串珠鐮刀菌素酶聯免疫檢測試劑盒的製作方法

2023-06-01 01:28:26 1

串珠鐮刀菌素酶聯免疫檢測試劑盒的製作方法
【專利摘要】本發明為串珠鐮刀菌素酶聯免疫檢測試劑盒，其檢測快速、靈敏、準確、操作簡便，適用於大批量樣品的檢測，為此本發明還提供了試劑盒的製備及檢測方法。其特徵在於：包括包被板、串珠鐮刀菌素標準品、串珠鐮刀菌素單抗凍幹品和酶標記的羊抗鼠抗體凍幹品；檢測時取包被板，加入50μL的串珠鐮刀菌素標準品或處理好的樣品到微孔中，加50μL辣根過氧化物酶（HRP）-羊抗鼠抗體，加50μL抗串珠鐮刀菌素抗體，室溫下反應30min，用洗滌液洗3次～5次，用吸水紙拍幹，加50μL顯色液A和50μL顯色液B，暗處靜置15分鐘後加終止液，在450nm處測其吸光度值，從標準曲線計算樣品中的串珠鐮刀菌素含量。
【專利說明】串珠鐮刀菌素酶聯免疫檢測試劑盒
【技術領域】
[0001]本發明屬於食品安全檢測領域，具體涉及食品中有害殘留物質的檢測方法，特別是一種串珠鐮刀菌素酶聯免疫檢測試劑盒的發明。
【背景技術】
[0002]串珠鐮刀菌素是某些鐮刀菌的代謝產物，因最初是由Cole等人於1973年自串珠鐮刀菌的培養物中提取出來的，而被命名為串珠鐮刀菌素串珠鐮刀菌素。該菌素為水溶性，對動物各器官，特別對心血管有極強的毒性作用。串珠鐮刀菌的化學名為3，4_ 二酮-1-羥基環丁烯，自然界中以鈉鹽或鉀鹽的方式存在。它是淡黃色針狀結晶，具有水溶性。串珠鐮刀菌素的毒性很強，小雞經口 LD5tl為4.0 mg/kg。急性中毒的大鼠可導致進行性肌肉衰弱。呼吸困難，發紺，昏迷和死亡。有人認為某些疾病與攝食玉米有關。該毒素的毒理作用是選擇性抑制氧化戊二酸鹽脫氫酶和丙酮酸鹽脫氫酶系統。Wilson等發現了串珠鐮刀菌素的肝毒性和致肝癌性。在食品和飼料中，串珠鐮刀菌素的檢測方法有薄層色譜法，氣象色譜法，氣-質聯機和高效液相色譜法。由於以上諸分析法樣品前處理比較複雜，操作時需專門的技術人員、檢測費用昂貴，不利於推廣應用。

【發明內容】

[0003]本發明為串珠鐮刀菌素酶聯免疫檢測試劑盒。其檢測快速、靈敏、準確、可定量，操作簡便，且對樣品純度要求不高，特異性強，特別適用於大批量樣品的檢測，為此，本發明還提供了專用試劑盒的製備及檢測方法。其特徵在於:包有串珠鐮刀菌素固相抗原的包被板製備(包括串珠鐮刀菌素酶標二抗，洗滌液，顯色液，終止液等的製備)，串珠鐮刀菌素單克隆抗體的製備。
[0004]串珠鐮刀菌素一牛血清白蛋白偶聯物的製備:將串珠鐮刀菌素溶解在3 mL-100mL吡啶中，加入羧甲基羥胺鹽酸鹽，室溫下攪拌過夜，氮氣吹乾，加入10 mL-100 mL蒸餾水，用氫氧化鈉溶液調PH為8.5-9.5左右，再用二氯甲烷提取3次-5次，每次10 mL-20mL,棄去二氯甲烷，水層用鹽酸溶液調pH為2.5-3.5左右，再用二氯甲烷提取3次-6次，每次10 mL-20 mL，收集二氯甲烷，過無水硫酸鈉脫水，過濾，低溫用氮氣吹乾，得到串珠鐮刀菌素中間產物。取串珠鐮刀菌素中間產物，加入3 mL-50 mL 二氧六環，加入氯甲酸乙丁酯，5°C _12°C下攪拌反應30分鐘-45分鐘，將反應液滴加到牛血清白蛋白中，然後牛血清白蛋白溶於5 mL-50 mL蒸餾水和5 mL-50 mL 二氧六環中，用氫氧化鈉溶液調pH為8_9，50C _12°C下攪拌反應5小時-6小時，然後，以蒸餾水進行透析，換液3次-5次，冷凍乾燥，偶聯物_20°C _40°C保存；上述反應成分的比例為:串珠鐮刀菌素:羧甲基羥胺鹽酸鹽=(10-1000)mg:(10-2000)mg,串珠鐮刀菌素中間產物:氯甲酸乙丁酯:BSA = (10-1000)mg:(10-1000) μ L:( 10-3000) mg。
