溫敏型蛋白質分子印跡整體柱及其製備方法和應用的製作方法

2023-05-31 14:58:41

專利名稱：溫敏型蛋白質分子印跡整體柱及其製備方法和應用的製作方法
溫敏型蛋白質分子印跡整體柱及其製備方法和應用
技術領域：
本發明屬於高分子材料製備技術及其在蛋白質分離分析領域的應用，具體地說涉 及一種新型蛋白質分子印跡整體柱。
背景技術：
分子印跡技術(molecular imprinting technology)是指製備具有特異性識別 作用的客體目標分子的技術，通常被描述為製造識別「分子鑰匙」的人工「鎖」技術。基本 原理為提供合適的反應條件，使模板分子與功能單體相互作用形成超分子複合物，複合物 在交聯劑及引發劑的作用下形成聚合物，然後在一定條件下除去模板分子，得到帶有與模 板分子空間結構互補的識別位點的分子印跡聚合物(molecularly imprinted polymer, ΜΙΡ) ο由於MIPs具有構效預定性(structur印redetermination)、特異識別性(specific recognition)和廣泛實用性(extensive practicability)的優點，它在色譜中對映體和 異構體的分離、固相萃取、化學仿生傳感器、模擬酶催化、臨床藥物分析、膜分離技術等領域 展現了良好的應用前景。近年來，分子印跡技術逐步拓展到蛋白質的分離、富集、純化、鑑定等與蛋白質組 學(proteomics)相關的生命科學領域。蛋白質為複雜生物大分子排列，擁有能控制性和特 異性地與目標分子作用並鍵合的位點，蛋白質(或主體)和配體(或客體)之間的位點互補 產生作用力時發生鍵合。蛋白質-客體間的相互作用，能夠用概念簡單的「鎖和鑰匙」假設 來描述，這種假設最貼切實用，也恰好是分子印跡的基本原理，即模板蛋白周圍預組裝識別 位點，這個過程是分子印跡的基本過程。在近年蛋白質組學中，以分子印跡作為研究方法已 獲得越來越多的關注，也取得了 一些進展，分子印跡技術著力於純化、分離和富集蛋白。目 前已有的蛋白質印跡聚合物的方法多限於包埋法Pang、表面印跡法Mosbach和抗原決定 基法Rachkov。而傳統的小分子印跡整體柱的製備技術並不適合於生物大分子，有關於蛋白 質分子印跡整體柱的方法研究鮮有報導。由於蛋白質固有的特性(體積龐大、構想靈活、結 構複雜以及水溶性)，蛋白質印跡的困難集中在如何保持印跡蛋白質構象的完整性，提高蛋 白質印跡聚合物的選擇性。智能高分子水凝膠是一類對外界刺激能產生敏感響應的高分子水凝膠，具有良好 的生物兼容性和智能響應性。根據對外界刺激的響應情況，智能高分子水凝膠分為溫度敏 感型水凝膠、PH值敏感型水凝膠、光敏感型水凝膠、壓力敏感型水凝膠、生物分子敏感型水 凝膠以及電場敏感型水凝膠等。其中溫度敏感型水凝膠的溫度響應機理是指當大分子鏈上 同時具有親水性的基團和疏水性的基團時，線型高分子在水溶液中會隨著溶液溫度的變化 而發生分子鏈構象的變化，由伸展的無規線團(coil)狀轉變為蜷曲球(globular)狀，這種 構象的變化一般認為是親水作用和疏水作用相互競爭的結果。溫敏型分子印跡聚合物可利 用溫敏高分子的溫度體積相變行為，即在不同溫度下分別發生收縮和溶脹，使得高分子側 鏈上帶有的可與模板分子形成多接觸點吸附的功能單體間的距離和相對位置改變，從而使 印跡空腔結合模板分子的親和力發生改變。溫敏型聚合物在蛋白質印跡方面很有前景，是一種溫和高效的分子印跡材料的製備方法。迄今溫敏型蛋白質分子印跡整體柱的製備方法 及應用方面的研究在國內外尚未見有關論文或專利報導，在理論上和方法上均屬於創新性 研究。

