蛋白類殺藻化合物及其製備方法

2023-05-31 17:11:51 2

專利名稱：蛋白類殺藻化合物及其製備方法
技術領域：
本發明涉及一種殺藻化合物，尤其是涉及一種蛋白類殺藻化合物及其製備方法。
背景技術：
赤潮的頻繁發生在造成海洋生態系統巨大破壞的同時，也給各國經濟帶來巨大損失。由於物理和化學方法治理赤潮存在難以大面積施用及易造成二次汙染等原因，利用生物相互之間的生態作用來治理赤潮已成為當前研究熱點。近年來，圍繞海洋細菌在赤潮生消過程中的作用，科學家做了大量關於菌藻關係的研究。研究表明，海洋細菌同赤潮藻類之間存在錯綜複雜關係一方面表現為互利共生， 細菌吸收藻類產生的有機物質，並為藻類的生長提供營養鹽和必要的生長因子，從而調節藻類的生長；另一方面表現為特異性抑制甚至殺滅，細菌可以通過直接或間接的作用抑制藻類的生長，甚至裂解藻細胞，從而表現為殺藻效應。藻菌共培養的研究結果表明，殺藻細菌的作用方式可以歸結為兩種一是細菌同藻細胞直接接觸、導致藻細胞死亡的直接殺藻作用；二是細菌不同藻細胞直接接觸，而通過釋放某種化學物質導致藻細胞死亡的間接殺藻作用。對於需要同目標藻直接接觸才能表現殺藻作用的細菌，目前尚未見有關對其殺藻物質的研究報導，有可能是一些胞外酶如纖維素酶、蛋白酶、酯酶等，細菌通過釋放胞外酶， 破壞藻細胞細胞壁、細胞膜，從而殺死藻細胞([1]楊小茹.海洋高效殺藻菌及其活性物質的研究[M],廈門廈門大學出版社，2008 ;[2]Su JQ, Yang XR, Zheng TL. Isolation and characterizationof a marine algicidal bacterium against a toxic algae. Harmful Algae,2007，6(6) :799-810)。對於不需要同目標藻直接接觸而表現殺藻作用的細菌，目前所發現的殺藻細菌多數屬於該類，其一般是通過分泌溶解性殺藻物質殺死藻細胞，這些胞外活性物質包括胞外酶、表面活性劑、抗生素等([3]蘇建強.海洋高效殺藻菌及其活性物質的研究[M].廈門 廈門大學出版社，2006)。如 Lee 等([4]Lee, S. 0. ，Kato, J. ，Takiguchi，N. ，Kuroda, A. ， Ikeda, T.， Mitsutani, A. , Ohtake, H. Involvement of an extracellular protease in algicidal activity of the marine bacteriumPseudoalteromonas sp. strain A28[J]. Applied and Environmental Microbiology,2000,66 (10) :4334-4339)從 PseudoalteromonasA25 菌株培養濾液中分離到一種能殺死骨條藻(Skeletonemacostatum)的胞外蛋白酶，該蛋白水解酶為單體蛋白，分子量約為50kD，N末端的胺基酸序列經測定為 Ala-Thr-Pro-Asn-Asp-Pro ；Amaro等分離到的殺藻細菌的培養液表現出多種胞外酶活性和殺藻活性，表明其可能是通過胞外酶來殺死藻細胞。隨著對海洋認識的提高，現代生物技術的飛速發展，研究中深度與廣度的結合，使得近年來海洋活性蛋白多肽的實際應用體系得到良好建構與改進。由於來源豐富、結構新穎、活性獨特，因此逐步實現了海洋蛋白在工業養殖業、醫藥衛生、環境保護等領域中的應
至今為止，大多數篩選到的殺藻細菌是通過分泌特異的具有殺藻活性的物質來起殺藻作用的。已經報導的殺藻活性物質包括色素、多肽、胺基酸、抗生素、含氮化合物等其他尚未定性的殺藻化合物。通過篩選高效、專一、能夠生物降解的殺藻活性物質成為開發殺藻劑用於赤潮治理的一個新思路。

發明內容
