頭孢菌素醯化酶突變體及其編碼基因與應用的製作方法

2023-06-01 01:25:06

專利名稱：頭孢菌素醯化酶突變體及其編碼基因與應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，尤其涉及一種頭孢菌素醯化酶突變體及其編碼基因與應用。
背景技術：
頭孢菌素類藥物(Cephalosporins)是一類重要的β _內醯胺類半合成廣譜抗生素。目前工業上採用發酵技術生產頭孢菌素C (Cephalosporin C，縮寫為CPC)，經過化學法裂解或酶法裂解，產生重要的中間體化合物7-氨基頭孢烷酸(7-aminoc印halospora-nic acid，縮寫為7-ACA)。再以7-氨基頭孢烷酸作為母核，與不同的側鏈縮合，得到半合成的 β -內醯胺類抗生素。目前化學法生產7-氨基頭孢烷酸因為造成環境汙染，已經逐漸被淘汰，取而代之的是利用酶法進行生產。酶法生產主要分為兩步酶法和一步酶法。兩步酶法首先利用D-胺基酸氧化酶(D-amino acid oxidase)，生成中間物戊二醯_7_氨基頭孢烷酸 (Glutaryl-7-aminocephalosporanic acid，縮寫為 G1-7ACA)，之後通過頭孢菌素醯化酶生成最終產物7-氨基頭孢烷酸。而一步酶法僅需頭孢菌素醯化酶就可以將頭孢菌素C直接轉化為7-氨基頭孢烷酸，優於兩步酶法。頭孢菌素醯化酶的主要底物為GL-7ACA，而對CPC活性較低。根據同源性，可以將其分為 5 類。2000 年，Kim 等人(Kim，Y.，et al.，The 2. 0 crystal structure of cephalosporin acylase. Structure, 2000. 8 (10) :p. 1059-1068.)解出第一個頭孢菌素醯化酶的晶體結構CAD。來源於假單胞菌O^seudomonas diminuta KAC-1)，屬於第一類的頭孢菌素醯化酶，此後CAD與底物GL-7ACA共結晶的結構和來源於I^seudomonas sp. GK16，同屬第一類的結構也相繼解出。晶體結構的出現為進一步認識和改造提供了條件。在五類醯化酶中，第三類催化頭孢菌素C的活性最高，為催化GL-7ACA活性的4% (Aramori, I.， et al. ， Comparative characterization of new glutaryl 7-ACA and cephalosporin C acylases. Journal of Fermentation and Bioengineering,1992. 73(3) :p. 185-192)。

發明內容
本發明的一個目的是提供一種頭孢菌素醯化酶突變體或其功能等效衍生物。本發明提供的頭孢菌素醯化酶突變體或其功能等效衍生物，其特徵在於將野生型頭孢菌素醯化酶的胺基酸序列進行如下至少一種胺基酸取代得到的蛋白1)自N末端第 296位(β亞基的57位)的組氨酸(H)被丙氨酸㈧所取代；2)自N末端第309位(β亞基的70位)的組氨酸(H)被纈氨酸⑴所取代；所述野生型頭孢菌素醯化酶的胺基酸序列為序列表中的序列1。本發明的另一個目的是提供的蛋白，為如下1)-3)中的任一一種1)序列表中序列4所示的胺基酸序列組成的蛋白；2)序列表中序列3所示的胺基酸序列組成的蛋白；3)將序列表中序列3或序列4的胺基酸殘基序列經過一個或幾個胺基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有頭孢菌素醯化酶功能的由1)衍生的蛋白。所述一個或幾個胺基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加為不超過10個胺基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。具體為；3)所示蛋白的胺基酸序列為序列表中的序列 8。所述頭孢菌素醯化酶突變體或其功能等效衍生物或所述蛋白的編碼基因也是本發明保護的範圍。