用於質粒dna發酵的工藝的製作方法

2023-05-31 14:27:26

專利名稱：用於質粒dna發酵的工藝的製作方法
技術領域：
本發明涉及共價閉合環狀(ccc)重組DNA分子如質粒、粘粒、細菌人工染色體(BAC)、噬菌體、病毒載體及其雜交體的生產，特別是一種在發酵培養中高水平地生產所述DNA分子的方法。
背景技術：
本發明涉及共價閉合環狀(ccc)組合DNA分子的生產。這種分子在生物技術、轉基因生物體、基因治療、治療性接種、農業和DNA疫苗中是有用的。
考慮到本發明，對現有技術進行了檢索。大腸桿菌質粒早已經成為研究人員和業界使用的、唯一最重要的重組DNA分子來源。如今，隨著下一代生物技術產品(基因藥物和DNA疫苗)進入臨床試驗並最終進入醫藥市場，質粒DNA正變得愈發重要。質粒DNA疫苗可能尋求應用為用於病毒性、細菌性或寄生蟲性疾病的預防疫苗；用於製備高免疫球蛋白產品的免疫劑；用於感染性疾病的治療疫苗；或者作為癌症疫苗。質粒也可用於基因治療或基因替換應用，其中，在對患者給藥後從該質粒表達想要的基因產品。
現今，除了基本形式之外尚未規定FDA標準(參見FDA關於用於預防感染性疾病適應症的質粒DNA疫苗的意見，1996)。但是，在某一天，質粒DNA純度的國際標準可能相同於或非常相似於用於類似從大腸桿菌發酵生產的重組蛋白產品的那些，而且這樣的標準超出了從已建立方法可獲得的當前純度。更引人注目地，可接受的標準——每劑量＜100pg宿主基因組的DNA(參見FDA關於用於生產生物的細胞系表徵的意見，1993)低於當前可得到的純化質粒製品的水平(每1mg劑量100pg相當於每一千萬分之一)。
用於獲得質粒(通過細菌發酵)及其純化(例如，通過鹼裂解法(Birnboim，HC，Doly J.1979，Nucleic Acids Res.71513-1523))的基本方法是眾所周知的。初始地，將已發酵的細菌細胞膏再懸浮和裂解(應用氫氧化鈉和十二烷基硫酸鈉的組合)，然後通過加入酸的鹽(例如，醋酸鉀)來中和該溶液，使細菌DNA和多數細胞碎片沉澱。大量的超螺旋質粒DNA保留在溶液中，並帶有汙染的細菌RNA、DNA和蛋白質，以及大腸桿菌內毒素(脂多糖，或LPS)。然後通過過濾分離到可溶的部份並進行各種純化步驟，其可包括核糖核酸酶消化；色譜法(離子交換凝膠過濾，羥基磷灰石，凝膠過濾，疏水作用，反相，HPLC，等)；滲濾；有機提取，選擇性沉澱，等等。
明顯地，提高原料的純度和獲得較好下遊純化是產業規模化製造臨床級別DNA的基本目標。
發酵培養基的考慮平衡培養基的設計是基於細胞能量要求和元素組成。一般地，以基本培養基或半合成培養基來滿足營養的要求。
半合成培養基含有複合成分如酵母提取物、酪蛋白胺基酸、蛋白腖。複合成份的添加供給了生長因子、胺基酸、嘌呤和嘧啶且經常支持更高的細胞密度。
碳佔一半的細胞組成。因此，碳屬於最高的數量。碳源提供能量和生物量，而且常常被用作限制性營養物。葡萄糖是常規的碳源。它被非常有效地代謝，並因此給予更高的細胞產率。但是，由於代謝溢流(稱為克雷布特裡效應)，高濃度的葡萄糖導致不想要的醋酸鹽產物。也可使用甘油，而且在分批培養基中它經常是優選的碳源。儘管從甘油獲得的細胞產量略為少於從葡萄糖獲得的，但是甘油不會引起那麼高水平的醋酸鹽產物，而且可以較高濃度使用而無抑制性。甘油還支持降低最大特異性生長速率。
用無機或有機氮源可以滿足氮的要求。氨水和銨鹽(例如，NH4Cl，(NH4)2SO4)可用於基本培養基。半合成培養基從複合成份，包括酵母提取物、酪蛋白胺基酸和蛋白腖，部分或者全部地提供氮。
礦物質是生長、代謝和酶反應所必需的。一般鎂、磷、鉀和硫作為獨特的培養基成份而被添加。磷酸二鉀和單鉀鹽提供了鉀和磷，而且還具有一定比例的緩衝劑功能。硫酸鎂七水合物常被用作鎂和硫的來源。其它基本礦物質包括鈣、銅、鈷、鐵、錳、鉬和鋅。這些都需要較小的數量，而且常通過添加痕量礦物質溶液來提供，儘管它們通常作為主成分中雜質而存在。用氯化鈉調節摩爾滲透壓(osmolarity)。
由於朊病毒(prion)或病毒汙染的風險，在質粒生產中使用動物源產品尤其是牛源產品是不可接受的。所有的培養基成份必須是證明無動物產品的。許多有動物起源的成份已經有蔬菜源替代品(例如，蔬菜甘油，大豆蛋白腖)。
質粒發酵工藝生長速度應用降低生長速度是高質量、高產量質粒發酵中統一的原則。高生長速度是與醋酸鹽產物、質粒不穩定性和較低百分比超螺旋質粒相關的。通過提供用於質粒複製以同步細胞分裂的時間，降低生長速度減輕了生長速度依賴性的質粒不穩定性。
生長條件發酵使我們有能力控制和監視許多影響質粒質量和產量的參數。已知超螺旋受氧氣和溫度的影響(Dorman CJ等1988 J.Bacteriol 1792816-2826)，(Goldstein E，Drlica K.1984 Proc Natl Acad Sci USA.814046-4050)。氧氣已表現出在質粒穩定性方面發揮作用。一項研究(HopkinsDJ，Betenbaugh MJ，Dhurjati P.1987 Biotechnol Bioeng.2985-91)發現，一滴溶解氧氣濃度達到5％空氣飽和度導致質粒穩定性的快速喪失。另一項研究(Namdev PK，Irwin N，Thompson BG，Gray MR.1993 Biotechnol Bioeng.41666-670)表明，在氧氣輸入方面的波動導致質粒的不穩定性。而且，缺口質粒和多聚體的形成可由許多參數影響，包括溫度、pH、溶解氧、營養物濃度和生長速度(Durland RH，Eastman EM.1998 Adv Drug Deliver Rev.3033-48)。