本發明的目的在於提供一種蛋白類殺藻化合物及其製備方法。所述蛋白類殺藻化合物是從一株海洋細菌假單胞交替菌DHQ25(Pseudoalteromonassp. DHQ25)分離獲得，所述假單胞交替菌 DHQ25 (Pseudoalteromonas sp. DHQ25)已於2010年8月30日保藏於中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO :M2010210，中國典型培養物保藏中心的地址為中國武漢武漢大學。所述假單胞交替菌DHQ25是由來自長江口海水樣品中篩選得到。所述蛋白類殺藻化合物的製備方法包括以下步驟1)將假單胞交替菌DHQ25活化後，接種於液體培養基中培養，將培養液離心，取上清過濾後，進行無菌檢驗，得到假單胞交替菌DHQ25的無菌培養濾液，再進行超濾處理，收集超濾液；在步驟1)中，所述液體培養基可採用2216E液體培養基；所述培養的條件可為25°C ISOrpm培養24h ；所述培養液離心，可採用SOOOg離心IOmin ；所述過濾，可採用 0. 22 μ m微孔濾膜過濾；所述無菌培養濾液的pH值可為8. 1 8. 4。2)超濾後上清液經分離純化，收集其中的8個組分，各組分凍幹成粉，分別對各組分進行殺藻活性檢測，取具有殺藻活性的3個組分，記為P5、P6和P7，檢測各組分中的蛋白條帶數，其中P7經SDS-PAGE檢測，顯示出一條帶，再將P7的凍乾粉重溶，透析除鹽，進HPLC 重新分離純化；在步驟2)中，所述分離純化，可採用Varian C18-HPLC分離純化，以20mmol L_1pH 8. OTris-HCl為洗脫劑；所述對各組分進行殺藻活性檢測，可以20mmol I^pH 8. OTris-HCl 為空白對照；所述P7的凍乾粉重溶，可以20mmol I^pH 8. OTris-HCl為溶解液，所述透析除鹽，可用 20mmol L_1pH 8. OTris-HCl 為透析液。3)P7再進行分離純化，共分離出兩個峰，記為P71和P72，凍幹處理，重新溶解，透析除鹽，進行殺藻檢測，其中P71具有殺藻活性，經SDS-PAGE還原和非還原處理後都顯示是 P71 一條帶，P71經原位PAGE鑑定是單條帶的純蛋白；在步驟3)中，所述分離純化，可採用Agilent C18-HPLC分離純化，以20mmol L^pH 8. OTris-HCl為洗脫劑；所述重新溶解，可用20mmol L、H 8. OTris-HCl重新溶解，控制濃度10mg/L ；所述透析除鹽，可用20mmol I^pH 8. OTris-HCl為透析液；所述殺藻檢測， 可以ZOmm0Ir1PH 8. OTris-HCl為空白對照；所述蛋白是一個的單鏈蛋白，分子量大小為 14. 5kD，說明P71裡不存在同分異構體，其所在的峰是一個純峰。4)P71經ESI-MS/MS鑑定分析，得知分子式為C61tlH971N2tl9O181 S2，其胺基酸序列如下
5
MetAlaSerGlnLysArgProSerGlnArgHisGlySerLysTyrLeu
151015
AlaThrAlaSerThrMetAspHisAlaArgHisGlyPheLeuProArg
202530
HisArgAspThrGlylieLeuAspSerlieGlyArgPhePheSerGly
354045
AspArgGlyAlaProLysArgGlySerGlyLysAspSerHisThrArg
505560
ThrThrHisTyrGlySerLeuProGlnLysSerGlnArgThrGlnAsp
65707580
GluAsnProValValHisPhePheLysAsnlieValThrProArgThr
859095
ProProProSerGlnGlyLysGlyArgGlyLeuSerLeuSerArgPhe
100105110
SerTrpGlyGlyArgAspSerArgSerGlySerProlieAlaArgArg
115120125