所述的編碼基因為如下1)-5)中任一所述的DNA分子1)序列表中的序列6所示的DNA分子；2)序列表中的序列5所示的DNA分子；3)序列表中的序列7所示的DNA分子；4)在嚴格條件下可與1)或2)或3)限定的DNA序列雜交且編碼具有頭孢菌素醯化酶功能的蛋白的DNA分子；5)與1)或2)或3)限定的DNA序列具有90%以上的同源性且編碼具有頭孢菌素醯化酶功能的蛋白的DNA分子。上述嚴格條件可為在0. IX SSPE (或0. IX SSC)，0. SDS的溶液中，在65°C條件下雜交並洗膜。含有所述編碼基因的重組載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌也是本發明保護的範圍。所述重組載體為將所述頭孢菌素醯化酶突變體或其功能等效衍生物或所述蛋白的編碼基因插入pET30(a)的)(ba I和)(h0 I酶切位點間，得到表達所述頭孢菌素醯化酶突變體或其功能等效衍生物或所述的蛋白的載體，也可插入PET30 (a)的Nde I和)(h0 I酶切位點間，得到同樣的載體。所述重組菌為將所述的重組載體轉入宿主菌中，得到的重組菌，所述重組菌具體為大腸桿菌。所述頭孢菌素醯化酶突變體或其功能等效衍生物或所述的蛋白、所述編碼基因或所述的重組載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌在作為頭孢菌素醯化酶中的應用也是本發明保護的範圍。本發明的第三個目的是提供一種製備頭孢菌素醯化酶的方法。本發明提供的方法，包括如下步驟發酵所述的重組菌，收集發酵產物，即得到頭孢菌素醯化酶。所述頭孢菌素醯化酶突變體或其功能等效衍生物或所述的蛋白、所述編碼基因或所述的重組載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌在製備7-氨基頭孢烷酸中的應用也是本發明保護的範圍。本發明的實驗證明，本發明提供了野生型CPC醯化酶變體，通過HPLC結果表明本發明的野生型CPC醯化酶變體與野生型酶相比，對CPC的比活可提高6. 5倍。在一步法轉化中，在池內，轉化率達到98%。


圖1為重組質粒pET30a_CA的物理圖譜
圖2為突變株CA野生型，CA-113，CA-1C，陰性對照的SDS-PAGE電泳圖片圖3為突變株CA-IC催化底物CPC生成產物7-ACA的HPLC峰圖A為反應初始時體系的HPLC峰圖B為反應結束時體系的HPLC峰圖C為7-ACA的標準品HPLC峰4為突變株CA-IC催化底物CPC轉化率曲線
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。實施例1、頭孢菌素醯化酶突變體的獲得一、含有野生型頭孢菌素醯化酶CA的表達載體pET30 (a) -CA-WT通過 NCBI (www. ncbi.nlm.nih.gov/)查詢得到 Pseudomonas SE83 acyll 的頭孢菌素醯化酶的胺基酸序列(GenBank :AAA25690. 1，胺基酸序列為序列1)，採用重疊PCR的方法，合成適合於在E. coli中表達的頭孢菌素醯化酶基因的核苷酸序列。具體是將其全長的胺基酸序列在線輸入DNAworks程序(http//helixweb. nih. gov/dnaworks/)。通過設定密碼子偏愛性，DNAfforks輸出適合於在E. coli中表達的頭孢菌素醯化酶基因的核苷酸序列片段，每條長度約為45bp共78條相互重疊的寡核苷酸序列。將合成的寡聚核苷酸片段用IOmM Tris-HCl,pH 8. O的緩衝液溶解。PCR反應體系為在0. 5mlPCR薄壁管，加入無菌水 6. 3 μ 1、按照每條寡核苷酸片段終濃度25nm、10l·! 1 2 X GC bufferl、3. 2 μ 1四種核苷酸混合液(濃度為2. 5mM)，0. 5μ1 Takara公司的La-taq聚合酶，體系共20 μ 1。反應條件為， 先94V 2分鐘；然後94°C 1分鐘，63°C 1分鐘，72°C 5分鐘，共四個循環；最後72°C 10 分鐘。最後使用含有Nde I酶切位點的上遊引物CA-I :5，-GGGACACCATATGACCATGGCGGCGAAAACC-3，(帶下劃線鹼基為限制性內切酶 Nde I識別位點)和含有BamH I識別位點的下遊引物CA-2 5，-CTCGCGGGATCCTTACGCCGGCACCAGTTCCTG-3，(帶下劃線鹼基為限制性內切酶 BamH I識別位點)。