絳紅褐鏈黴菌sp3抗菌蛋白母液及其在製備誘導雜交竹抗病藥劑中的應用的製作方法

2023-05-31 11:59:36 2

專利名稱：絳紅褐鏈黴菌sp3抗菌蛋白母液及其在製備誘導雜交竹抗病藥劑中的應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及的是絳紅褐鏈黴菌SP3抗菌蛋白母液及其在製備誘導雜交竹抗病藥劑中的應用。
背景技術：
撐X綠雜交竹是南方重要的經濟用材竹，也是四川等地引種發展的主要經濟竹種之一。近年來，由絲孢綱真菌暗孢節菱孢菌[Arthrinium phaeospermum (Corda)M.B.Ellis]引起的雜交竹梢枯病導致撐X綠雜交竹大面積枯死，造成巨大的經濟損失，極大地威脅著長江中上遊地區退耕還林的進程和生態屏障的建設。目前主要採用化學防治和營林技術，而生物防治措施研究較少。化學防治雖是一種有效的防治手段，但存在病原菌抗藥性、環境與食品安全、藥害等許多實際問題，一些化學殺菌劑在許多發達國家和地區已嚴格限制使用。而與環境友好的生物農藥越來越受到人們的青睞，是未來農業可持續發展的重要組成部分。李姝江和憔天敏等從雜交竹健康植株分離到一株銅綠假單胞菌(Pseudomonas aerugin osa) ZB27,用其菌懸液和代謝產物處理對雜交竹梢枯病有較好的防治效果，但銅綠假單胞菌為條件致病菌，作為生防菌劑在田間使用受到限制，而本發明涉及的絳紅褐鏈黴菌SP3(本申請人已於2012年09月27日申請中國專利，申請號為201210367119.3，公開號CN102864110A，發明名稱:絳紅褐鏈黴菌SP3菌株及其在紅豆杉土傳根病和紅豆杉促生上的應用)對雜交竹生防效果較好，但用其代謝產物一純抗菌蛋白作為誘導因子，誘導植物抗性，提高雜交竹免疫性尚無人報導。誘導抗性，即利用生物或非生物因子激發植物的防衛基因，使植物產生局部的或系統的抗病性而達到防病的效果，在植物病害防治中具有重要的意義。其中，關於化學誘導因子誘導抗性的研究國內外報導很多。另外，利用生物因子誘導植物產生抗性的研究也較多，這些生物因子包括致病菌、弱毒小種、AM真菌、植物根圍促生細菌(PGPR)和放線菌等。隨著研究的深入，發現一些來源於微生物的誘導因子和微生物一樣可以誘導寄主植物產生防衛反應，尤其是誘導植保素的合成和積累。Thakkera等利用從Fusarium oxysporum f.sp cubense獲得的激發子處理香蕉根部，可引起香蕉葉片防禦性相關酶的積累，能有效提高感病品種的抗性Jung等發現從芽孢桿菌菌株中純化獲得的細菌素(class lid)可誘導大豆PAL、APX> SOD和PPO等活性的增加；Mao等從Alternaria tenuissima的菌絲中純化得到耐熱酸性蛋白激發子PeaTl，能夠誘導菸草對TMV產生系統抗病性；李雲鋒等利用從稻瘟病菌細胞壁中純化獲得的糖蛋白激發子CSB I (分子量為102 kDa)接種水稻，可引起葉片內P0D、PAL、L0X活性、綠原酸和木質素含量的顯著增加。蔣繼志等從31種微生物中篩選出了兩种放線菌源激發子，其中放線菌A 5295發酵液型激發子誘抗效果最高，達63.97%，並推測發酵液中有效誘抗物質可能是蛋白質類、多糖類等物質
發明內容