發明內容本發明的目的在於提供一種高選擇性及生物兼容性好的蛋白質分子印跡整體柱 的製備方法。為了實現上述目的，本發明採用的技術方案如下—種溫敏型蛋白質分子印跡整體柱的製備方法，該方法包括如下步驟(a)將兩種矽烷化試劑加入到有機溶劑中，混合均勻；(b)在(a)中加入硝酸作為催化劑，混合均勻；(c)將(b)液體灌注到毛細管柱或高效液相色譜柱中，模具兩端密封，在 400C -50°C垂直放置12-36小時；(d)反應結束後，將毛細管柱或高效液相色譜柱分別接入到注射泵或高效液相色 譜體系，用甲醇衝洗柱體，製得毛細管矽膠整體柱骨架或高效液相色譜矽膠整體柱骨架；(e)將功能單體與交聯劑溶於三羥甲基氨基甲烷_鹽酸Tris-HCl緩衝溶液中；(f)在(e)通入氮氣除氧後加入模板分子；(g)隨後在(f)中加入引發劑和加速劑，立即渦旋混合均勻；(h)保持(g)在0_5°C，將緩衝溶液利用色譜泵淋洗(d)中已製備好的矽膠骨架， 然後整體柱骨架進行聚合反應；(i)聚合反應結束後，用氯化鈉溶液洗脫整體柱骨架上的模板蛋白，然後用三羥甲 基氨基甲烷-鹽酸Tris-HCl緩衝溶液衝洗整體柱至色譜基線平衡，就得到溫敏型蛋白質分 子印跡整體柱。步驟(a)中所述的矽烷化試劑是甲基三甲氧基矽烷，Y -甲基丙烯醯氧丙基三甲 氧基矽烷，四乙氧基矽烷，甲基三乙氧基矽烷，或氨丙基三甲氧基矽烷；兩種矽烷化試劑之 和與有機溶劑的體積比2 1至4 1，兩種矽烷化試劑的體積比是1 1-9 1;所述的 有機溶劑為甲醇或乙醇。步驟(b)中所述的催化劑硝酸的濃度為0. 8mol/L-l. 2mol/L ；矽烷化試劑與催化 劑的物質的量之比為4 1。步驟(e)所述的功能單體為N-異丙基丙烯醯胺NIPAAm、丙烯醯胺AAm或甲基丙烯 酸MAA ；所述的交聯劑為N，N-亞甲基雙丙烯醯胺MBAA ；緩衝溶液中功能單體的重量濃度為 8. 00-10. 57%，交聯劑的重量濃度0. 20-1. 60%。步驟⑴所述的模板分子為溶菌酶lysozyme ；模板分子於緩衝溶液中的重量濃度 為2. 30-5. 00%，並在0-5°C下緩慢振蕩4小時。步驟(g)所述的引發劑為過硫酸銨APS，加速劑為N，N，N'，N'-四甲基 乙二胺TEMED ；緩衝溶液中引發劑的重量濃度為0. 10-0. 20%，加速劑的重量濃度為 0. 025-0. 25%o步驟(h)所述的整體柱骨架放於25_38°C環境中聚合5_12小時。步驟(i)所述的氯化鈉溶液的重量濃度為0.012-0. 029%;三羥甲基氨基甲烷-鹽酸Tris-HCl緩衝溶液的pH為7. 00-8. 00_。一種上述方法製備的溫敏型蛋白質分子印跡整體柱。 上述的溫敏型蛋白質分子印跡整體柱的應用，用於選擇性分離模板蛋白質。本發明的優點為(1)利用溫和的一步法製備矽膠整體柱骨架，避免了傳統溶膠-凝膠(sol-gel)法 製備矽膠基質的整體柱材料時需經過水解縮聚、陳化、乾燥、老化和表面再修飾等一系列復 雜的製備步驟；(2)利用溫敏型水凝膠針對溶菌酶製備特異性識別的溫敏型蛋白質印跡整 體柱，在整體柱骨架上留有與溶菌酶分子體積大小、結構、極性相匹配的孔穴；(3)該整體 柱具有溫度敏感性，可以通過調節分離時的溫度選擇最佳色譜分離條件；(3)去除蛋清中 溶菌酶時，只有溶菌酶能夠進入孔穴，而其它的雜質分子不能進入孔穴，使得材料主要吸附 溶菌酶，而對於其它蛋白吸附很少；(4)其用於蛋清中的溶菌酶的去除中可以提高去除的 選擇性，減少低豐度蛋白的損失；(5)與現有的去除溶菌酶方法比較，本發明材料生產成本 低、操作過程簡便、容易實現規模化生產。