PCR反應體系為在0. 5mlPCR薄壁管，依次加入2. 7 μ 1的無菌水、10 μ 1 2XGC buffer1,3. 2 μ 1四種核苷酸混合液(濃度為2. 5mM)、0· 8 μ 1 CA-I (濃度為20 μ Μ)、 0· 8 μ 1 CA-2 (濃度為 20 μ Μ)、2 μ 1 上述模板(濃度為 20ng/ μ L)、0· 5 μ 1 Takara 公司的 La-taq聚合酶。反應條件為，先94°C 2分鐘；然後94°C 1分鐘，61°C 1分鐘，72°C 5分鐘， 共四個循環；最後72°C 10分鐘。反應結束後，對PCR擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，PCR擴增出得到 MOObp左右正確大小的條帶，與預期結果相符。將上述PCR產物用限制性內切酶Nde I和BamH I進行雙酶切後與經同樣酶雙酶切的質粒pET30(a) (Novagen)進行連接，將連接產物化學轉化到大腸桿菌hcherichia coli BL2KDE3)感受態細胞，將轉化細胞塗布於添加有50 μ g/ml卡那黴素的LB平板上篩選陽性克隆，測序結果與野生型頭孢菌素醯化酶胺基酸序列相符。設計引物CA-His-rev 5' -CTCACGCTCGAGAGAAGCACCCGCCGGCACCAGTTCCTGG-3，(其中帶下劃線鹼基代表》ιοΙ位點，其後的9個鹼基編碼三個連接胺基酸Gly-Ala-Ser)。
提取陽性克隆的質粒作為模板，使用CA-I和CA-His-rev對構建的質粒進行擴增， 具體如下依次向0. 5ml薄壁PCR管中加入13. 5μ 1無菌水、25μ 1 2XGC bufferl、8yl 四種核苷酸混合液(濃度為2. 5mM)、1 μ 1 CA-I (濃度為20 μ Μ) U μ ICA-His-rev (濃度為 20 μ Μ)、1 μ 1模板(濃度為20ng/ μ L)、0· 5 μ 1 Takara公司的La-taq聚合酶。按照先94°C 2分鐘；然後94°C 1分鐘，61°C 1分鐘，72°C 5分鐘，共四個循環；最後72°C 10分鐘進行 PCR反應。將得到的PCR擴增產物進行1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到MOObp附近的大小的
條帶，與預期結果相符。將PCR產物用限制性內切酶Nde I和Bio I進行雙酶切後與經同樣酶雙酶切的質粒pET30(a)進行連接，將連接產物化學轉化到大腸杆coli BL21(DE3)感受態細胞，將轉化細胞塗布於添加有50μ g/ml卡那黴素的LB平板上篩選陽性克隆。將陽性克隆接種於含有50 μ g/ml卡那黴素的LB液體培養基中，37°C 250rpm過夜培養，提取質粒，送去測序，結果表明，該質粒含有PCR擴增產物，該PCR產物的基因具有序列表中序列2所示的核苷酸，該基因即為野生型頭孢菌素醯化酶(CA)的編碼基因 (GenBank :AAA25690. 1)，CA的胺基酸序列為序列表中的序列1。該質粒為將序列表中的序列2插入pET30 (a)的中Nde I和Bio I位點間得到的載體，該質粒命名為PET30 (a) -CA-His (pET30 (a) -CA,示意圖如圖1)。也可人工合成序列2作為模板，以CA-I和CA-His-rev作為引物進行PCR擴增， 再將該PCR產物經限制性內切酶Nde I和B10 I進行雙酶切後與經同樣酶雙酶切的質粒 pET30 (a)進行連接，得到 pET30 (a) -CA-His。二、構建頭孢菌素醯化酶(CA)的突變體CA-113及其突變株E. coli BL21 (DE3)/ CA-I13思路為從上述步驟一獲得的pET30 (a)-CA-His出發，利用重疊PCR的技術，在CA 野生型的基礎上，引入His β 57Ala突變。