本發明應用活體螢光染色劑螢光素雙醋1浚酯FDA對活體塔:瑪亞歷山大藻
行染色，進行殺藻活性試驗，以殺藻效率為導向進行殺藻活性物質的提取純化和製備。方法是塔瑪亞歷山大藻於三角瓶中培養至指數期，然後分裝到12孔細胞培養板中，每孔分裝 4mL均勻藻細胞懸液，適應生長1 2d，進行殺藻活性試驗。根據以下公式計算殺藻效率 殺藻率(％ ) = (Nc-Nt)/Ne X 100 (Ne表示加入2216E藻細胞培養基對照組的活藻細胞數， Nt表示加入無菌培養濾液對照組或不同處理方式無菌培養濾液實驗組的活藻細胞數)。本發明通過超濾和反相高效液相兩種手段從海洋細菌DHQ25中分離純化得到一種蛋白類殺藻化合物，利用電噴霧質譜、ESI-MS/MS質譜等鑑定，經Mascot檢索發現其一級結構與髓磷脂鹼性蛋白(MBP)有最高的匹配度，這也是首次發現蛋白類化合物對塔瑪亞歷山大藻具有殺藻活性。本發明聯合運用超濾體系和高效液相色譜分離體系(依次用Varian C18-HPLC高效液相和Agilent C18-HPLC高效液相)來進行製備。


圖1為Varian C18-HPLC高效液相圖。在圖1中，A為液相譜圖，橫坐標為時間 (min)，縱坐標為OD值(280nm) (mAU)；各譜峰從左至右依次為P1、P2、P3、P4、P5、P6、P7、P8 ； B為P7和超濾液的SDS-PAGE圖，其中，「原」表示超濾液。圖2為Agilent C18-HPLC高效液相圖。在圖2中，橫坐標為時間(min)，縱坐標為 OD值O80nm) (mAU)；其中2個譜峰為P7再進行分離純化所得，記為P71和P72。圖3為P71SDS-PAGE電泳圖譜。在圖3中，M表示標準分子量，1表示還原處理後 P71，2表示非還原處理後P71。圖4為P71的原位PAGE電泳圖譜。在圖4中，箭頭指向為P71。
具體實施例方式以下實施例是對本發明的進一步說明。1)海洋細菌DHQ25活化後，接種於2216E液體培養基中，25°C 180rpm培養Mh，培養液8000g離心lOmin，上清經0. 22 μ m微孔濾膜過濾後，平板塗布進行無菌檢驗，可得到 DHQ25無菌培養濾液，其pH值為8. 1 8. 4。對該無菌培養濾液進行超濾處理，收集超濾液 4°C保存。所有操作均在4°C下進行。2)超濾後上清液經 Varian C18-HPLC 分離純化(以 20mmol L^pH 8. OTris-HCl 為洗脫劑)，收集其中的8個組分(對應於圖IA中的譜峰Pl，P2，P3，P4，P5，P6，P7，P8)，各組分凍幹成粉，分別對各組分進行殺藻活性檢測，發現P5、P6和P7有殺藻活性(以20mmol I^pH 8. OTris-HCl為空白對照)，其餘各峰未檢測到活性或活性較低。SDS-PAGE檢測各峰中的蛋白條帶數，P7顯示出一條帶(如圖1B)，而原位PAGE表徵後發現P7含有兩個條帶， P7的凍乾粉重溶(以20mmol I^pH 8. OTris-HCl為溶解液)，透析除鹽(用20mmol I^pH 8. OTris-HCl為透析液)，進HPLC重新分離純化。3)P7 再經 Agilent C18-HPLC 進行分離純化(以 20mmol L_1pH 8. OTris-HCl 為洗脫劑)，共分離出2個峰(參見圖2)，收集這兩個峰，凍幹處理，並用20mmol L^pH 8. OTris-HCl重新溶解(控制濃度10mg/L)，透析除鹽(用20mmol L^pH 8. OTris-HCl為透析液)，進行殺藻檢測(共培養一天後檢測，以20mmol L^1pH 8. OTris-HCl為空白對照)。 其中P71具有殺藻活性，經還原和非還原處理後都顯示是P71 —條帶(參見圖幻，說明該蛋白是一個的單鏈蛋白，分子量大小為14. 5kD ；P71經原位PAGE鑑定是單條帶的純蛋白，說明 P71裡不存在同分異構體，其所在的峰是一個純峰(如圖4)。4)P71 經 ESI--MS/MS鑑定分析，得知分子式為C61tlH971^19IO181S2:，胺基酸序列^