圖1合成的矽膠骨架的掃描電鏡圖。圖2溫敏型溶菌酶印跡整體柱對溶菌酶的識別效果。以溶菌酶作為模板分子製備 的溫敏型蛋白質分子印跡整體柱在最佳液相色譜模式下，對溶菌酶(1)和細胞色素C(2)混 合物中溶菌酶的選擇性分離。
具體實施方式實施例1一種蛋白質印跡材料，可按如下步驟製備(a)將1. 2ml矽烷化試劑加入到甲醇中，混合均勻，矽烷化試劑與甲醇的體積比是 3 1，兩種矽烷化試劑甲基三甲氧基矽烷和Y-甲基丙烯醯氧丙基三甲氧基矽烷的體積比 是7 1 ；(b)在(a)中加入濃度為1. 2mol/L的催化劑，混合均勻，其中，矽烷化試劑與催化 劑的用量比為41；(c)將(b)液體灌注到高效液相色譜不鏽鋼管柱中，模具兩端密封，在45°C溫度下 垂直放置20小時；(d)反應結束後，將不鏽鋼管柱接入到高效液相色譜體系，用甲醇衝洗柱體，製得 矽膠整體柱骨架；圖1為實施例1的不鏽鋼管柱中製備的矽膠骨架橫截面的掃描電鏡圖。 得到的整體柱結構均勻，通透性良好，(e)將功能單體與交聯劑溶於IOmMWpH 7. 10的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸 (Tris-HCl)緩衝溶液中，緩衝溶液中功能單體為NIPAAm (1. 0013g)，AAm (25. Omg)和 MAA (25. OyL),交聯劑 MBAA 的加入量為(21. Omg)；(f)在(e)通入氮氣除氧後加入模板分子溶菌酶(500mg)，並在0_5°C下緩慢振蕩 4小時；(g)隨後在(f)中加入引發劑APS (20. Omg)和加速劑TEMED (170 μ L)，立即渦旋混合均勻；(h)保持(g)在0_5°C，將緩衝溶液利用色譜泵淋洗(d)中已製備好的矽膠骨架， 然後將整體柱骨架放於30°C環境中聚合10小時；非印跡整體柱的製備，除了不加模板蛋白質分子外，其他步驟同上。(i)聚合反應結束後，用0. 5M的氯化鈉洗脫整體柱骨架上的模板蛋白，然後用pH 7. 10的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(Tris-HCl)緩衝溶液衝洗整體柱至色譜基線平衡，就得到 溫敏型蛋白質分子印跡整體柱。圖2是實施例1的以溶菌酶作為模板分子製備的溫敏型蛋白質分子印跡整體柱在 最佳液相色譜模式下，對溶菌酶和細胞色素C混合物中溶菌酶的選擇性分離。從圖中可以 看出該印跡整體柱對模板蛋白質表現出較強的保留。這說明本發明方法製備的分子印跡整 體柱具有良好的蛋白質印跡效果。實施例2一種蛋白質印跡材料，可按如下步驟製備(a)將1. 2ml矽烷化試劑加入到乙醇中，混合均勻，矽烷化試劑與甲醇的體積比是
2 1，兩種矽烷化試劑甲基三乙氧基矽烷和Y-甲基丙烯醯氧丙基三甲氧基矽烷的體積比 是9 1 ；(b)在(a)中加入濃度為1. Omol/L的催化劑，混合均勻，其中，矽烷化試劑與催化 劑的用量比為41；(c)將(b)液體灌注到毛細管柱中，模具兩端密封，在47°C溫度下垂直放置30小 時；(d)反應結束後，用甲醇衝洗柱體，製得矽膠整體柱骨架；(e)將功能單體與交聯劑溶於IOmMWpH 7. 10的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸 (Tris-HCl)緩衝溶液中，緩衝溶液中功能單體為NIPAAm (1. 