以上述步驟一獲得的pET30 (a) -CA-His為模板，首先用如下引物CA-For 5，-ACAATTCCCCTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGG-3』 (其中下劃線代表 Xba I 內切酶位點)和CA-β 57Lower 5，-GCCGTTATGCGCAAACGCCGGAAAGCCCGGCACGCCCGGCACGGTCAGGCCGATC (其中下劃線部分為突變引入位點)，進行PCR擴增，退火溫度66°C，擴增出突變His β 57Ala位點的上遊片段；再同樣以pET30 (a) -CA-His 為模板，使用 CA-Rev 5，-CTCACGCTCGAGAGAAGCACCCGCCGGCACCAGTTCCTGG-3，(其中下劃線代表 Xho I 內切酶識別位點)和CA-β57Upper :5』 -ATGATCGGCCTGACCGTGCCGGGCGTGCCGGGCTTTCCGGCGTTTGCGCATAACGG (其中下劃線部分為突變引入位點)，進行PCR擴增，退火溫度66 V，進行擴增，得到突變 Hisi3 57Ala位點的下遊片段；最後以上述得到的突變His β 57Ala位點的上遊片段和突變His β 57Ala位點的下遊片段為模板，加入CA-For和CA-Rev引物，在退火溫度為70°C的條件下進行擴增，得到 2400bp附近的PCR產物。
將上述獲得的PCR產物用限制性內切酶)(ba I和)(h0 I進行雙酶切後，與經同樣酶雙酶切的質粒pET30(a)進行連接，將連接產物化學轉化到大腸杆coli BL2KDE3)感受態細胞，將轉化細胞塗布於添加有50 μ g/ml卡那黴素的LB平板上篩選陽性克隆。將陽性克隆接種於含有50 μ g/ml卡那黴素的LB液體培養基中，37°C 250rpm過夜培養，提取質粒送去測序，結果表明，該質粒含有PCR擴增產物，該PCR產物的基因具有序列表中序列5所示的核苷酸，該基因命名CA-113，其編碼的蛋白命名為CA-113，其胺基酸序列為序列表中的序列3。該質粒為將序列表中的序列5插入pET30 (a)的中)(ba I和Bio I 位點間得到的載體，該質粒命名為pET30 (a) -CA-113。比對野生型CA和突變體CA-113的核苷酸和胺基酸序列如下突變體CA-113的核苷酸(序列5)為將野生型CA的核苷酸序列(序列2)的自5』 端第886-888位的CAT鹼基突變為GCG鹼基。突變體CA-113的胺基酸(序列3)為將野生型CA的核苷酸序列(序列1)的自N 末端第296位(β亞基的57位)的組氨酸(H)突變為丙氨酸㈧，記為Η296Α。也可人工合成序列5作為模板，以CA-I和CA-Rev引物，進行PCR擴增，再將該PCR 產物經限制性內切酶Nde I和Bio I進行雙酶切後與經同樣酶雙酶切的質粒pET30 (a)進行連接，得到 PET30 (a) -CA-113。含有pET30 (a) CA-113 的菌株命名為 Ε. coli BL21 (DE3)/CA-113，即為突變株。三、利用重疊PCR方法構建頭孢菌素醯化酶(CA)的突變體CA-IC及其突變株 E.coli BL21(DE3)/CA-IC思路為從上述步驟二獲得的CA-113所得質粒出發，利用重疊PCR的技術，在 CA-113的基礎上，引入His0 7OTyr突變。以步驟二得到的pET30(a)CA_113為模板，首先用CA-For(序列同步驟二)和 CA-β 70Lower :5，-AAACGCATAGGTCACGCAATACGCCACTT-3『(其中下劃線部分為突變引入位點)，進行PCR擴增，退火溫度60°C，擴增出突變His β 70Tyr位點的上遊片段；再同樣以pET30(a)-CA-113為模板，使用CA-Rev (序列同實施例2)和 CA-β 70Upper :5，-GCGTATTGCGTGACCTATGCGTTTATGGA-3『(其中下劃線部分為突變引入位點)，退火溫度60°C，進行擴增，得到突變His β 70Tyr位點的下遊片段；最後以上述得到的突變His β 70Tyr位點的上遊片段和突變His β 70Tyr位點的下遊片段為模板，加入CA-For和CA-Rev引物，在退火溫度為69°C的條件下進行擴增，得到 2400bp左右的PCR產物。將上述獲得的PCR產物用限制性內切酶)(ba I和)(h0 I進行雙酶切後，與經同樣酶雙酶切的質粒pET30(a)進行連接，將連接產物化學轉化到大腸杆coli BL2KDE3)感受態細胞，將轉化細胞塗布於添加有50 μ g/ml卡那黴素的LB平板上篩選陽性克隆。