[0005]串珠鐮刀菌素一卵清蛋白偶聯物的製備:將串珠鐮刀菌素溶解在3 mL-100 mL吡啶中，加入羧甲基羥胺鹽酸鹽，室溫下攪拌過夜，氮氣吹乾，加入10 mL-100 mL蒸餾水，用氫氧化鈉溶液調pH為8.5-9.5左右，再用二氯甲烷提取3次-5次，每次10 mL-20 mL,棄去二氯甲烷，水層用鹽酸溶液調PH為2.5-3.5左右，再用二氯甲烷提取3次-6次，每次10 mL-20 mL，收集二氯甲烷，過無水硫酸鈉脫水，過濾，低溫用氮氣吹乾，得到串珠鐮刀菌素中間產物；取串珠鐮刀菌素中間產物，加入3 mL-50 mL 二氧六環，加入氯甲酸乙丁酯，5°C -12°C下攪拌反應30分鐘-45分鐘，將反應液滴加到牛血清白蛋白中，然後牛血清白蛋白溶於5 mL-50 mL蒸餾水和5 mL-50 mL 二氧六環中，用氫氧化鈉溶液調pH為8_9，5°C - 12°C下攪拌反應5小時-6小時，然後，以蒸餾水進行透析，換液3次-5次，冷凍乾燥，偶聯物_20°C _40°C保存；上述反應成分的比例為:串珠鐮刀菌素:羧甲基羥胺鹽酸鹽=(10-1000)mg:(10-2000)mg,串珠鐮刀菌素中間產物:氯甲酸乙丁酯:0VA = (10-1000)mg:(10-1000) μ L:( 10-3000) mg。
[0006]所述抗串珠鐮刀菌素單克隆抗體及其溶液的製備:取串珠鐮刀菌素一牛血清白蛋白偶聯物用生理鹽水配成0.1 μ g/μ L抗原溶液，與等體積完全福氏佐劑混勻，充分乳化，供首次免疫用，加強免疫時用同量的不完全福氏佐劑代替完全福氏佐劑，首次免疫採用小鼠腹腔內直接注射，免疫劑量為10 μ g/只-100 μ g/只小鼠，以後每隔2周-4周加強免疫一次，加強免疫採用尾靜脈注射，免疫劑量10 μ g/只-100 μ g/只，最後一次免疫採用脾內注射，4天後取脾融合，將分離的免疫小鼠脾細胞與處於對數生長期的骨髓瘤細胞SP2/0以10:1比例混合，離心，去除上清，在50 s-90 s內將0.1 mL-10 mL 50%聚乙二醇(分子量為1500)加至細胞中，充分混勻，使其融合，I分鐘-3分鐘後加入10 mL-50 mL DMEM培養液，終止融合，水浴靜止10分鐘-30分鐘後離心，去除上清；將融合細胞用含5-30%小牛血清的HAT選擇性培養基懸浮後，以最後濃度為I X IO4-1 X IO6飼養細胞接種於小鼠腹腔巨噬細胞作飼養層的96孔培養板中，於5%-10% CO2, 350C _45°C條件下培養，5天-10天後，每培養孔更換 HT培養液。10天-20天後，開始對鏡檢有雜交瘤克隆生長的培養孔，取上清液進行篩選，對檢測結果。陽性的細胞立即用有限稀釋法進行克隆，雜交瘤篩選採用固相抗原間接非競爭ELISA法 進行，以串珠鐮刀菌素一卵清蛋白偶聯物為包被抗原，以免疫小鼠的血清為陽性對照，以SP2/o骨髓瘤細胞培養的上清液為陰性對照；陽性細胞孔的判定標準為(A試驗-A空白)代A對照-A空白)>2.1 ;對分泌陽性抗體的細胞進行克隆；採用有限稀釋法，將陽性克隆細胞吹勻，取一滴至培養瓶內，倒置顯微鏡下準確計數細胞個數，稀釋為70個/mL，再取I mL稀釋20倍，接種入96孔培養板中進行亞克隆，直至所有細胞孔的培養上清均呈陽性為止；對10周齡-13周齡BALB/c小鼠腹腔注射液體石蠟0.3 mL/只-0.5 mL/只，8天-10天後，腹腔注射培養至對數期的雜交瘤細胞，5 X IO6細胞/只，5天後注意觀察，收集腹水，離心去除沉澱，加甘油於_20°C~_40°C保存；上述反應成分的比例為:串珠鐮刀菌素一牛血清白蛋白偶聯物:生理鹽水=(10-1000) Ug:(0.1-10) mL。