大腸桿菌生長的最佳溫度為37℃。但是，在分批發酵中可應用較低的溫度(30-37℃)以產生降低最大特異性生長速度。還可應用較高溫度(36-45℃)以誘導帶有一些複製源起點如pUC和pMM1的選擇性質粒擴增(Wong EM，Muesing MA，Polisky，B.1982 Proc Natl Acad Sci USA.793570-3574)，(Lin-Chao S，Chen WT，Wong TT.1992 Mol Microbio.63385-3393)以及失控複製子R質粒。Hamann等2000年(Hamann CW，Nielsen J，Ingerslev E.2000世界專利申請WO0028048)報導了一種R質粒的生產工藝，其中將質粒生產維持於低水平(藉助應用低溫)以避免因質粒DNA合成的生長遲滯；一旦宿主細胞種群較高，質粒生產由移位的溫度誘導。
分批發酵分批發酵具有簡易性的重要優點。在整個培養周期中用於細胞生長和質粒生產的所有營養物存在於接種期。分批發酵包括遲緩期、指數生長期和靜止期。應用合適的接種物(1-5％的培養基容量)將減少遲緩期的長度。在指數期，所用的營養成分都是過量的；因此特異性生長速率基本上是最大的特異性生長速率，μmax，如用Monod動力學所測算的。如上所述，降低生長速率是質粒生產所希望的。在分批發酵中，生長速率可以僅通過減少μmax而降低。這種情況已通過在較低溫度生長和通過在代替葡萄糖的甘油上生長而取得。在30℃應用甘油的分批發酵一般導致μmax≤0.3h-1，這足以防止有害的醋酸鹽積蓄以及與質粒不穩定性相關的生產速率(Thatcher DR，Hitchcock A，Hanak JAJ，Varley DL.2003美國專利號6503738)。還可以比葡萄糖更高的濃度且沒有抑制性地使用甘油，產生更高的生物量產量。通常，用分批發酵可以獲得高達60g/L DCW的生物量產量。
補料分批發酵補料分批發酵對質粒生產是非常有用的。控制限制性營養物的添加使得生長速率控制為速率＜μmax。此外，補料分批發酵產生較高的產量。補料分批發酵的關鍵是以完全消耗掉的速率來供應底物。結果是，殘留的底物濃度約為零並且獲得底物的最大轉化。避免從過量底物產生的代謝溢流，減少抑制性醋酸鹽的形成。
補料分批發酵以分批期開始。將細胞接種至初始量的培養基，該培養基含有所有的非限制性營養物以及初始濃度的限制性底物。一旦細胞已消耗了初始量的底物，就開始控制限制性營養物的進料。
一種最簡單且最有效的進料策略是指數性進料。這種方法使得培養物以小於μmax的預定速率生長而無需反饋控制。該發酵以含有非抑制性濃度底物的分批方式開始。細胞以μmax生長直至底物被消耗盡，此時開始營養物的進料。
DO-stat和pH-stat方法是非常易於實施的，因為多數標準發酵罐系統包括了溶解氧和pH的監測。溶解氧(DO)和pH的趨勢可說明是否有底物可供給細胞。底物的耗盡引起氧氣攝取降低和培養基DO濃度升高。由於代謝酸的消耗，pH也升高。當DO或pH升高並高於設定的閾值時，啟動進料。通過改變DO或pH的閾值可調節生長的速率。
示例性質粒發酵工藝檢查當前的產量揭示出，一般的實驗室振蕩瓶培養產生從1-5mg的質粒DNA/每L培養物，而計算機控制發酵罐可產生，一般情況下，從10-250mg/L。
Lahijani等(Lahijani R，Hulley G，Soriano G，Horn NA，Marquet M.1996Human Gene Therapy 71971-1980)曾報導，在指數進料以及溫度從37℃至42-45℃轉換的發酵中，應用帶有溫度靈敏單點突變(pUC起點)的源自pBR322的質粒。他們在10L發酵罐中取得了220mg/L的質粒產量。在30℃分批發酵(pBR322衍生的起點)中沒有突變的相同質粒僅產生了3mg/L質粒。Friehs等(Friehs K，Flaschel E，Schleef M，Schmidt T.2003美國專利號6664078)描述了一種補料分批工藝，應用了具有DO-stat反饋控制進料的甘油酵母提取物培養基。發酵以7.5L的初始批量開始。增加攪拌以保持DO在30％之上。當DO達到閾值設定點的45％時，泵入進料培養基。在41小時後培養物達到靜止期，產生60g/LDCW和230mg/L質粒。Chen(Chen，W.1999美國專利號5955323)在半合成培養基中應用了補料分批工藝，並聯合了DO-stat和pH-stat反饋控制。DO和pH閾值設定點分別為50％和7.2。由於高代謝活性，當DO下降低於30％時，以早期速度的百分比增加攪拌速度。在一個7L發酵罐中，這種策略導致0.13h-1特異性生長速率和82-98mg/L質粒產量。Durland和Eastman，同上，1998年報導了在專用培養基中37℃的分比發酵。他們的工藝一般產生130mg/L而實際產生250mg/L那麼高的產率。
即使考慮了現有技術，仍然存在需要一種用於高純度質粒DNA生產的經濟有效的方法。上述的發酵培養基和工藝結合目前現有技術中已知的已改善質粒生產率，例如較低生長速率和高溫誘導的質粒複製數量。這些工藝處於約200-250mg質粒DNA/L。這種的產率對質粒DNA生產工藝的商業化增加了成本和純度負擔。儘管規模化經濟未來將顯著地降低DNA的成本，但是需要這種問題的更節省方案以實現理想的成本。而且，質粒DNA純度的國際標準可能相同於或非常相似於用於類似從大腸桿菌發酵生產的重組蛋白產品的那些，而且這樣的標準超出了從已建立方法可獲得的當前純度。提高發酵中的產率(mg DNA/g細胞膏)勢必降低成本並且提高DNA的純度(因為它減少了被處理材料的數量)。