將陽性克隆接種於含有50 μ g/ml卡那黴素的LB液體培養基中，37°C 250rpm過夜培養，提取質粒送去測序，結果表明，該質粒含有PCR擴增產物，該PCR產物的基因具有序列表中序列6所示的核苷酸，該基因命名CA-1C，其編碼的蛋白命名為CA-1C，其胺基酸序列為序列表中的序列4。該質粒為將序列表中的序列6插入pET30 (a)的中)(ba I和Bio I位點間得到的載體，該質粒命名為PET30 (a) -CA-IC0比對野生型CA和突變體CA-IC的核苷酸和胺基酸序列如下突變體CA-IC的核苷酸(序列6)為將野生型CA的核苷酸序列(序列2)的自5』 端第886-888位的CAT鹼基突變為GCG鹼基，同時第925-927位的CAT鹼基突變為TAT鹼基。突變體CA-IC的胺基酸(序列4)為野生型CA的胺基酸酸序列(序列1)自N末端第296位(β亞基的57位)的組氨酸(H)突變為丙氨酸㈧；同時自N末端第309位(β 亞基的70位)的組氨酸(H)突變為纈氨酸(Y)，記為! 96Α-Η309Υ。也可人工合成序列6作為模板，以CA-I和CA-Rev引物，進行PCR擴增，再將該PCR 產物經限制性內切酶Nde I和Bio I進行雙酶切後與經同樣酶雙酶切的質粒pET30 (a)進行連接，得到 PET30 (a) -CA-IC0含有pET30 (a) CA-IC 的菌株命名為 Ε. coli BL21 (DE3)/CA-1C，即為突變株。四、頭孢菌素醯化酶突變體基因的誘導表達及其純化將pET30a 轉入 E. coli BL21 (DE3)/pET30a，得到轉空載體 E. coli BL21(DE3)/ pET30a作為空白對照；將步驟一得到的pET30 (a)-CA-HisRAE. coli BL21 (DE3)/pET30a，得到轉空載體 E. coli BL21 (DE3) /pET30 (a) -CA-His 作為陽性對照；分別將上述步驟二和步驟三得到的突變株E. coli BL21 (DE3)/CA_113和E. coli BL21(DE3)/CA-1C均在含卡那黴素(50 μ g/ml)的LB平板上劃線，37°C過夜培養，再挑取生長良好的的單菌落接種於10ml LB液體培養基(含50 μ g/ml卡那黴素)中，同時以E. coli BL21 (DE3) /pET30a 為空白對照，Ε. co 1 i BL21 (DE3) /pET30 (a) -CA-Hi s 作為陽性對照，37 °C， 250rpm過夜培養。分別將突變株E. coli BL21(DE3)/CA-113、E. coli BL21 (DE3)/CA_1C、空白對照和陽性對照，以1 40的接種量轉接於400ml新鮮的液體LB培養基(含50 μ g/ml卡那黴素)中，繼續培養至0D600為0. 4。然後加入終濃度為0. 5mM的1 16，在觀1，250印111條件下培養20h，誘導表達結束後，收集菌體，即為誘導後產物CA-113、CA-1C、空白對照和陽性對照。將上述產物分別進行SDS-PAGE檢測，結果如圖2所示，其中1為陽性對照，2為 Marker, 3為CA_113，4為CA-1C，5為空白對照，可以看出，CA-1C、CA-113均有57kDa與 26kDa的目的條帶，而空白對照沒有的目的條帶，陽性對照有目的條帶，說明突變株E. coli BL21 (DE3)/CA-113、E. coli BL21 (DE3)/CA-IC經誘導後大量表達出頭孢菌素醯化酶突變體 CA-113 禾口 CA-1C。將上述收集菌體破碎後，分別取細胞上清液10mL，用0.22μπι低蛋白質結合的濾膜過濾後，利用蛋白純化設備(AKTAexplorerTM station)，上樣至已結合Ni2+的 HiTrapTM Chelating HP 柱(購自安瑪西亞(Amersham Biosciences)，體積 ImL)，再用咪唑濃度梯度洗脫蛋白，當^Onm檢測器上出現目標峰時，開始收集至峰消失。分別得到純化後 CA-113 (2. 81mg/ml)和 CA_1C(3. 97mg/ml)。將純化後CA-113 和 CA-IC 經 SDS-PAGE 檢驗，CA-1C、CA-113 均有 57kDa 與 26kDa 的產物，與目標蛋白野生型頭孢菌素醯化酶CA的β亞基和α亞基的理論計算值相近。
