段。本發明所產生的小鼠、大鼠、兔等脊椎動物抗體文庫可用於獲得高特異性、高親和力抗體，所獲得的抗體用於多種疾病動物模型的治療實驗，也用於科學研究包括基因組學、蛋白組學、分子生物學、細胞生物學等研究。
在本發明所產生的人類抗原文庫，其抗原人類胎兒、健康成人以及不同疾病患者的外周血、淋巴結、脾臟、骨髓、肝臟等所有器官、組織、細胞等。也可以源自人類的所有細胞株、細胞、組織等。本發明所涉及的抗原也可以來自所有生物種屬包括所有真核生物、原核生物、病毒等的抗原。抗原包括所有生物的基因，可以是分泌蛋白、膜蛋白、胞漿蛋白、細胞器蛋白、核內蛋白等。抗原基因不需表達純化，所構建的抗原基因可以是全長或部分開放閱讀框架(ORF)，但要含有抗原表位。插入抗原基因須與誘餌質粒中的特殊蛋白編碼基因如DNA結合的蛋白或者腺苷酸環化酶的部分序列形成融合基因。
本發明提供了大規模高通量篩選高特異性、高親和力的天然的、人工合成和半人工合成的抗體手段。大規模高通量指適用於流水線、自動化操作，每次篩選可達10-10000個抗原篩選。在本發明所產生抗體是高特異性、高親和力的天然的、人工合成和半人工合成的抗體；抗體種類包括抗體片段如單鏈抗體(scFv)、Fv和Fab和完整抗體；抗體種屬是人類、小鼠、大鼠、兔等脊椎動物和非脊椎動物；抗體針對所有生物基因產物蛋白。
規模化原核細胞和真核細胞體內抗體的篩選及其用途(1)生命科學研究是現有單克隆抗體和多克隆抗體應用領域的替代抗體或補充抗體並有新的用途。
A.分子生物學研究可用於基因功能研究如Western印記、免疫沉澱、免疫吸附、蛋白修飾狀態等。
B.免疫學研究用於研究細胞免疫、體液免疫等；C.細胞生物學研究用於研究細胞增殖、分化、凋亡、細胞信號傳導過程等；可用於免疫組織細胞學等、可用於流式細胞儀等多種檢測儀器。
D.基因組學包括功能基因組學、蛋白組學等這是本發明最突出的優點之一。可以用於相關技術如抗體晶片、抗體陣列製備等，也可用於蛋白相互作用圖譜研究。
E.動物實驗可用於個別基因功能研究，也可用於大規模基因功能研究和疾病診斷和治療研究等。
F.所獲得的抗體可用來發現其抗原的抑制劑、拮抗劑或受體等。
(2)抗體工程和基因工程A.所獲得的抗體包括抗體片段如單鏈抗體(scFv)、Fv和Fab和完整抗體可以直接在原核細胞(大腸桿菌)、真核細胞(酵母)、哺乳動物細胞(如CHO細胞)、昆蟲細胞、植物細胞表達；可以利用現有技術純化。可以直接生產。
B.所獲得的抗體包括抗體片段如單鏈抗體(scFv)、Fv和Fab和完整抗體可以經抗體工程和基因工程加工衍生出多種類型抗體如雙鏈抗體(dsFv)、多鏈抗體、多功能抗體等組合，提高特異性、親和力，功能特化或多樣化等。
C.在本發明中所獲得的抗體基因可選用本領域已知的各種載體，如市售的載體，包括質粒，粘粒等。可以將抗體編碼序列可操作地連於表達調控序列，從而形成抗體表達載體。
(3)臨床疾病診斷是現有用於臨床疾病診斷的單克隆抗體和多克隆抗體的替代抗體或補充抗體，並有新的用途。
A.所獲得的抗體可用於現有所有免疫診斷方法包括免疫組織病理學、免疫細胞學、免疫血清學等檢查。可用於流式細胞儀等多種檢測儀器。
B.所獲得的高特異性、高親和力人類抗體，適用於多種疾病如腫瘤、白血病、心腦血管疾病、免疫相關疾病等患者的體內診斷。人類抗體是安全的、副作用較少，可以連接同位素用於體內診斷。
C.所獲得的抗體拓展了免疫診斷疾病的範圍。
D.所獲得的大量抗體可以製成抗體晶片用於疾病診斷。