MetAlaSerGlnLysArgProSerGlnArgHisGlySerLysTyrLeu
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AlaThrAlaSerThrMetAspHisAlaArgHisGlyPheLeuProArg
202530
HisArgAspThrGlylieLeuAspSerlieGlyArgPhePheSerGly
354045
AspArgGlyAlaProLysArgGlySerGlyLysAspSerHisThrArg
505560
ThrThrHisTyrGlySerLeuProGlnLysSerGlnArgThrGlnAsp
65707580
GluAsnProValValHisPhePheLysAsnlieValThrProArgThr
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ProProProSerGlnGlyLysGlyArgGlyLeuSerLeuSerArgPhe
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SerTrpGlyGlyArgAspSerArgSerGlySerProlieAlaArgArg
115120125
以下給出具體實施例。
1.菌種、藻種
7
菌種DHQ25來源於廈門大學資源與環境微生物研究所於2003年赤潮973項目 MC2003-2航次從長江口及其毗鄰海域海水樣品中(包括表層、中層和底層)分離，是一株具有殺藻作用的弧菌。藻種Alexandrium tamarense (AT)無菌株，藻種購自暨南大學水生生物研究所， 經本申請人無菌藻技術除菌得到的塔瑪亞歷山大藻無菌株。藻類所用培養液為f/2培養液。藻類置於室內三角瓶中培養，溫度為20士 1°C，光照條件為1 光照，1 黑暗。2.培養基培養基Q216E)蛋白腖(P印tone) 5g，酵母提取物WeastExtract) lg，磷酸高鐵 0. Ig,瓊脂粉IOg (固體培養基)，pH7. 6 7. 8，陳海水定容到1L。實施例1 螢光素雙醋酸酯FDA的藻細胞染色與殺藻效率計算將螢光素雙醋酸酯FDA溶於丙酮中，配成濃度為5mg/mL的溶液，置於4°C冰箱中避光保存。染色時，取200yL樣品(不同處理均勻藻細胞培養液)於1.5mL離心管中；加入螢光素雙醋酸酯FDA 4 μ L，使其終濃度為100 μ g/mL，室溫靜置染色5min後，放入冰盒避光待鏡檢；染色樣品混勻後，取20 μ L於藻細胞計數板，用螢光顯微鏡在藍光激發光下G95nm) 和可見光下分別進行觀察計數，發出亮綠色螢光的細胞為活細胞，計數3次，取平均值。根據以下公式計算殺藻效率殺藻率(％) = (Nc-Nt)/NeX 100其中Nc表示加入2216E對照組的活藻細胞數，Nt表示加無菌培養濾液對照組或不同處理方式無菌培養濾液實驗組的活藻細胞數。實施例2 蛋白類活性物質殺藻譜的研究P71殺藻譜(參見表1)表現出一定的特質(共培養一天後檢測，以20mmol L^pH 8. OTris-HCl為空白對照)，它在Dinoflagellata和Bacillariophyta中起作用較大，而在另外兩個屬中，則沒有檢測到殺藻活性。表1P71殺藻譜
藻種名稱無菌處理P71殺藻率(％)鹽生杜氏藻無菌—微小原甲藻無菌—自養小球藻無菌—海洋卡盾藻無菌—青島大扁藻無菌26.8±11.5小球藻無菌—威氏海鏈藻無菌—東海原甲藻無菌10.4±9.5熱帶骨條藻無菌—中肋骨條藻無菌—鏈狀亞歷山大藻無菌14.9±12.6微小亞歷山大藻無菌24.8±10.3三角褐指藻無菌43.8±6.3塔瑪亞歷山大藻無菌36.3±4.0塔瑪亞歷山大藻02有菌30.4±7.2球形棕囊藻無菌—叉鞭金藻無菌—球等鞭金藻無菌—實施例3 活性蛋白濃度依賴性分析當P71稀釋2倍時，活性迅速降至5 %，基本無活性，這個數據顯示該蛋白的活性具有明顯的濃度依賴性特性(共培養一天後檢測，以20mmol IZ1pH 8. OTris-HCl為空白對照)。表2濃度依賴性分析