採用相同的方法陽性對照E. coli BL21 (DE3)/pET30 (a)-CA-His的誘導產物進行純化，得到純化CA(5. 38mg/ml)，即為野生型頭孢菌素醯化酶。實施例2、頭孢菌素醯化酶突變體的活性檢測與轉化率1、頭孢菌素醯化酶突變體的活性檢測將由實施例1得到的純化後的CA-IC和CA-113分別取20 μ L，與含有3% (質量體積比)的頭孢菌素C(石藥集團)的pH = 8. 0，IOOmM的Tris-HCl的緩衝液180 μ 1混合， 得到反應前混合物，在25°C反應IOmin後，加入200 μ 1 40%的冰醋酸終止反應，得到反應產物。以純化CA(野生型頭孢菌素醯化酶)為陽性對照，得到陽性對照反應產物。用高效液相色譜檢測反應前混合物和產物，其中用迪馬C18液相色譜柱 250mm X 4. 6mm，流動相組成為15 %色譜甲醇，7. 5 %色譜乙腈，1 %冰醋酸。以購自Alfa Aesar的7_氨基頭孢烷酸作為標準品，以CA-His作為陽性對照(純化CA，即為野生型頭孢菌素醯化酶)。結果如圖3所示，A為反應前混合物(轉化初始各組分CPC)，B為反應產物(反應結束後各組分)，C為標準品7-氨基頭孢烷酸，可以看出反應前混合物的保留時間為3. 85min ； 反應產物的保留時間為2. 95min。而標準品和陽性對照反應產物的保留時間為2. 95 ；證明反應產物和陽性對照反應產物均為7-氨基頭孢烷酸。在IOmin內，CA-IC可以產生0.749 μ mol 7-氨基頭孢烷酸，CA-113可以產生 0. 365 μ mo 1 7-氨基頭孢烷酸，且即為頭孢菌素醯化酶突變體。陽性對照純化CA (野生型頭孢菌素醯化酶)可以產生0. 156 μ mol 7-氨基頭孢烷酸。定義IU為25°C下，在Imin內將1 μ mol底物頭孢菌素C轉化為產物7_氨基頭孢烷酸的活性。計算方法是按照上述活性測定的方法，跟據IOmin內產生的7-氨基頭孢烷酸的總量除以時間。純化後CA-IC的活性為943. lU/g(g表示的是純化後蛋白的質量)；純化後CA-113的活性為648. 0U/g(g表示的是純化後蛋白的質量)；純化後CA (野生型頭孢菌素醯化酶)的活性為144. 0U/g(g表示的是純化後蛋白的質量)。2、頭孢菌素醯化酶突變體底物轉化率在IOml的反應體系中，按照反應體系3% (質量體積比)投入0. 3g底物頭孢菌素 C鈉鹽(石藥集團)，並按每克底物200U共投酶60U ；在25°C，在IOOmM的Tris-HCl緩衝液中，恆pH = 8. 0的條件下，轉化三個小時，所投的酶為突變體純化後的CA-1C。通過HPLC檢測(檢測條件同上)剩餘CPC的含量，結果如下酶為突變體純化後CA-IC時，剩餘CPC的含量為0.036%，轉化率為98% (圖 4)。而已報導的野生型的頭孢菌素醯化酶，在催化底物CPC的反應時，轉化率為60%左右 (SHIN, Y. C. , J. Y. JEON, et al. (2005). cephalosporin C acylase mutant and method for preparing 7-ACA using same)。實施例3、頭孢菌素醯化酶(CA)的突變體經過胺基酸殘基取代的衍生蛋白的構建和活性測定思路為從上述實施例1中步驟三獲得的pET30 (a) -CA-IC出發，利用重疊PCR的技術，在CA-IC的基礎上，引入Seri3 471Ala突變。