[0007]酶標板製備:
1、串珠鐮刀菌素固相抗原的包被板製作，包括包被原的製作、封閉液的配置、以及孵育。把包被原加入包被液用作固相抗原的包板製作。包被液:稱取1.6 g碳酸鈉加上2.9g碳酸氫鈉，加雙蒸水至1000 mL，調節pH至9.6。封閉液:稱取I g100 mL PBS緩衝液中。包板時每孔100 111^包板液，371:下孵育2 h，後取出洗板兩次，加封閉液，每孔180 yL，37°C下孵育1.5 h，取出甩幹，加乾燥劑2 - 8°C保存；
2、串珠鐮刀菌素的標準品由高標稀釋而成，稀釋液為PBS緩衝液。0.1MPBS:1000mL 蒸餾水中 Nacl 9 g, Na2HPO4.1ffi2O 6 g，NaH2PO4.2H20 0.4 g , pH -J.2 ；
3、串珠鐮刀菌素的酶標二抗的酶由辣根過氧化酶標記；
4、洗滌液的製備:十二水磷酸氫鈉68.8 g加磷酸二氫鈉6.9 g，氯化鈉45 g, Tween-20
0.5 mL,加雙蒸水至I L,調節pH至7.4 ;
5、顯色液的製備:顯色液A:無水乙酸鈉8.2 g, β-糊精2.5 g,過氧化氫脲428.6 mg,加雙蒸水至I L，調節PH至5.0，4°C保存，使用時達室溫。顯色液B:100 mg TMB溶於10 mLDMSO中，棕色瓶保存。使用時將14.6 mL顯色液A與0.45 mL顯色液B混合15分鐘；
6、終止液製備:2M硫酸，取I份濃硫酸加到8份去離子水中，即為2M硫酸。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0008]附圖1為本發明串珠鐮刀菌素標準品的吸光度曲線示意圖。
具體實施方案
[0009]樣本前處理
處理前須知:
Ca)實驗中必須使用一次性吸頭，在吸取不同的試劑時要更換吸頭；
(b)實驗之前須檢查各種實驗器具是否潔淨，必須使用潔淨實驗器具，以避免汙染幹擾實驗結果；
(c)未處理的樣本冷凍保存；
Cd)處理後的樣本可在2-8°C避光保存24 h ;所有樣品應於2-8°C避光保存。
[0010]前處理步驟:
1、玉米等糧食作物處理方法
(1)取3g粉碎樣品，加入30 mL樣品提取液(用去離子水將甲醇按7:3體積比進行稀釋，即7份甲醇加3份去離子水，用於提取樣本中的串珠鐮刀菌素)；
(2)劇烈振蕩5min ；
(3)4000 r/min離心5 min,或用普通濾紙過濾；
(4)上清液或濾液用去離子水按1:19比例稀釋；取稀釋後液體待測。
[0011]2、飼料處理方法
(1)取3g粉碎樣品，加入30 mL樣品提取液(用去離子水將甲醇按7:3體積比進行稀釋，即7份甲醇加3份去離子水，用於提取樣本中的串珠鐮刀菌素)；
(2)劇烈振蕩5min ；
(3)4000 r/min離心5 min,或用普通濾紙過濾；
(4)上清液或濾液用去離子水按1:49比例稀釋；取稀釋後液體待測。
[0012]測定步驟:
1、將所需試劑和微孔板從冷藏環境中取出，在室溫下平衡30min，每種液體使用前均須搖勻。注意標準液均需做2個平行試驗；