發明內容
本發明是一種用於生產DNA複製子的方法，利用了用於質粒生產的改進的分批和補料分批工藝。更具體地說，本發明公開了一種補料分批發酵的方法，其中在補料分批期的期間含質粒的大腸桿菌是在降低溫度的條件下生長的，在該期間限制生長速率，然後在升溫的條件下溫度向上轉換並繼續生長以積蓄質粒，籍此溫度轉換和限制生長速率改善質粒的產率和純度。在優選的實施方案中，測定降低的生長速率以維持質粒的產率低於大約2mg/L/OD。在另一種優選的實施方案中，降低的溫度為30℃左右。在另一種優選的實施方式中，溫度向上轉換是至約36-45℃。在另一種優選的實施方案中，質粒包括Co1E1衍生的複製子起點。在另一種優選的實施方案中，質粒包括含有pUC G至A突變的、pMB1複製起點。在另一個優選的實施方案中，質粒衍生自VR1012骨架。在一種非常優選的實施方案中，發酵培養基基本上是半合成甘油培養基。在最終優選的實施方案中，在補料分批發酵中將源自pBR322的質粒生長於大腸桿菌，其中在分批進料期的時候限制生長速率並且繼續生長以積蓄質粒產物。總之，這些工藝的特點是高細胞密度培養策略，結合了新的生長和誘導期溫度轉換。在含有DNA複製子的源自pBR322起點的生產中，在限制細胞生長速率的條件下進行補料分批發酵。在溫度誘導DNA複製子(例如含有pUC或pMM1起點的質粒)的生產中，以限制細胞生長速率以及在生長期的時候降低溫度來進行補料分批發酵；然後由溫度向上轉換來誘導質粒生產。相對於現有技術中描述的工藝，這些工藝大大地改善了質粒DNA發酵產率，同時保持或改善質粒完整性。
發明概述本發明的目的和/或目標是提供用於質粒DNA生產的發酵工藝。本發明的另一個目標和/或目的是改善在發酵培養物中質粒DNA的生產產率。本發明的另一個目標和/或目的更是改善在發酵培養物中質粒DNA的質量。本發明的另一個目標和/或目的更是減少在純化質粒DNA中的雜質。另一個公開是改進的發酵工藝，與現有技術中確定的工藝相比，其改進為在生物量生產之後通過誘導質粒的水平來提高質粒的產率；在生物量生產過程中通過維持低質粒水平來改善產率和帶有有毒或不穩定質粒的完整性；通過減少缺口(開環的)或線性類型質粒的水平來提高質粒的質量；通過增加單體質粒的百分數來提高質粒的質量；應用機器人、自動控制參數和進料來簡化生產；由於生產控制而簡化了規模放大並且減少了在生長期間需要的氧氣補充；由於在進料遊中濃縮水平的質粒進入下遊處理而降低了質粒純化後的雜質水平；以及通過消除所有動物源產品的成分而改善法規依從性。
此外，從考慮附圖和隨後的說明角度而言，本發明的目的和優點就變得顯然。
附圖的簡要描述

圖1.表示在大腸桿菌中用NTC3019培養基的源於pBR322質粒的補料分批發酵。
圖2.表示在大腸桿菌中用NTC3018培養基的pUC質粒的分批發酵。
圖3.表示在大腸桿菌中用NTC3019培養基的gWiz GFP質粒補料分批發酵。
圖4.表示在大腸桿菌中用NTC3019培養基的gWiz GFP誘導的補料分批發酵(37℃或42℃誘導)。
圖5.說明誘導補料分批發酵工藝。
發明詳述現在說明附圖，圖1表示了在大腸桿菌中用NTC3019培養基的源於pBR322質粒的補料分批發酵，表明(a)在大腸桿菌中用NTC3019培養基的補料分批發酵過程中，源於pBR322質粒的一般生長和生產率的情況；和(b)通過NTC3019培養基的補料分批發酵工藝而生產的質粒DNA是高度超螺旋的，而且沒有缺口和開環的異構體。
在圖2中，表示的是在大腸桿菌中用NTC3018培養基的pUC質粒(pW2.0)分批發酵的質粒生長和生產率情況。在分批發酵中的pW2.0達到57OD600的細胞密度並且產率為230mg質粒/L。
在圖3中，表示的是在大腸桿菌中用NTC3019培養基的gWiz GFP質粒補料分批發酵(a)gWiz GFP補料分批發酵狀況的生長和控制參數情況(溶解氧、溫度、攪拌)；(b)被SYBR Green I染色的細胞螢光顯微鏡圖顯示了在坪階段(左)的發酵，然而當溫度降至33℃(右)時，生長重新開始並且成絲減少。
在圖4中，表示的是在大腸桿菌中用NTC3019培養基的gWiz GFP誘導的補料分批發酵(37℃或42℃誘導)a揭示了在35小時具有30→37℃轉換的gWiz-GFP/大腸桿菌DH5α發酵的生長和質粒生產率情況，質粒產率達到670mg/L；和(b)表明了在35小時具有30→42℃轉換的gWiz-GFP/大腸桿菌DH5α發酵的生長和質粒生產率情況。質粒產率達到1100mg/L。
在圖5中，說明了誘導的補料分批發酵。
定義ccc共價閉合環狀源於Co1E1的起點通過缺失(例如，源自pBR322的起源)和/或鹼基變化(例如來自pMB1的pUC，來自pMM1、pMM5的Co1E1，等)從Co1E1類型質粒(例如pMB1，Co1E1)衍生的複製起點。
DNA複製子質粒，粘粒，細菌人工染色體(BAC)，噬菌體，病毒載體及其雜種。
NTC3018發酵培養基甘油半合成分批發酵培養基NTC3019發酵培養基甘油半合成補料分批發酵培養基pDNA質粒DNA源自p322起點自pBR322的pMB1起點，其中rop(引物的抑制物)基因已被缺失。
質粒質粒，粘粒，細菌人工染色體(BAC)，噬菌體，病毒載體及其雜種。