以實施例1中的步驟三得到的pET30 (a) -CA-IC為模板，首先用CA-For (序列同實施例 1,步驟二 )和 CA-β 47ILower :5，-CATAACGAGCCAGCGCGCCATA-3，(其中下劃線部分為突變引入位點)，進行PCR擴增，退火溫度60°C，擴增出突變kr β 471Ala位點的上遊片段；再同樣以pET30 (a)-CA-IC為模板，使用CA-Rev (序列同實施例1，步驟二)和 CA-β 47IUpper :5，-GGCGCGCTGGCTCGTTATGT 3，(其中下劃線部分為突變引入位點)，退火溫度60°C，進行擴增，得到突變Ser β 471Ala位點的下遊片段；最後以上述得到的突變Ser β 471Ala位點的上遊片段和突變Ser β 471Ala位點的下遊片段為模板，加入CA-For和CA-Rev引物，在退火溫度為69°C的條件下進行擴增，得到 2400bp左右的PCR產物。將上述獲得的PCR產物用限制性內切酶)(ba I和)(h0 I進行雙酶切後，與經同樣酶雙酶切的質粒pET30(a)進行連接，將連接產物化學轉化到大腸杆coli BL2KDE3)感受態細胞，將轉化細胞塗布於添加有50 μ g/ml卡那黴素的LB平板上篩選陽性克隆。將陽性克隆接種於含有50 μ g/ml卡那黴素的LB液體培養基中，37°C 250rpm過夜培養，提取質粒送去測序，結果表明，該質粒含有PCR擴增產物，該PCR產物的基因具有序列表中序列7所示的核苷酸，該基因命名CA-5B，其編碼的蛋白命名為CA-5B，其胺基酸序列為序列表中的序列8。該質粒為將序列表中的序列7插入pET30 (a)的中)(ba I和Bio I位點間得到的載體，該質粒命名為PET30 (a) -CA-5B。含有pET30 (a)-CA-5B 的菌株命名為 E. coli BL21 (DE3)/CA-5B，即為突變株。比對野生型CA和衍生蛋白CA-5B的核苷酸和胺基酸序列如下衍生蛋白CA-5B的核苷酸(序列7)為將野生型CA的核苷酸序列(序列2)的自 5，端第886-888位的CAT鹼基突變為GCG鹼基，同時第925-927位的CAT鹼基突變為TAT 鹼基，同時第2128-2130位的AGC鹼基突變為GCT鹼基(即為將突變體CA-IC序列6的自 5』端第2128-2130位的AGC鹼基突變為GCT鹼基)。衍生蛋白CA-5B的胺基酸(序列8)為野生型CA的胺基酸酸序列(序列1)自N 末端第296位(β亞基的57位)的組氨酸(H)突變為丙氨酸㈧；同時自N末端第309位 (β亞基的70位)的組氨酸(H)突變為纈氨酸(Y)，同時自N末端第710位(β亞基的471 位)的絲氨酸(S)突變為丙氨酸(Α)，記為H296A-H309Y-S710A(即為將突變體CA-IC胺基酸序列序列4的自N末端第710位(β亞基的471位)的絲氨酸(S)突變為丙氨酸(A))。也可人工合成序列7作為模板，以CA-I和CA-Rev引物，進行PCR擴增，再將該PCR 產物經限制性內切酶Nde I和Bio I進行雙酶切後與經同樣酶雙酶切的質粒pET30 (a)進行連接，得到 PET30 (a) -CA-5B。將衍生蛋白表達株Ε. coli BL21(DE3)/CA-5B在含卡那黴素(50 μ g/ml)的LB平板上劃線，37°C過夜培養，再挑取生長良好的的單菌落接種於IOml LB液體培養基(含50 μ g/ ml 卡那黴素)中，同時以 Ε. coli BL21(DE3)/pET30a 為空白對照，Ε. coli BL21(DE3)/ PET30 (a) -CA-His作為陽性對照，37 °C，250rpm過夜培養。分別將衍生蛋白表達株E. C01 i BL21(DE3) /CA-5B、空白對照和陽性對照，以 1 40的接種量轉接於IOml新鮮的液體LB培養基(含50 μ g/ml卡那黴素)中，繼續培養至0D600為0. 4。然後加入終濃度為0. 5mM的IPTG，在，250rpm條件下培養證，誘導表達結束後，SOOOg離心收集菌體。按照相等的OD重懸後，以衍生蛋白CA-5B、空白對照和陽性對照，分別進行SDS-PAGE檢測，可以看出，CA-5B有57kDa與^kDa的目的產物，而空白對照沒有的目的條帶，陽性對照有目的條帶，說明突變株E. coliBL21 (DE3)/CA-5B經誘導後大量表達出頭孢菌素醯化酶突變體CA-5B。分別取誘導表達E. coli BL21(DE3)/CA-5B 和 E. coli BL21(DE3)/ pET30(a)-CA-His的菌體破碎的上清液20yL，與含有3% (質量體積比)的頭孢菌素C(石藥集團)的PH = 8. 0，IOOmM的Tris-HCl的緩衝液180 μ 1混合，在25°C反應60min後，加入200 μ 1 40%的冰醋酸終止反應，分別得到反應產物和陽性對照反應產物。按照實施例2中的液相色譜條件和方法，分析7-氨基頭孢烷酸的含量，在保留時間為2. 95min處有峰，證明衍生蛋白CA-5B的確產生7-氨基頭孢烷酸，且7-氨基頭孢烷酸產量(7-氨基頭孢烷酸峰的積分面積為948190)為野生型(7-氨基頭孢烷酸峰的積分面積為218 的4. 3倍。說明突變體經過胺基酸殘基取代的衍生蛋白比野生型的活性提高， 其為另一種頭孢菌素醯化酶突變體。