2、加標準品:加標準品/樣本50μ L到對應的微孔中，再加入酶標記物50 μ L/孔，然後再加入50 μ L/孔抗體工作液，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板後置室溫避光反應30 min ；
3、洗板:小心揭開蓋板膜，將孔內液體甩幹，加洗滌液250μ L/孔，每次浸泡15?30s，充分洗漆4?5次,用吸水紙拍幹；
4、顯色:加入顯色A，B液各50μ L/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板後置25°C避光環境反應15 min ；
5、測定:每孔各加50μ L終止液，設定酶標儀在450 nm處，測定OD值(建議用450/630nm雙波長檢測,在5 min內讀完數據)；
6、結果分析
所測得的標準液或樣品吸光度的平均值(B)除以第一個標準液(O標準液)的吸光度(B。)值再乘以100%，得到百分吸光度值，
百分吸光度值(％) = B/B0X100%
以標準品濃度的10為底的對數為X軸，百分吸光值為Y軸，繪製標準曲線。然後將樣本的百分吸光值代入標準曲線，從標準曲線上讀出樣本所對應的值，為10的冪，乘以稀釋倍數，即為樣品中所含串珠鐮刀菌素的量。
【權利要求】
1.串珠鐮刀菌素酶聯免疫檢測試劑盒的製備，包括洗滌液，顯色液，終止液；其特徵在於:包有串珠鐮刀菌素固相抗原的包被板、串珠鐮刀菌素標準品，串珠鐮刀菌素單克隆抗體、串珠鐮刀菌素酶標二抗。
2.串珠鐮刀菌素固相抗原的包被板製作，包括包被原的製作、封閉液的配置、以及孵育；把包被原加入包被液用作固相抗原的包板製作；包被液:稱取1.6 g碳酸鈉加上2.9 g碳酸氫鈉，加雙蒸水至1000 mL，調節pH至9.6 ;封閉液:稱取I g100 mL PBS緩衝液中；包板時每孔100 μ L包板液，37°C下孵育2 h,後取出洗板兩次,加封閉液,每孔180yL，37°C下孵育1.5 h，取出甩幹，加乾燥劑2 - 8°C保存。
3.根據權利要求書第一條所述，串珠鐮刀菌素的標準品由高標稀釋而成，稀釋液為PBS 緩衝液；0.1M PBS:1000 mL 蒸餾水中加 NaCl 9g, Na2HPO4.12H20 6g，NaH2PO4.2H200.4g, PH:7.2。
4.根據權利要求書第一條所述，串珠鐮刀菌素的酶標二抗的酶由辣根過氧化酶標記。
5.根據權利要求書所述，串珠鐮刀菌素的檢測步驟如下:取包被板，加入標準品/樣本50 μ I到對應的微孔中，再加入酶標記物50 μ L/孔，然後再加入50 μ L/孔抗體工作液，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板後置室溫避光反應30 min ;小心揭開蓋板膜，將孔內液體甩幹，加洗滌液250 μ L /孔，每次浸泡15?30 S，充分洗滌4?5次，用吸水紙拍幹；加入顯色Α,Β液50 μ L/孔,輕輕振蕩混勻,用蓋板膜蓋板後置25°C避光環境反應15 min ;每孔各加50 μ L終止液，設定酶標儀在450 nm處，測定OD值(建議用450/630 nm雙波長檢測，在5min內讀完數據)；從標準曲線中計算樣品中串珠鐮刀菌素的含量。
【文檔編號】G01N33/531GK103808920SQ201210436706
【公開日】2014年5月21日 申請日期:2012年11月6日 優先權日:2012年11月6日
【發明者】杜道林, 尚蘇林 申請人:江蘇維賽科技生物發展有限公司