(4)臨床疾病治療是現有用於臨床疾病治療的小鼠抗體、嵌合抗體和人源化抗體的替代抗體或補充抗體，並有新的應用範圍。
A.傳染性和感染性疾病治療病原包括病毒、立克次體、細菌、寄生蟲等，本發明所獲得的針對性高特異性、高親和力抗體、可以直接中和病原或次級蛋白產物，可以引導、刺激宿主的特異性的細胞免疫、體液免疫和非特異性的免疫系統消滅病原。本發明所獲得可以單獨使用或與其他藥物合用。
B.腫瘤和白血病治療本發明所獲得的針對腫瘤和白血病的特異或相對特異性抗原的高特異性、高親和力抗體，或者所衍生的攜帶免疫毒素、同位素等的抗體，可以引導、刺激宿主的特異性的細胞免疫、體液免疫和非特異性的免疫系統消滅腫瘤和白血病細胞；或者幹擾腫瘤和白血病細胞增殖過程；或者引起腫瘤和白血病細胞壞死、凋亡或分化。本發明所獲得可以用於原發性腫瘤、轉移性腫瘤；可以單獨使用或與其他藥物合用。
C.免疫相關疾病治療免疫相關疾病包括過敏如哮喘、結締組織疾病如系統性紅瘢狼瘡、硬皮病以及有免疫機制介入的疾病。本發明所獲得抗體可以通過調節機體的特異性的細胞免疫、體液免疫和非特異性的免疫系統治療免疫相關疾病。本發明所獲得抗體可以單獨使用或與其他藥物合用。
D.心腦血管疾病和血液病治療這裡心腦血管疾病和血液病主要是指由於血栓形成所引起的疾病，本發明所獲得抗體可以通過調節機體的血栓形成機制治療心腦血管疾病和血液病。本發明所獲得抗體可以單獨使用或與其他藥物合用。
E.其他疾病除上述疾病外，還可以用本發明所獲得抗體開發治療其他疾病。本發明所獲得抗體可以單獨使用或與其他藥物合用。
通常，所獲得抗體可配製於無毒的、惰性的和藥學上可接受的水性介質載體中，這類載體包括(但並不限於)鹽水、緩衝液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。pH通常為約5-8，較佳地pH約為6-8，儘管pH值可隨被配製物質的性質以及待治療的病症而有所變化。配製好的藥物組合物可以通過常規途徑進行給藥，其中包括(但並不限於)肌內、腹膜內、皮下、皮內、或局部給藥。藥物製劑應與給藥方式相匹配，也可以是片劑和膠囊等。治療性製劑均在無菌條件下或特殊條件下製備。
具體實施例方式
實施例1實施舉例1是為進一步闡述本發明。應理解，這些舉例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍(以下各實施例同)。適於規模化抗體篩選的原核細胞或者真核細胞體內抗體文庫構建方法，包括以下步驟(1)取生物的外周血、淋巴結、脾臟、骨髓、肝臟等免疫相關組織、細胞；(2)從所取的組織、細胞中分離RNA，並逆轉錄獲得cDNA；(3)分別設計針對免疫球蛋白重鏈可變區、輕鏈可變區和第三恆定區的DNA引物，在獲得的cDNA中擴增免疫球蛋白重鏈可變區、輕鏈可變區和第三恆定區；(4)用限制性內切酶、連接酶等和/或同源重組的分子生物學和遺傳學的方法，將上一步驟獲得的免疫球蛋白重鏈可變區、輕鏈可變區和Fab插入特殊的重組質粒，並與重組質粒中特殊編碼基因如RNA多聚酶α亞單位或者腺苷酸環化酶的部分序列形成融合蛋白，從而形成質粒抗體文庫。