權利要求
1.一種頭孢菌素醯化酶突變體或其功能等效衍生物，其特徵在於將野生型頭孢菌素醯化酶的胺基酸序列進行如下至少一種胺基酸取代得到的蛋白1)自N末端第296位的組氨酸被丙氨酸所取代；2)自N末端第309位的組氨酸被纈氨酸所取代；所述野生型頭孢菌素醯化酶的胺基酸序列為序列表中的序列1。
2.一種蛋白，為如下1)-3)中的任一一種1)序列表中序列4所示的胺基酸序列組成的蛋白；2)序列表中序列3所示的胺基酸序列組成的蛋白；3)將序列表中序列3或序列4的胺基酸殘基序列經過一個或幾個胺基酸殘基的取代和 /或缺失和/或添加且具有頭孢菌素醯化酶功能的由1)衍生的蛋白。
3.根據權利要求2所述的蛋白，其特徵在於3)所示蛋白的胺基酸序列為序列表中的序列8。
4.權利要求1所述頭孢菌素醯化酶突變體或其功能等效衍生物或權利要求2或3所述蛋白的編碼基因。
5.根據權利要求4所述的編碼基因，其特徵在於所述的編碼基因為如下1)-5)中任一所述的DNA分子1)序列表中的序列6所示的DNA分子；2)序列表中的序列5所示的DNA分子；3)序列表中的序列7所示的DNA分子；4)在嚴格條件下可與1)或幻或幻限定的DNA序列雜交且編碼具有頭孢菌素醯化酶功能的蛋白的DNA分子；5)與1)或2)或3)限定的DNA序列具有90%以上的同源性且編碼具有頭孢菌素醯化酶功能的蛋白的DNA分子。
6.含有權利要求4或5所述編碼基因的重組載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌。
7.根據權利要求6所述的重組載體，其特徵在於所述重組載體為將權利要求1所述頭孢菌素醯化酶突變體或其功能等效衍生物或權利要求2或3所述蛋白的編碼基因插入pET30 (a)中，得到表達權利要求1所述頭孢菌素醯化酶突變體或其功能等效衍生物或權利要求2或3所述蛋白的載體。
8.根據權利要求6所述的重組菌，其特徵在於所述重組菌為將權利要求6或7所述的重組載體轉入宿主菌中，得到的重組菌，所述重組菌具體為大腸桿菌。
9.權利要求1所述頭孢菌素醯化酶突變體或其功能等效衍生物或權利要求2或3所述蛋白、權利要求4或5所述編碼基因或權利要求6所述的重組載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌在作為頭孢菌素醯化酶中的應用；或權利要求1所述頭孢菌素醯化酶突變體或其功能等效衍生物或權利要求2或3所述蛋白、權利要求4或5所述編碼基因或權利要求6所述的重組載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌在製備7-氨基頭孢烷酸中的應用。
10.一種製備頭孢菌素醯化酶的方法，包括如下步驟發酵權利要求6或8所述的重組菌，收集發酵產物，即得到頭孢菌素醯化酶。
全文摘要
本發明公開了一種頭孢菌素醯化酶突變體及其編碼基因與應用。本發明提供了的蛋白，為如下1)-3)中的任一一種1)序列表中序列4所示的胺基酸序列組成的蛋白；2)序列表中序列3所示的胺基酸序列組成的蛋白；3)將序列表中序列3或序列4的胺基酸殘基序列經過一個或幾個胺基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有頭孢菌素醯化酶功能的由1)衍生的蛋白。本發明的實驗證明，本發明提供了一種野生型CPC醯化酶變體，通過HPLC結果表明本發明的野生型CPC醯化酶變體與野生型酶相比，對CPC的比活可提高6.5倍。在一步法轉化中，在3h內，轉化率達到98％以上。
文檔編號C12R1/19GK102321603SQ20111029789
公開日2012年1月18日 申請日期2011年9月30日 優先權日2011年9月30日
發明者張豔, 林章凜, 肖瀛洲, 馬敦超 申請人:清華大學