本發明所要解決的技術問題是針對現有技術的不足提供一種絳紅褐鏈黴菌SP3抗菌蛋白母液及其在製備誘導雜交竹抗病藥劑中的應用。本發明涉及的絳紅褐鏈黴菌SP3菌株，本申請人已於2012年09月27日申請中國專利，申請號為201210367119.3，公開號CN102864110A，發明名稱:絳紅褐鏈黴菌SP3菌株及其在紅豆杉土傳根病和紅豆杉促生上的應用。本發明的技術方案如下:—種絳紅褐鏈黴菌SP3抗菌蛋白母液,按照以下方法製備:Al去菌發酵濾液的製備:從新鮮培養的斜面菌種製備絳紅褐鏈黴菌SP3孢子懸浮液，調整孢子濃度為108cfu/mL ;然後以1%的接種量接入滅菌的發酵培養基中，於25°C、140r/min振蕩培養4d，發酵液於8000r/min離心15min,取上清液用0.45 μ m孔徑的微孔濾膜過濾除菌,備用；A2採用硫酸銨沉澱法提取抗菌物質，製備活性粗蛋白；利用55%飽和度的硫酸銨鹽析濃度對發酵液進行粗提取，得到的即為活性粗蛋白；A3純化抗菌蛋白，得到幾丁質結合抗菌蛋白母液:A31 DE52離子交換層析；A32 Sephadex G-75 凝膠過濾層析；A33 Sephadex G-50 凝膠過濾層析；

所述的絳紅褐鏈黴菌SP3抗菌蛋白母液在製備誘導雜交竹抗病藥劑中的應用，在雜交竹栽培區，發病前噴霧或灌根10-50倍(體積比)所述絳紅褐鏈黴菌SP3抗菌蛋白母液，噴霧每株200暈升；灌根每株100暈升。不論是噴霧或是浸根誘導，不同濃度抗菌蛋白處理的病情指數差異顯著，除200倍稀釋液處理與對照差異不顯著外，其餘均顯著低於對照(P < 0.05)，其中以10倍稀釋液處理的病情指數最低，分別是23.95和20.89，20倍稀釋液次之。噴霧和浸根兩種誘導方法都以10倍抗菌蛋白稀釋液的誘抗效果最好，分別為56.22%和62.88% ;其次是50倍稀釋液的處理，分別為45.39%和51.18% ;再者，100倍稀釋液的誘抗效均在20%以上；200倍稀釋液誘導後挑戰接種發病最為嚴重，誘抗效果僅為0.10%和-2.77%。表明隨著抗菌蛋白處理濃度的升高，雜交竹的抗病能力也隨之增強。


圖1為粗蛋白經DE52離子交換層析結果；圖2為峰5經Sephadex G-75凝膠過濾層析結果；圖3為峰5-4反向HPLC純度檢測結果；圖4為峰5-4經Sephadex G-50凝膠過濾層析結果。
具體實施例方式以下結合具體實施例，對本發明進行詳細說明。實施例1絳紅褐鏈黴菌SP3抗菌蛋白(幾丁質結合抗菌蛋白母液)製備本發明涉及的絳紅褐鏈黴菌SP3菌株，本申請人已於2012年09月27日申請中國專利，申請號為201210367119.3，公開號CN102864110A，發明名稱:絳紅褐鏈黴菌SP3菌株及其在紅豆杉土傳根病和紅豆杉促生上的應用。1.去菌發酵濾液的製作從新鮮培養的斜面菌種製備絳紅褐鏈黴菌SP3孢子懸浮液，調整孢子濃度為108cfu/mL;然後以1%的接種量接入滅菌的發酵培養基(黃豆餅粉3g，葡萄糖5g，甘油5g，蛋白腖 5g，NaCl 2.5g, CaCO2 2g，蒸餾水 IOOOmL)中，於 25°C、140r/min 振蕩培養 4d，發酵液於8000r/min離心15min,取上清液用0.45 μ m孔徑的微孔濾膜過濾除菌,備用。2抗菌物質提取方法篩選(I)甲醇、乙醇和丙酮提取取3份去菌發酵濾液，每份IOOmL,按照1:5 (v/v)的比例分別加入冷甲醇、乙醇和丙酮(_2(TC ),在_2(TC放置IOmin, 10 000r/min離心15min,使沉澱風乾,上清液用旋轉蒸發儀減壓蒸乾，沉澱物和蒸乾 物分別用0.05mol/L pH8.5 Tris-HCl緩衝液溶解並調整至5mL,測定其抑菌活性(採用杯碟法測定待測物質的抑菌活性。