pUC起點源自pBR322的起點，在升溫時具有增加複製數的G到A轉換半合成甘油培養基含有複合氮源(例如酵母提取物，大豆提取物)和甘油碳源的發酵培養基本發明涉及在細菌生產宿主中、應用機械發酵容器生產共價閉合環狀(ccc)重組DNA分子如質粒、粘粒、細菌人工染色體(BAC)、噬菌體、病毒載體及其雜種(這裡通稱為質粒)的方法。
在現有技術中描述的發酵工藝並非最佳的，其具有非最佳的質粒產率、質量(例如，質粒的缺口或線性化)、較差的可規模性(例如，由於過量的氧氣補充要求)以及受限的應用(例如，沒有能力使用含有不穩定或毒性序列的質粒)。本發明是一種在發酵培養過程中改善質粒DNA產率和純度的方法。已經開發了一種經濟有效的高產率發酵方法，利用了誘導補料分批發酵的工藝來改善質粒產率和純度。
質粒生產工藝和培養基優選的實施方案在一種用於源於pBR322質粒生產的優選實施方案中，補料分批發酵是以受限細胞生長速率進行的。相對於現有技術中描述的工藝，這種工藝極大地提高了質粒DNA發酵產率，同時維持或改善質粒的完整性。
這種工藝使用了中等的複製質粒(例如，帶有缺失ROP基因的pBR322複製起點，這裡被稱為源於pBR322的質粒)，用自動補料分批發酵工藝、於37℃控制進料以維持特定的生長速率0.12h-1已經實現250-450mg/L的質粒產率和120OD600的細胞密度。這比報導的產率(Lahijani等，同上，1996)提高了100倍。這種全新的巨大改進的分子基礎還不清楚。無論何種機理，將本發明應用於其它質粒的生產將增加發酵的生產率，而不喪失質粒的質量。
在一個溫度誘導DNA複製子(例如，含有pUC或者pMM1起點的質粒)生產的優選實施方案中，在生長期過程中以受限的細胞生長速率和降低的溫度來進行補料分批發酵；然後用溫度向上轉換來誘導質粒生產。相對於現有技術報導的工藝，本工藝極大地提高了質粒DNA發酵的產率，同時維持或改善質粒的完整性。
這裡所公開的這種全新的策略，用於含有高複製起點(例如，pUC起點)的質粒的高產率質粒生產，導致預料不到的高質粒生產率和質粒質量。此外，在補料分批階段過程中降低了生長速率。該工藝表示在圖5中。這種全新的因素組合尚未被應用到源自Co1E1起點質粒的生產，並且當檢驗時產生了新的且預料不到的改進生產率的結果。因此，我們教導了一種新的用途(改進生產率)，用於降低生產速度與1)生長和生物量生產的降低溫度，和2)質粒生產誘導升高溫度的組合。
初始降溫生產階段與隨後的高溫生產階段的組合導致改善的全部的生長、生物量和質粒產率，該發現是全新的且預料不到的，並且在現有技術中沒有教導的。Hamann等，同上，2000年使用了溫度誘導發酵以在生長過程中特別地減少與R質粒相關的代謝負荷。該策略被用於R質粒的生產，而沒有被教導用於含有Co1E1起點的質粒。Hamann等，同上，2000年也沒有涉及用這種策略提高總的生產率。因此，在現有技術中還沒有建議這種因素的組合來提高產率。如通過提高生產率所揭示的，在這種組合之中有協同作用，該組合大於各部分之和。該高產率發酵還滿足了長期渴望但沒有解決的需要，因為在過去十幾年中描述的眾多早期工藝沒有教導高產率發酵。總之，我們教導了一種新的因素組合，用於含有Co1E1起點的質粒的生產，包括與溫度誘導相組合的慢生長，這證實了預期不到而且令人驚奇的、改進質粒生產率的新用途。
將誘導補料分批發酵工藝應用於高複製質粒的生產，結果是產率為1100mg/L質粒DNA，以及OD600為100。這是超過現有技術中所述發酵工藝獲得產率的五倍提高。從所有這些工藝純化的DNA是高質量的，基本上是100％超螺旋。我們考慮了這裡所述的分批和補料分批發酵工藝的用途以提高質粒的生產率。
這裡所述的誘導補料分批工藝在整個工藝的生物量生產階段中保持了較低的質粒水平(對於源於VR1012的載體，＜2mg/L/OD600)，並且有利於在生物量生產之後預料不到的且前所未有的超高質粒生產(對於源於VR1012的載體，＞6mg/L/OD600)。高的特定產率是非常理想的，因為提高每克細菌的質粒產量直接導致較高的最終產品純度。我們考慮了利用本發明的溫度轉換來整個生長中保持質粒水平較低(對於源於VR1012的載體，＜2mg/L/OD600)，促使在生物量生產之後質粒生產至高水平(對於源於VR1012的載體，＞3mg/L/OD600)。這些水平是生產源於VR1012載體的準則。在生產階段，可允許其它質粒以高於或低於2mg/L/OD600的水平。對於本領域的普通技術人員而言，任一新的質粒在生長階段最大的質粒水平，即維持可接受的代謝負荷、質粒穩定性以及在溫度轉換之後提高生產率的水平，可實驗上確定。
發酵培養基的可選擇實施方式在實施本發明中，可以利用示例性不含動物產品的發酵培養基製劑、NTC3018(分批)、NTC3019(補料分批)。這些培養基優化為半合成生長培養基，含有甘油碳源、酵母提取物氮源、和微量金屬、鹽以及緩衝劑。可以預見的是，應用這裡所述的發酵工藝，現有技術中描述的那些用於這種培養基的替代品為也可產生提高的質粒生產率。
本發明考慮了用於NTC3018和NTC3019培養基中的可選擇的非動物源的氮源。作為一種複合培養基成份，酵母提取物提供了氮、胺基酸、維生素和碳。在質粒生產過程中對於細胞代謝非常重要的、複合培養基(例如，酵母或大豆的提取物)的可能成份包括限制的胺基酸、維生素、微量礦物質和可選擇的碳源。通過實施例的方式，我們考察了可選擇的酵母提取物製品、大豆製品(例如，來自BD Biosciences的精製大豆腖(selectsoytone)或者植物蛋白腖(phytone peptone))或者其它的植物製品(例如，來自Oxoid的豌豆花蛋白腖)在NTC3018和NTC3019培養基中的用途。