0290g)，AAm (15. Omg)和 MAA (5. OyL),交聯劑MBAA的加入量為(15. 7mg)；(f)在(e)通入氮氣除氧後加入模板分子溶菌酶(370mg)，並在0_5°C下緩慢振蕩 4小時；(g)隨後在(f)中加入引發劑APS (15. Omg)和加速劑TEMED (75 μ L)，立即渦旋混 合均勻；(h)保持(g)在0_5°C，將緩衝溶液利用色譜泵淋洗(d)中已製備好的矽膠旨架， 然後將整體柱骨架放於27°C環境中聚合12小時；非印跡整體柱的製備，除了不加模板蛋白質分子外，其他步驟同上。(i)聚合反應結束後，用0. 5M的氯化鈉洗脫整體柱骨架上的模板蛋白，然後用pH 7. 10的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(Tris-HCl)緩衝溶液衝洗整體柱至色譜基線平衡，就得到 溫敏型蛋白質分子印跡整體柱。實施例3一種蛋白質印跡材料，可按如下步驟製備(a)將1. 2ml矽烷化試劑加入到乙醇中，混合均勻，矽烷化試劑與甲醇的體積比是
3 1，兩種矽烷化試劑四乙氧基矽烷和氨丙基三甲氧基矽烷的體積比是5 1 ；(b)在(a)中加入濃度為0. 8mol/L的催化劑，混合均勻，其中，矽烷化試劑與催化劑的用量比為41；(c)將(b)液體灌注到毛細管柱中，模具兩端密封，在50°C溫度下垂直放置12小 時；(d)反應結束後，用甲醇衝洗柱體，製得矽膠整體柱骨架；(e)將功能單體與交聯劑溶於IOmMWpH 7. 10的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸 (Tris-HCl)緩衝溶液中，緩衝溶液中功能單體為NIPAAm (1. 0513g)，AAm (20. Omg)和 MAA (10. OyL),交聯劑 MBAA 的加入量為(18. 9mg)；(f)在(e)通入氮氣除氧後加入模板分子溶菌酶(400mg)，並在0_5°C下緩慢振蕩 4小時；(g)隨後在(f)中加入引發劑APS (10. Omg)和加速劑TEMED (200 μ L)，立即渦旋混 合均勻；(h)保持(g)在0_5°C，將緩衝溶液利用色譜泵淋洗(d)中已製備好的矽膠骨架， 然後將整體柱骨架放於32°C環境中聚合8小時；非印跡整體柱的製備，除了不加模板蛋白質分子外，其他步驟同上。(i)聚合反應結束後，用0. 5M的氯化鈉洗脫整體柱骨架上的模板蛋白，然後用pH 7. 10的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(Tris-HCl)緩衝溶液衝洗整體柱至色譜基線平衡，就得到 溫敏型蛋白質分子印跡整體柱。
權利要求
一種溫敏型蛋白質分子印跡整體柱的製備方法，其特徵是，該方法包括如下步驟(a)將兩種矽烷化試劑加入到有機溶劑中，混合均勻；(b)在(a)中加入硝酸作為催化劑，混合均勻；(c)將(b)液體灌注到毛細管柱或高效液相色譜柱中，模具兩端密封，在40℃-50℃垂直放置12-36小時；(d)反應結束後，將毛細管柱或高效液相色譜柱分別接入到注射泵或高效液相色譜體系，用甲醇衝洗柱體，製得毛細管矽膠整體柱骨架或高效液相色譜矽膠整體柱骨架；(e)將功能單體與交聯劑溶於三羥甲基氨基甲烷烷-鹽酸Tris-HCl緩衝溶液中；(f)在(e)通入氮氣除氧後加入模板分子；(g)隨後在(f)中加入引發劑和加速劑，立即渦旋混合均勻；(h)保持(g)在0-5℃，將緩衝溶液利用色譜泵淋洗(d)中已製備好的矽膠骨架，然後整體柱骨架進行聚合反應；(i)聚合反應結束後，用氯化鈉溶液洗脫整體柱骨架上的模板蛋白，然後用三羥甲基氨基甲烷-鹽酸Tris-HCl緩衝溶液衝洗整體柱至色譜基線平衡，就得到溫敏型蛋白質分子印跡整體柱。