實施例2構建適於規模化抗體篩選的高豐度、高多樣性的原核細胞和真核細胞體內抗原文庫，包括以下步驟(1)從所研究生物的器官、組織、細胞(包括細胞株)、血液、細胞成分等抽提RNA。(2)RNA可用多種方法處理，處理方法包括a.RNA逆轉錄後，超聲波隨機將打斷成長度500bp的cDNA；b.以RNA為模板，利用混合的多對5』端為隨機引物，多聚酶鏈反應(PCR)擴增RNA，取長度為500bp的擴增產物；c.先利用RNA帽狀結構設計PCR引物或抗體富集含有全長cDNA，而後用以上方法處理；d.根據研究需要，利用保守序列設計非隨機引物和PCR擴增特定基因家族或含有特定功能結構域(domain)和模體(motif)的基因如鋅指蛋白家族、激酶家族、跨膜蛋白等。(3)用限制性內切酶、連接酶等和/或同源重組等分子生物學和遺傳學的方法，將上一步驟獲得的不同長度cDNA插入特殊的重組質粒，並與重組質粒中特殊編碼基因如特殊蛋白編碼基因如λcl蛋白或者腺苷酸環化酶的部分序列或者或者lexA等其他能與DNA結合的功能結構域形成融合蛋白，從而形成質粒抗原文庫。
實施例3在原核細胞和真核細胞內規模化篩選特異性抗體的方法，包括以下步驟(1)將所構建的抗原文庫與所構建抗體文庫按一定比例混合如抗原質粒數是抗體質粒數109倍；(2)加入含有報導基因的感受態大腸桿菌或酵母進行共轉化；(3)將從步驟(2)所得的大腸桿菌鋪在含有抗生素和能與β-半乳糖苷酶起化學反應呈現顏色的試劑X-gal的細菌培養平板，孵育過夜；或者所獲得的酵母在營養缺陷的X-gal培養平板，孵育過夜；(4)能在培養平板生長並有顏色反應的是陽性(細菌或酵母)克隆，含有抗原基因和相應的抗體或抗體片段如scFv、Fv和Fab等。顏色反應的強度與抗原-抗體間的親和力成正相關。(5)從步驟(4)獲得的含抗原和侯選抗體的質粒可以通過再次共轉化至上述感受態大腸桿菌或酵母，觀察生長和顏色反應證實其特異性。(6)所獲得的陽性克隆，可以通過多聚酶鏈反應(PCR)分別擴增抗原cDNA和抗體可變區，DNA測序後分析抗原基因和抗體順序。
實施例4抗體表達、抗體晶片的製備及其應用，包括以下步驟(1)大規模抗體表達可以利用原有質粒在大腸桿菌中進行，也可以將抗體基因經PCR擴增後，利用本領域已知的各種載體在原核細胞(大腸桿菌)、真核細胞(酵母)、哺乳動物細胞(如CHO細胞)、昆蟲細胞、植物細胞表達、純化；(2)抗體晶片或抗體陣列製備將所獲得的抗體(含有標籤蛋白如c-myc、his等)包被在96孔或384孔塑料板或者玻璃片或者矽片或者其他載體上，載體須經相應表面處理；(3)應用a.抗原分離利用抗原抗體反應分離將要研究的蛋白；b.特定細胞分離將表達特定抗原的細胞分離；c.靶蛋白信號傳導途徑研究利用抗體與抗原結合特性分離抗原蛋白複合體，利用質譜儀分析其組成，推測其信號途徑。
權利要求
1.規模化原核和真核細胞體內抗體和抗原文庫構建及篩選，包括原核細胞體內抗體文庫的構建和篩選，其特徵在於在原核細胞和真核細胞體內構建適於規模化抗體篩選的多種屬、高滴度、高豐度、高多樣性抗體和抗體片段文庫以及抗原基因文庫，並進行規模化原核細胞和真核細胞體內抗體篩選。
2.根據權利要求1所述的規模化原核和真核細胞體內抗體和抗原文庫構建及篩選，其特徵在於，在原核細胞體內，主要指大腸桿菌體內，但不限於大腸桿菌；在真核細胞體內，主要指酵母，但不限於酵母；抗體文庫中的抗體來自人類、大鼠、小鼠、兔等脊椎動物，但不限於脊椎動物；抗體文庫可以是天然、人工合成和半人工合成的抗體文庫；文庫中的抗體可以是完整抗體和抗體片段包括單鏈抗體(scFv)、Fv和Fab等；抗原文庫中的抗原基因可以來自包括人類等所有生物的cDNA，抗原可以是完整的，也可以是部分cDNA，但編碼抗原表位；抗原不要表達、純化。