本發明也考慮了培養基限定元素中變化。例如，本發明考慮了增加磷酸鹽或鎂，在分批培養基成分中增加，或者在補料分批發酵中加至進料。發酵領域技術人員根據系統成分的評價可進行所述培養基的進一步優化。
當利用某些營養缺陷細胞系時，本發明考慮了培養基的添加劑。例如，含有proAB缺失的細胞系如Stb12(InVitrogen公司)需要胺基酸補充，或富有脯氨酸的可選擇氮源，以取得最大的生長。這種修飾可由發酵領域中普通技術人員來確定。
我們還考慮了這裡所述分批和補料分批發酵工藝與現有技術中描述的質粒發酵培養基一起使用。這包括合成培養基諸如Soubrier所公布的(Soubrier F.2004美國專利申請2004/0142452)。與本發明補料分批發酵工藝一起使用的、優選的培養基是甘油培養基製劑，其具有半合成飼料，如NTC3019和在Lahiiani等，同上，1996年，Friehs等，同上，2003年，Chen同上，1999年和Urthaler等(Urthaler J，Roman N，Ascher C，WoehrerH.2005美國專利申請2005/0026177)中所公布的那些。
發酵工藝可選擇的實施方式這裡公開了用於質粒生產的、改進的補料分批和分批工藝。這些工藝具有指數進料策略的特點，結合了全新的生長和誘導階段溫度轉換。
在實施本發明的補料分批工藝中，我們考慮了各種進料策略以降低生長速率，包括反饋、前饋和營養物進料的預定控制。例如，根據碳限制指數進料策略，添加營養物飼料。我們預料了這種進料策略的變化來將生長速率控制在可接受的範圍內。優選的生長速率範圍為μ＝0.05至0.3hr-1。優選的目標生長速率為μ＝0.12hr-1。可接受的生長速率範圍是質粒特異性的，而且可由本領域技術人員實驗上確定。
在實施本發明的補料分批工藝中，我們考慮了各種分批策略以減少生產時間。可以調節在分批階段中包括的半合成營養物，以使分批階段進行至更高的或生物量的濃度。在更高的生物量濃度的情況下，總發酵時間被減少，因為與補料分批階段相比，在分批階段中的生長更快。我們預期了這種分批策略的變化，以控制工藝的補料分批階段的開始。開始補料分批階段的優選OD600範圍為從1至60。可接受的補料分批開始的OD600範圍可以是質粒特異性的，並且可由本領域技術人員實驗上確定。
在實施本發明的誘導補料分批和分批工藝中，我們考慮了從生長到誘導階段的各種溫度轉換策略。該生長階段可被完成於從25-37℃，優選地30-37℃的溫度。對於高複製質粒，該生長階段最優選的為30-32℃。該誘導階段可被完成於從33-45℃，優選地37-42℃的溫度。
在實施具有溫度轉換策略的誘導工藝中，我們考慮了使用營養物濃度、生物量濃度或光密度作為何時從生長階段轉換至誘導階段的指示物。發酵培養的定期取樣可提供材料以獲得生物量或光密度測定，並且可在一定的生物量濃度實現溫度轉換。也可以使用在線傳感器以提供生物量濃度的連續檢測，而且可將發酵罐設為在特定的生物量濃度自動地實現溫度轉換。在實施具有溫度轉換策略的誘導補料分批工藝中，我們還考慮了一旦已加入了某一數量的加料營養物就實現溫度轉換。
在實施具有溫度轉換策略的誘導工藝中，我們考慮了在生長階段應用較高的溫度以最小化生產時間。這裡所述的誘導補料分批工藝，在該工藝的整個生長階段，都維持較低的質粒水平(＜2mg/L/OD600)。在生長階段可應用的最高溫度，即維持可接受的代謝負荷、質粒穩定性，以及在溫度轉換之後提高生產率的溫度，是質粒特異性的而且在不同的質粒骨架之間變化。例如，在高於2mg/L/OD600的水平，有些質粒可以是允許的。質粒產率還可以在低溫變化，這樣，有些質粒可以不作為高水平的質粒而產生。在這些情況下，我們考慮了在生長階段使用較高的溫度。此外，在初始分批階段，由於非限制生長和相應的較低質粒拷貝數量，所以提高最高溫度可以是允許的(圖5)。在生長階段(分批和補料分批成份)可應用的最高溫度，即維持可接受的代謝負荷、質粒穩定性，以及在溫度轉換之後提高生產率的溫度，可由本領域的普通技術人員實驗上確定。
質粒和宿主菌株我們考慮了本發明在帶有各種複製起點的質粒的生產中的用途，該複製是高拷貝、低拷貝和中拷貝，並且是溫度誘導的或者不是。在表1中概括了一些優選的複製起點及結合其的質粒。這些起點的修飾在現有技術中是已知的，而且也被考慮使用。
表1複製起點

pVC0396為優化的載體骨架，用於插入真核表達框。
本發明考慮了可選擇的宿主菌株。大腸桿菌DH5α菌株已被廣泛用作質粒生產的宿主。它的關鍵品質包括recA突變，其最小化克隆DNA的非特異性重組，和endA1突變消除由核酸內切酶I產生的質粒非特異性消化。除了DH5α，其它的各種菌株也適於質粒生產；表2中表示的是示例性大腸桿菌宿主菌株的非限制性列表。
表2宿主菌株

DH5α、XL1-Blue、DH10B、JM109和前十個已被很好地確立為質粒生產菌株。最近已開發了Mach1和ECOS101，而且它們是理想地質粒生產宿主。Stb12、GT116和Sure細胞已被用於生產含有不穩定DNA的質粒。不穩抖DNA含有如直接的(例如，逆轉錄病毒的長端重複)或反轉重複(例如，shRNA回文對稱)、Z DNA等的結構。在GT 116中dcm基因的缺失消除了免疫刺激的dam甲基化。因此，在GT 116中生產減少了質粒DNA的免疫原性。使用表達CpG甲基化酶的菌株觀察到類似的減少免疫原性。