2.根據權利要求1所述的溫敏型蛋白質分子印跡整體柱的製備方法，其特徵在於，步 驟(a)中所述的矽烷化試劑是甲基三甲氧基矽烷，Y-甲基丙烯醯氧丙基三甲氧基矽烷，四 乙氧基矽烷，甲基三乙氧基矽烷，或氨丙基三甲氧基矽烷；兩種矽烷化試劑之和與有機溶劑 的體積比2 1至4 1，兩種矽烷化試劑的體積比是1 1-9 1;所述的有機溶劑為甲 醇或乙醇。
3.根據權利要求1所述的溫敏型蛋白質分子印跡整體柱的製備方法，其特徵在於，步 驟(b)中所述的催化劑硝酸的濃度為0. 8mol/L-l. 2mol/L ；矽烷化試劑與催化劑的物質的 量之比為4 1。
4.根據權利要求1所述的溫敏型蛋白質分子印跡整體柱的製備方法，其特徵在於， 步驟(e)所述的功能單體為N-異丙基丙烯醯胺OTPAAm、丙烯醯胺AAm或甲基丙烯酸 MAA ；所述的交聯劑為N，N-亞甲基雙丙烯醯胺MBAA ；緩衝溶液中功能單體的重量濃度為 8. 00-10. 57%，交聯劑的重量濃度0. 20-1. 60%。
5.根據權利要求1所述的溫敏型蛋白質分子印跡整體柱的製備方法，其特徵在於， 步驟⑴所述的模板分子為溶菌酶Iysozyme ；模板分子於緩衝溶液中的重量濃度為 2. 30-5. 00%，並在0-5°C下緩慢振蕩4小時。
6.根據權利要求1所述的溫敏型蛋白質分子印跡整體柱的製備方法，其特徵在於，步 驟(g)所述的引發劑為過硫酸銨APS，加速劑為N，N，N'，，N'-四甲基乙 二胺TEMEDjlW 溶液中引發劑的重量濃度為0. 10-0. 20%，加速劑的重量濃度為0. 025-0. 25%。
7.根據權利要求1所述的溫敏型蛋白質分子印跡整體柱的製備方法，其特徵在於，步 驟(h)所述的整體柱骨架放於25-38°C環境中聚合5-12小時。
8.根據權利要求1所述的溫敏型蛋白質分子印跡整體柱的製備方法，其特徵在於，步 驟(i)所述的氯化鈉溶液的重量濃度為0. 012-0. 029%;三羥甲基氨基甲烷-鹽酸Tris-HCl 緩衝溶液的PH為7. 00-8. 00。
9.一種權利要求1-8中任一項方法製備的溫敏型蛋白質分子印跡整體柱。
10. 一種權利要求9所述的溫敏型蛋白質分子印跡整體柱的應用，用於選擇性分離模 板蛋白質。
全文摘要
溫敏型蛋白質分子印跡整體柱及其製備方法和應用，本發明屬於高分子材料製備技術及其在蛋白質分離分析領域的應用，具體地說涉及一種新型蛋白質分子印跡整體柱。採用簡便溫和的方法合成無機矽膠整體柱骨架，繼而以蛋白質為模板，通過溫敏型功能單體和交聯劑在無機矽膠骨架表面接枝蛋白質印跡材料從而得到溫敏型蛋白質分子印跡整體柱。獲得的溫敏型蛋白質分子印跡整體柱具有較強的模板蛋白識別能力。本發明製備的溫敏型蛋白質分子印跡整體柱，將分子印跡的專一識別特性和整體柱的在線分離的特性相結合，操作簡單、條件溫和、成本低廉，為蛋白質組學研究提供了一種高豐度蛋白質去除的新方法。
文檔編號B01J20/30GK101816927SQ20101016031
公開日2010年9月1日 申請日期2010年4月30日 優先權日2010年4月30日
發明者何錫文, 張玉奎, 李文友, 秦磊 申請人:南開大學