3.根據權利要求1所述的規模化原核和真核細胞體內抗體和抗原文庫構建及篩選，其特徵在於，用於構建抗體和抗原文庫的重組質粒可以用於原核細胞即大腸桿菌雙雜交體系或者真核細胞即酵母雙雜交；所用的質粒含有特殊蛋白編碼基因如λcl蛋白或者腺苷酸環化酶的部分序列，但不限於上述λcl蛋白或者腺苷酸環化酶的部分序列(細菌雙雜交)；或者用於酵母雙雜交質粒含有的特殊蛋白編碼基因如Gal4和lexA等，但不限於上述Gal4和lexA；相應的在抗原-抗體相互作用時可以啟動宿主菌的報導基因；用於構建抗體文庫和抗原文庫的質粒可以互換使用。
4.根據權利要求1所述的規模化原核和真核細胞體內抗體和抗原文庫構建及篩選，其特徵在於，抗體文庫構建包括以下步驟(1)用所研究生物包括人類含有蛋白質抗原的器官、組織、細胞(包括細胞株)、血液、細胞成分等免疫動物如小鼠、兔脊椎動物等，這些生物材料可以是細胞懸液、細胞成分如細胞膜、細胞核、細胞器等、蛋白抽提液等，可以用一種生物材料，也可以用多種生物材料混合使用，也可以不免疫；(2)取生物包括人類的外周血、淋巴結、脾臟、骨髓、肝臟等免疫相關組織、細胞；(3)從所取的組織、細胞中分離RNA，並逆轉錄獲得cDNA；(4)分別設計針對免疫球蛋白重鏈可變區、輕鏈可變區和第三恆定區的DNA引物，在獲得的cDNA中擴增免疫球蛋白重鏈可變區、輕鏈可變區和第三恆定區；(5)用限制性內切酶、連接酶等和/或同源重組的分子生物學和遺傳學的方法，將上一步驟獲得的免疫球蛋白重鏈可變區、輕鏈可變區和Fab插入特殊的重組質粒，並與重組質粒中特殊編碼基因如RNA多聚酶α亞單位或者腺苷酸環化酶的部分序列或者Gal4或者其他蛋白質轉錄活化功能結構域形成融合蛋白，從而形成質粒抗體文庫；抗體或抗體片段指完整抗體即帶有完成重鏈、輕鏈的恆定區和可變區，也指抗體中的一部分包括重鏈、輕鏈的可變區，可變區中的互補決定區(CDRs)和恆定區的一部分，可指單鏈抗體(single chain Fv，scFv)、可變區(Fv)抗體和免疫球蛋白Fab抗體，但不限於單鏈抗體(scFv)、可變區(Fv)抗體和免疫球蛋白Fab抗體。
5.根據權利要求1所述的規模化原核和真核細胞體內抗體和抗原文庫構建及篩選，抗原文庫構建包括以下步驟(1)從所研究生物包括人類和其他所有生物的器官、組織、細胞(包括細胞株)、血液、細胞成分等抽提RNA；(2)RNA可用多種方法處理，以獲得大量不同基因開放閱讀框架(ORF)中的編碼抗原表位的cDNA，但不限於以下方法，處理方法包括a.RNA逆轉錄後，超聲波隨機將打斷成長度100-1000鹼基對(bp)的cDNA；b.以RNA為模板，利用混合的5』和3』端隨機引物或僅5』端為隨機引物，多聚酶鏈反應(PCR)擴增RNA，取長度為100-1000bp的擴增產物；c.先利用RNA帽狀結構設計PCR引物或抗體富集含有全長cDNA，而後用以上方法處理；d.根據研究需要，利用保守序列設計非隨機引物和PCR擴增特定基因家族或含有特定功能結構域(domain)和模體(motif)的基因；(3)用限制性內切酶、連接酶等和/或同源重組等分子生物學和遺傳學的方法，將上一步驟獲得的不同長度cDNA插入特殊的重組質粒，並與重組質粒中特殊編碼基因如特殊蛋白編碼基因如λcl蛋白或者腺苷酸環化酶的部分序列或者或者lexA等其他能與DNA結合的功能結構域形成融合蛋白，從而形成質粒抗原文庫。