不穩定質粒的生產我們也考慮了本發明在含有不穩定序列質粒的生產中的應用。迴文序列，直接的或反轉的重複，以及形成Z DNA的序列是不穩定的和缺失的或者由大腸桿菌宿主重排。在一些實例中，治療性用途的質粒必須含有不穩定的序列(病毒載體的反轉的或直接的重複，該病毒載體如AAV和HIV、形成Z DNA的某些治療性基因的片段或三倍重複)。維持含有不穩定序列的質粒的當前策略是使用帶有穩定突變的宿主細胞系。幾種宿主商業上可以獲得，用於增殖這些質粒，例如Sure細胞(Stratagene)、GT115(Invivogen)或Stb12以及Stb14(Invitrogen)。Stb12和Stb14細胞系利用了未公開的突變，該突變增加了含有直接重複的載體如逆轉錄病毒載體的穩定性；在降低溫度時這種作用被增強，大概是因為減少了拷貝數。修復突變的特異性組合可穩定質粒的增殖，特別是較低的溫度時。Sure和Sure2細胞系使用了一種這樣的組合，其具有UV修復(uvrC)和SOS修復(umuC)缺陷(來穩定LTR)、和SbcC(和recJ)與同源性重組缺陷(recB，recJ)聯合以穩定Z DNA。GT 116細胞系使用了SbcC和SbcD來穩定迴文序列。這些菌株僅在較低溫度(即30℃)發揮穩定質粒的功能，大概是由於減少了質粒拷貝數。這種策略顯然增加了生產成本。這裡所述的誘導發酵工藝的用途允許在穩定化細胞系中在30℃增殖不穩定質粒，先於僅在收穫前的較短持續時間增加拷貝數。這樣將使不穩定質粒的產率和穩定性(即質量)最大化。
DNA和質粒的生產在誘導補料分批工藝中顯著增加質粒DNA產量(＞6mg/L/OD600)的潛在機制是未知的。可能是由於在較慢生長和降低溫度下生物量生產過程中DNA壓縮(coompaction)劑(例如，組蛋白樣蛋白或其它染色質結合蛋白，如dps基因產品)的誘導。
在誘導階段，改變DNA縮合可通過提高可允許質粒的水平或拷貝數增加質粒產率。DNA的壓縮程度是由兩個相反的因素確定的；縮合染色質蛋白和脫縮合轉錄複合體。質粒壓縮可被來自質粒啟動子的轉錄水平影響。較少的轉錄是與較高的壓縮、以及可能更高的攜帶能力相關的。
在大腸桿菌中，已經鑑別了許多染色質蛋白，它們涉及DNA壓縮。這些基因產品結合質粒和基因組DNA。在基因組DNA的情況中，它們將DNA壓縮至類核(綜述於(Robinow C，Kellenberger E.1994 MicrobiolReview 58211-232))。該類核的主要成份是組蛋白樣蛋白HU、IHF和HN-S、StpA(相關於HN-S，以大約1/10水平表達)和Dps，其被均勻地分布於該類核中，而其它的蛋白，如SeqA、CbpA、CbpB、Fis和IciA，數量較少，表現為非均勻的分布於類核中，並且可具有調節功能。一種被分離的R質粒蛋白複合體包括三個主要蛋白，23％HN-S、23％RNA聚合酶和5％HU。這可能改變對生長期的依賴，原因是基因產品相關的染色質在不同培養基、不同細胞密度以及處於生長與靜止期被差別地調節。Fis、HU、HF-I通常在對數階段被更高地表達，而IHP和Dps則在靜止期處於較高的水平。Dps在靜止期將DNA縮合至脂質生物結晶複合體，以改善應激抗性。HN-S在生長期的過量表達導致DNA縮合以及生命力喪失。當DNA被高度壓縮時，細胞可具有更高的質粒容量。在NTC誘導發酵工藝中，生長期細胞比誘導期細胞具有更低的生產質粒DNA的能力。這是由於在存在於誘導期的染色質蛋白組合中的不同，該誘導期比生長期允許更高水平的可容許質粒。在誘導期改變染色質蛋白的比率可增加質粒的壓縮性，以及攜帶能力。
在誘導期改變染色質蛋白的比率還可增加質粒的複製率。例如，來自pl5A起點RNAII啟動子的表達，而不是pMB1(pBR322)RNAII啟動子的，用IHF表示；在IHF突變體中增加了pl5A RNAII轉錄。Dps和HU是非特異性DNA結合物，HN-S、CbpA和CbpB結合彎曲DNA。StpA是與HN-S相關的，以更高的親合力結合DNA，而且還結合彎曲DNA。Fis、IHF、IciA和seqA是序列特異性的。HN-S抑制從含有彎曲DNA的許多啟動子轉錄。pMB1(pUC和pBR322)的RNAII啟動子包含聚A和聚B軌跡；這些序列形成彎曲DNA。在靜止期抑制轉錄(例如，HN-S)的彎曲DNA結合染色質蛋白的降低水平是與RNAII至RNAI轉錄的增加比率相關，而且記錄的靜止期在質粒拷貝數方面增加。在NTC發酵工藝的生產階段中存在的染色質蛋白組成變更(例如，在HN-S中進一步減少)可導致質粒拷貝數隨著pMB1質粒如pUC而增加。
異源性DNA壓縮子，例如桿菌屬的酸溶性孢子蛋白，當被表達在大腸桿菌時，也可以是有用的DNA壓縮子以提高質粒產率。例如，纖小桿菌(B.subtilis)的小酸溶性蛋白在大腸桿菌中的表達產生DNA(Setlow B，Hand AR，and Setlow P.J Bacteriol.1731642-1653)。
工藝變更還可通過在DNA縮合中的作用提高產率。由鎂(Mg++)濃度調節Dps；Dps的存在並不導致DNA縮合；當Mg++濃度降低至閾值之下時緊密壓縮的結晶DNA:Dps複合體形成]綜述於(Frenkiel-Krispin D，Levin-Zaidman S，Shimoni E，Wolf SG，Wachtel EJ，Arad T，Finkel SE，KolterR，Minsky A.2001 EMBO J.201184-1191)]。形態學上，該複合體類似於在靜止期由加入氯黴素誘導的。在不存在Dps的條件下，將0.2mM亞精胺加至在生長的培養物，加速DNA縮合。磷酸鹽飢餓具有相同的作用，可能是通過增加從蘇氨酸和精氨酸降解至亞精胺(FrenMel-Krispin等，同上，2001)。在誘導期對發酵組成或條件的改變，以改變二價陽離子的水平(例如，Mg++，通過外源性添加或者缺失)，或改變帶正電的聚胺水平(例如，亞精胺，通過外源性添加或者控制細菌合成)可提高質粒產率並且可被視為對培養基的變更。