在PDA平板中央接入直徑6mm供試真菌菌絲塊，用打孔器距中心3.0cm處無菌挖取4個孔洞。每孔加入100 μ L待測物質，於25°C培養3-5d測量抑菌帶寬度，下文粗蛋白及抗菌蛋白活性測定均以雜交竹梢枯病菌為指示菌。以加滅菌後的Tris-HCl做對照，每處理均設3個重複。( 2 )硫酸銨沉澱法提取取去菌發酵濾液IOOmL,在0°C下加入硫酸銨使溶液相對飽和度為100%，4°C下過夜，10 000r/min離心15min,沉澱物再用0.05mol/L pH8.5 Tris-HCl緩衝液溶解後,4°C下用8-14kDa的透析袋透析脫鹽，聚乙二醇20 000包埋濃縮，調整至5mL。分別測定沉澱溶解液和上清液的抑菌活性(同上)。1-2倍體積低溫有機溶劑即可使多數蛋白質溶解度降低並析出，飽和度為100%的硫酸銨也可將發酵濾液中的蛋白質全部析出。絳紅褐鏈黴菌發酵濾液經有機溶劑沉澱後的上清液仍有活性，可能是部分未沉澱的活性蛋白，也可能是其它小分子次生代謝物質，後者可通過萃取進行提取。試驗結果表明:100%硫酸銨飽和度沉澱的抗菌物質的抑菌活性最大，顯著高於有機溶劑沉澱，上清液無抑菌活性；甲醇和乙醇對抗菌物質也有較好的沉澱效果，抑菌帶寬度分別是10.8mm和11.0mm,丙酮沉澱效果最差。上清液蒸乾物則以丙酮抑菌活性最大(表I)。以上分析說明發酵濾液中起主要抑菌作用的是蛋白質類物質，並且以硫酸銨鹽析法的提取效果最佳。表I幾種抗菌物質提取方法比較
權利要求
1.一種絳紅褐鏈黴菌SP3抗菌蛋白母液，其特徵在於，按照以下方法製備: Al去菌發酵濾液的製備: 從新鮮培養的斜面菌種製備絳紅褐鏈黴菌SP3孢子懸浮液，調整孢子濃度為IO8Cfu/mL ;然後以1%的接種量接入滅菌的發酵培養基中，於25°C、140r/min振蕩培養4d，發酵液於8000r/min離心15min,取上清液用0.45 μ m孔徑的微孔濾膜過濾除菌,備用； A2採用硫酸銨沉澱法提取抗菌物質，製備活性粗蛋白；利用55%飽和度的硫酸銨鹽析濃度對發酵液進行粗提取，得到的即為活性粗蛋白； A3純化抗菌蛋白，得到幾丁質結合抗菌蛋白母液: A31 DE52離子交換層析； A32 Sephadex G- 75凝膠過濾層析； A33 Sephadex G-50凝膠過濾層析。
2.根據權利要求1所述的絳紅褐鏈黴菌SP3抗菌蛋白母液在製備誘導雜交竹抗病藥劑中的應用，其特徵在於，在雜交竹栽培區，發病前噴霧或灌根10-50倍(體積比)所述絳紅褐鏈黴菌SP3抗菌蛋白母液，噴霧每株200毫升；灌根每株100毫升。
全文摘要
本發明公開了一種絳紅褐鏈黴菌SP3抗菌蛋白母液，按照以下方法製備A1去菌發酵濾液的製備A2採用硫酸銨沉澱法提取抗菌物質，製備活性粗蛋白；利用55%飽和度的硫酸銨鹽析濃度對發酵液進行粗提取，得到的即為活性粗蛋白；A3 純化抗菌蛋白，得到幾丁質結合抗菌蛋白母液；在雜交竹栽培區，發病前噴霧或灌(根)10-50倍(體積比)上述抗菌蛋白，噴霧每株200毫升，防治效果為70-80%；灌根每株100毫升，防治效果為75-85%。
文檔編號C07K1/16GK103088094SQ201310033858
公開日2013年5月8日 申請日期2013年1月29日 優先權日2013年1月29日
發明者朱天輝, 張麗娜, 李姝江, 韓珊, 譙天敏 申請人:四川農業大學