6.根據權利要求1所述的規模化原核和真核細胞體內抗體和抗原文庫構建及篩選，其特徵在於，規模化篩選抗體包括以下步驟(1)將所構建的抗原文庫與所構建抗體文庫按一定比例混合如抗原質粒數是抗體質粒數105-109倍；(2)加入含有報導基因的感受態大腸桿菌或酵母進行共轉化；(3)將從步驟(2)所得的大腸桿菌鋪在含有抗生素和能與β-半乳糖苷酶起化學反應呈現顏色的試劑X-gal的細菌培養平板，孵育過夜；或者所獲得的酵母在營養缺陷的X-gal培養平板，孵育過夜；(4)能在培養平板生長並有顏色反應的是陽性(細菌或酵母)克隆，含有抗原基因和相應的抗體或抗體片段如scFv、Fv和Fab等，顏色反應的強度與抗原-抗體間的親和力成正相關；(5)從步驟(4)獲得的含抗原和侯選抗體的質粒可以通過再次共轉化至上述感受態大腸桿菌或酵母，觀察生長和顏色反應證實其特異性；(6)所獲得的陽性克隆，可以通過多聚酶鏈反應(PCR)分別擴增抗原cDNA和抗體可變區，DNA測序後分析抗原基因和抗體順序。
7.根據權利要求1所述的規模化原核和真核細胞體內抗體和抗原文庫構建及篩選，其特徵在於，規模化篩選抗體還可以通過以下步驟進行(1)對抗原cDNA文庫進行大規模DNA測序，分析抗原順序是否與裝載抗原質粒所含有的編碼特殊蛋白基因如編碼cl蛋白基因、Gal4和lexA的DNA結合的功能結構域能等形成融合基因；(2)對能形成融合基因的抗原克隆篩選抗體文庫。將抗原質粒按一定排序如96孔或384孔陣列，加入抗體文庫混合；(3)加入含有報導基因的感受態大腸桿菌或酵母進行共轉化；(4)將從步驟(2)所得的大腸桿菌鋪在含有抗生素和能與-半乳糖苷酶起化學反應呈現顏色的試劑X-gal的細菌培養平板，孵育過夜；或者所獲得的酵母在營養缺陷的X-gal培養平板，孵育過夜；(5)能在培養平板生長並有顏色反應的是陽性(細菌或酵母)克隆，含有抗原基因和相應的抗體或抗體片段如scFv、Fv和Fab等。顏色反應的強度與抗原-抗體間的親和力成正相關。(6)從步驟(5)獲得的含抗原和侯選抗體的質粒可以通過再次共轉化至上述感受態大腸桿菌或酵母，觀察生長和顏色反應證實其特異性；(7)所獲得的陽性克隆，可以通過多聚酶鏈反應擴增抗體可變區，DNA測序後分析抗原基因和抗體順序。
8.根據權利要求1所述的規模化原核和真核細胞體內抗體和抗原文庫構建及篩選的用途是通過篩選所獲得抗體和抗體片段可作為藥物用於臨床疾病診斷、治療，也可以用於生命科學研究及抗體工程和基因工程生產和改造。
全文摘要
本發明涉及在原核和真核細胞體內構建多種屬、高滴度、高豐度、高多樣性的抗體文庫和抗原文庫以及對抗體的規模化篩選和用途。解決了現有抗體製備方法包括噬菌體展示、免疫小鼠等不能大規模篩選抗體的缺陷，利用在原核和真核細胞增殖表達並能用於大腸桿菌雙雜交或酵母雙雜交的特殊重組質粒中構建適於規模化抗體篩選的高滴度、高豐度、高多樣性抗體和抗體片段文庫和抗原文庫。在篩選抗體前，不需要純化抗原，僅需要含有抗原表位的基因DNA順序，並將抗原基因的全部或部分開放閱讀框架可操作地、按一定機率與特殊蛋白編碼基因形成融合基因，從而進行大規模高特異性、高親和力抗體的篩選。本發明的用途是所獲得大量抗體和抗體片段可用於生命科學研究及抗體工程和基因工程生產和改造，也可以進一步基因工程改造作為藥物用於臨床疾病診斷、治療。
文檔編號G01N33/68GK1429916SQ0114572
公開日2003年7月16日 申請日期2001年12月30日 優先權日2001年12月30日
發明者韓澤廣, 劉鋒, 張新, 段煜 申請人:韓澤廣