我們考慮了進一步的產率增加可通過質粒DNA的進一步壓縮而獲得。這可以通過如下方式而取得，在發酵工藝中，將DNA壓縮劑加至補料(例如聚乙撐亞胺、亞精胺、精胺)或者提高宿主菌株DNA壓縮劑生產如精胺生長或dps蛋白生產的菌株修飾。這種菌株修飾可以是在發酵工藝中使相關基因產品被誘導的變更。
在實施誘導工藝中，我們考慮了使用替換策略以在生長階段維持質粒拷貝數為較低的水平。例如，除了在較低溫度生長之外，可存在能夠結合至生長階段的其它機理以減少拷貝數。例如，發酵期間減少溶氧能減少質粒拷貝數(Carnes AE，2005 BioProcess International 39，在出版中)。
對最終產品純度的改進我們考慮了從示例性的質粒純化工藝中的所述發酵培養物利用質粒富積補料流。這種工藝是現有技術中熟知的。高產率發酵和示例性純化工藝的組合可提供經濟有效的方法學以進一步將基因組DNA減少至可接受的水平用於基因治療和DNA疫苗應用。
實施例在下面的實施例中進一步說明本發明的方法。這些是通過說明的方式來提供的，並非要以任何方式來限制本發明的範圍。
實施例1NTC3018和NTC3019發酵培養基確立下列的標準用於評價製造質粒DNA的優化發酵工藝
1)質粒的高特異性產率(mg質粒DNA每g細胞質量)；2)高生物量產率；3)它將保留高程度的超螺旋質粒；4)它在下遊處理中引起最小的問題；5)它符合法規的要求；和6)它保留質粒的結構(例如，無缺失或其它重排)。
配製培養物的培養基以支持高特異性質粒產率、高生物量產率以及高質粒質量。設計分批發酵培養基以降低特異性生長速率。降低生長速率的使用是與較高質粒拷貝數以及較好的質粒穩定性相關的。在補料分批發酵過程中，由限制營養物補料控制生長速率在0.12hr-1。宿主菌株，DH5α，具有endA1、recA和relA突變，對於質粒生產都非常重要。此外，用於培養基的所用成份可以很好地表徵且證明不含動物產品。
NTC3018(分批)和NTC3019(補料分批)培養基對於分批和補料分批工藝培養基的許多成份都是優化的。例如，甘油被用作碳源而不是葡萄糖，以降低生長速率。酵母提取物被用作氮源。微量金屬和MgSO4濃度已被優化，基於大腸桿菌生產菌株的規定要求。
實施例2具有源於pBR322質粒的NTC3019培養基補料分批培養在New Brunswick BioFlo 110發酵罐中於37℃完成補料分批發酵。通過自動添加30％氫氧化銨或10％磷酸控制pH。校準溶氧探針，氮氣噴射為0％和空氣飽和為100％。以1VVM對容器充氣並通過比例-積分控制攪拌將溶氧維持在30％。當細胞密度高於約20OD600時，還需要O2補充以維持30％飽和度。
種子培養始於單個分離菌落接種至LB加50μg/ml卡那黴素，並在37℃生長。在中間-指數階段(0.5-1.5OD600)，將種子培養用於為發酵罐提供1％接種物。
在補料分批培養中，根據碳限制指數加料策略，添加半合成補料營養物。簡言之，在分批階段，以特定生長速率μmax消耗碳底物的初始量。在耗盡碳底物後，補料分批階段開始，並且自動添加補料營養物，以如下方程確定的速率(Carnes，同上，2005)F(t)=XBVBSfYX/Sei]]>這裡μ＝在補料分批階段想要的特定生長速率，XB＝在分批階段結束時生物量濃度，gDCW/L，VB＝培養物的初始液體容積，L，Sf＝在營養物補料培養基中限制性底物濃度，g/L，YX/S＝來自底物的生物量產率係數，g/g，t＝自開始補料分批階段的時間。
一般地，在帶有幾種獨立卡那黴素抗性源於pBR322質粒的NTC3019培養基中補料分批發酵可達到100-120OD600、或55-65g幹細胞重每升的細胞密度(圖1)。質粒產率平均為260mg/L並已達到如430mg/L那麼高。通過比較，用源於pBR322質粒的已公布發酵產率在3-4mg/L級別上(Lahijani等，同上，1996)。
非常重要地，特異性質粒產率是非常高的，一般在2.5和3.8mg/L/OD600之間，遠超過了用其它發酵培養基/工藝使用更高的拷貝pUC起點質粒所觀測到的水平(表3)。以特定產率mg/L/OD600表示質粒產率，這說明質粒數量與總細胞質量有關。高的特異性產率是非常想要的，因為增加每克細菌的質粒產率直接地就導致更高的最終產品純度。
表3用已公布的高產率發酵工藝的特異性質粒產率的對比

這證明了，相對於現有技術中描述的培養基和工藝，NTC3019發酵培養基大大地提高了中等-拷貝數質粒(例如具有rop缺失的pBR322)的發酵產率。這種效果不是質粒特異性的。
從這些工藝純化的DNA是高品質的，基本上是100％超螺旋，沒有可檢測到的缺失或其它重排。而且，利用這種工藝的細胞，已經實現了1克規模的DNA純化。這證實了，在NTC3019補料分批培養基中進行的發酵有助於大規模下遊處理。
實施例3具有高拷貝基因治療質粒的NTC3018培養基分批發酵實施具有pUC起點質粒的NTC3018培養基分批培養。利用了下列含有pUC起點的質粒1)pW2.0，pUC19衍生物，具有改變的多接頭(polylinker)序列。