濃度梯度(xl2uM)殺藻率(％)2°46Γ1—Γ2—2"3—2"4—以下給出假單胞交替菌DHQ25的篩選方法1)將從長江口海域海水樣品中(包括表層、中層和底層)分離獲得的13株能夠殺滅有毒赤潮藻Alexandrium tamarense的細菌作為出發菌株，培養14 18h到穩定期， 離心獲得培養上清液；採用的培養基0216E)的配方為蛋白腖(Peptone) 5g，酵母提取物 (Yeast Extract) lg，磷酸高鐵0. Ig,瓊脂粉IOg (固體培養基)，pH7. 6-7. 8，陳海水定容到1L。2)取步驟1)所得的部分培養上清液孵化後進行殺藻活性檢測，得到6株具有殺藻活性的細菌，分別記為HH2、DHY3、DHYl 1、DHY20、DHY36、DHQ^ ；所述孵化的條件為在100 110°C 下孵化 30 40min。進行殺藻活性檢測的藻株Alexandrium tamarense (AT)購自暨南大學水生生物研究所，經本申請人無菌藻技術除菌得到的塔瑪亞歷山大藻無菌株(參見中國專利 CN1887353)。藻類所用培養液為f/2培養液。藻類置於室內三角瓶中培養，溫度為20士 1°C， 光照條件為1 !光照，12h黑暗。3)取步驟1)所得的另一部分培養上清液經超濾，取超濾後的上清液進行殺藻活性檢測，得到6株具有殺藻活性的細菌，分別記為HH5、DHY3、DHY^、DHQ5、DHQ19、DHQ25 ；所述超濾採用超濾離心管5000g下超濾離心1.證，所述超濾離心管選用3kD超濾離心管(參見表3)。4)挑選出具有殺藻活性的細菌DHQ25，即為假單胞交替菌 DHQ25(Pseudoalteromonassp. DHQ25)。DHQ25在超濾處理後保留了殺藻活性，在100°C高溫處理後失去了殺藻活性，而超濾液在蛋白質特徵反應(茚三酮試劑反應)中呈陽性特性，顯示是蛋白/多肽/胺基酸類物質，表明DHQ25是一株能產胞外殺藻活性蛋白的海洋細菌。表 權利要求
1.蛋白類殺藻化合物，其特徵在於是從假單胞交替菌DHQ25(Pseud0alter0m0nasSp. DHQ25)分離獲得，所述假單胞交替菌DHQ25(Pseudoalteromonas sp. DHQ25)已於2010年8 月30日保藏於中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO :M2010210。
2.如權利要求1所述的蛋白類殺藻化合物的製備方法，其特徵在於包括以下步驟1)將假單胞交替菌DHQ25活化後，接種於液體培養基中培養，將培養液離心，取上清過濾後，進行無菌檢驗，得到假單胞交替菌DHQ25的無菌培養濾液，再進行超濾處理，收集超濾液；2)超濾後上清液經分離純化，收集其中的8個組分，各組分凍幹成粉，分別對各組分進行殺藻活性檢測，取具有殺藻活性的3個組分，記為P5、P6和P7，檢測各組分中的蛋白條帶數，其中P7經SDS-PAGE檢測，顯示出一條帶，再將P7的凍乾粉重溶，透析除鹽，進HPLC重新分離純化；3)P7再進行分離純化，共分離出兩個峰，記為P71和P72，凍幹處理，重新溶解，透析除鹽，進行殺藻檢測，其中P71具有殺藻活性，經SDS-PAGE還原和非還原處理後都顯示是P71 一條帶，P71經原位PAGE鑑定是單條帶的純蛋白；4)P71經ESI-MS/MS鑑定分析，得知分子式為C61tlH971^19O181S2，其胺基酸序列如下 Met Ala Ser Gln Lys Arg Pro Ser Gln Arg His Gly Ser Lys Tyr Leu 151015Ala Thr Ala Ser Thr Met Asp His Ala Arg His Gly Phe Leu Pro Arg202530His Arg Asp Thr Gly lie Leu Asp Ser lie Gly Arg Phe Phe Ser Gly354045Asp Arg Gly Ala Pro Lys Arg Gly Ser Gly Lys Asp Ser His Thr Arg505560Thr Thr His Tyr Gly Ser Leu Pro Gln Lys Ser Gln Arg Thr Gln Asp 65707580Glu Asn Pro Val Val His Phe Phe Lys Asn lie Val Thr Pro Arg Thr859095Pro Pro Pro Ser Gln Gly Lys Gly Arg Gly Leu Ser Leu Ser Arg Phe100105110Ser Trp Gly Gly Arg Asp Ser Arg Ser Gly Ser Pro lie Ala Arg Arg 115120125。
3.如權利要求2所述的蛋白類殺藻化合物的製備方法，其特徵在於在步驟1)中，所述液體培養基採用2216E液體培養基。
4.如權利要求2所述的蛋白類殺藻化合物的製備方法，其特徵在於在步驟1)中，所述培養的條件為25°C 180rpm培養Mh。
5.如權利要求2所述的蛋白類殺藻化合物的製備方法，其特徵在於在步驟1)中，所述培養液離心，是採用8000g離心lOmin。
6.如權利要求2所述的蛋白類殺藻化合物的製備方法，其特徵在於在步驟1)中，所述過濾，是採用0. 22 μ m微孔濾膜過濾；所述無菌培養濾液的PH值為8. 1 8. 4。
7.如權利要求2所述的蛋白類殺藻化合物的製備方法，其特徵在於在步驟2)中，所述分離純化，是採用Varian C18-HPLC分離純化，以20mmol Γ1 ρΗ 8. OTris-HCl為洗脫劑；所述對各組分進行殺藻活性檢測，是以20mmol Γ1 ρΗ 8. OTris-HCl為空白對照。
8.如權利要求2所述的蛋白類殺藻化合物的製備方法，其特徵在於在步驟2)中，所述 Ρ7的凍乾粉重溶，是以20mmol L—1 ρΗ 8. OTris-HCl為溶解液，所述透析除鹽，是用20mmol L^pH 8. OTris-HCl 為透析液。
9.如權利要求2所述的蛋白類殺藻化合物的製備方法，其特徵在於在步驟3)中，所述分離純化，是採用Agilent C18-HPLC分離純化，以20mmol廠1 pH 8. OTris-HCl為洗脫劑。
10.如權利要求2所述的蛋白類殺藻化合物的製備方法，其特徵在於在步驟3)中，所述重新溶解，用20mmol廠1 pH 8. OTris-HCl重新溶解，控制濃度10mg/L ；所述透析除鹽，用 20mmol Γ1 ρΗ 8. OTris-HCl 為透析液；所述殺藻檢測，以 20mmol Γ1 ρΗ 8. OTris-HCl 為空白對照；所述蛋白是一個的單鏈蛋白，分子量大小為14. 5kD。
全文摘要
蛋白類殺藻化合物及其製備方法，涉及一種殺藻化合物。所述化合物從假單胞交替菌DHQ25分離獲得。將DHQ25活化後培養離心，取上清過濾後無菌檢驗得DHQ25的無菌培養濾液，收集超濾液；超濾後上清液經分離純化，收集其中的8個組分，各組分凍幹成粉，殺藻活性檢測，取具有殺藻活性的3個組分P5、P6和P7，檢測蛋白條帶數，P7顯示出一條帶，再將P7的凍乾粉處理，共分離出兩個峰，記為P71和P72，再處理後殺藻檢測，P71具有殺藻活性，經處理後顯示P71一條帶，經原位PAGE鑑定是單條帶的純蛋白；P71經ESI-MS/MS鑑定分析，得知分子式為C610H971N209O181S2。
文檔編號C07K14/21GK102167732SQ20101058288
公開日2011年8月31日 申請日期2010年12月10日 優先權日2010年12月10日
發明者呂靜琳, 王賓香, 鄭天凌 申請人:廈門大學