2)pMaxGFP3)pEGFP-Cl在New Brunswick BioFlo 110發酵罐中於37℃完成分批發酵。通過自動添加30％氫氧化銨或10％磷酸控制pH。校準溶氧探針，氮氣噴射為0％和空氣飽和為100％。以1VVM對容器充氣並通過比例-積分控制攪拌將溶氧維持在30％。當細胞密度高於約20OD600時，還需要O2補充以維持30％飽和度。
種子培養始於單個分離菌落接種至LB加50μg/ml卡那黴素或100μg/ml氨苄西林，並在37℃生長。在中間-指數階段(0.5-1.5OD600)，將種子培養用於為發酵罐提供1％接種物。
所有的發酵都在37℃進行。對於pW2.0，質粒拷貝數是由發酵之後在42℃的生長來誘導。但是，特異性質粒產率結果是令人鼓舞的。pEGFP-Cl的最終產量為56OD600的細胞密度和產率為163mg質粒/L(2.9mg/L/OD600)，pMaxGFP細胞密度16OD600和產率為84mg質粒/L(5.3mg/L/OD600)，以及對於pW2.0細胞密度57OD600和產率為230mg質粒/L(4.0mg/L/OD600；圖2)。
從這些工藝純化的DNA是高品質的，基本上是100％超螺旋，沒有可檢測到的缺失或其它重排。而且，利用這種工藝的細胞，已經實現了0.5克規模的DNA純化。這證實了，在NTC3018分批培養基中進行的發酵有助於大規模下遊處理。
實施例4具有高拷貝基因治療質粒的NTC3019培養基補料分批發酵選擇質粒gWiz GFP(Gene Therapy Systems)用於補料分批發酵評估，所述質粒gWiz GFP是一種含有GFP基因的Vical VR1012載體。這是被廣泛使用的卡那黴素抗性(kanR)含有pUC起點的DNA疫苗質粒，大小為5757bp。將質粒gWiz GFP(Gene Therapy Systems)轉化進入大腸桿菌DH5α。在補料分批培養中還檢驗了pMaxGFP；獲得了兩種質粒的相似結果。
當使用NTC3019來生產這些質粒時遇到了兩個問題。當37℃生長gWiz GFP質粒培養基時，如用源於pBR322質粒成功實現地取得的，發現了第一問題。用pUC質粒培養，細胞生長在大約15OD600時停止。螢光顯微鏡顯示廣泛的成絲，表示細胞分裂抑制。這是致命的，因為這些絲體最終裂解(Arends SJR，Weiss，DS.2004 J Bacteriol 186880-884)。例如，圖3(A)表示的是用質粒gWiz GFP的補料分批發酵。細胞生長慢了下來，似乎在15OD600早熟地進入靜止期。質粒產率分析表明，隨著細胞生長開始要停止，特異性質粒產率提高為2.7mg/L/OD600。pUC質粒包含溫度靈敏點突變，其可在拷貝數方面在42℃比在30℃表現30-40倍的增加(Lin-Chao等，1992)。然後將溫度降至33℃，試圖減少質粒拷貝數並因此減輕細胞上的代謝負荷，之後質粒降至1.6mg/L/OD600並且細胞生長重新開始。有趣的是，特異性質粒產率逐漸地再次上升，而且生長如所預料地在大約60OD600而不是生長至＞100OD600進入靜止期，即使還在添加補料營養物。
圖3(B)表示的是發生在37℃的細胞成絲。在溫度降至33℃之後，生長細胞的樣品顯示較少的成絲。
可能的解釋是，當37℃開始時細胞群體不能全部從成絲中恢復而且喪失了生命力。為了檢驗這種情況，在33℃完成了兩個帶有相同質粒的依次補料分批發酵。在兩個發酵中，培養在細胞密度＜60OD600達峰。
來自這些發酵的生物量和質粒DNA產率數據表明，在抑制細胞生長之前在特異性生長速率方面降低了和在特異性質粒產率方面急速提高了。在質粒內容物方面突然提高至這樣高的水平不是所預計的，並且在細胞群體上安置了代謝負荷，這可能是降低生長速率的起因。但是，它還表現了，在生長速率方面的降低常常導致在質粒拷貝數方面的增加(Satyagal VN，Agrawal P.1989 Biotechnol.Bioeng.331135-1144)、(Seo JH，Bailey JE.1985Biotechnol.Bioeng.271668-1674)。還不清楚，預計不到的特異性質粒產率提高是否引起生長速度的降低，反之亦然，或者一種是否以複合的方式引起另一種。
實施例5用於以NTC3019培養基高產率生產高拷貝質粒的誘導補料分批工藝基於來自33℃和37℃發酵的結果(實例5)，設計了一種策略來克服在用pUC起點質粒的補料分批模式中觀察到的、預料不到的質粒增加。在誘導補料分批工藝中應用了DH5α中的質粒gWiz GFP。進行NTC3019補料分批發酵，如在實施例5中所概述的，除了培養是在30℃生長直至60OD600，此時將溫度轉換為37℃。在圖4A中顯示了令人驚奇的結果。在30℃生長至60OD600消除了生長停止的問題，並且培養最後超出了100OD600，總質粒產率為670mg/L。來自這種工藝樣品的純化DNA是高品質的，基本上是100％超螺旋，沒有可檢測到的缺失或其它重排。
在溫度轉換前的質粒產率在整個生長期保持較低，保持在2mg/L/OD600。這對比與從33℃或37℃發酵得到的結果。顯然地，在溫度轉換後的特異性質粒產率是非常高的，達到6.5mg/L/OD600，遠遠地超出了用其它發酵培養基/工藝所觀測到的水平(表3)。在30℃直至生長階段然後轉換至42℃的gWiz GFP發酵產生了1.1gm/L(11mg/L/OD600)的生產率產率(圖4B)。生產率坪與大量的細胞死亡不相關，因為多數的細胞是有生命力的。
為了減少補料分批階段持續的時間(通過將分批階段延至更高的OD600)而對NTC3019培養基的修飾(在分批培養基中甘油、酵母提取物和鎂增加四倍)在42℃誘導之後也產生了相似高的質粒產率，說明補料分批階段可以開始於較高的OD600而無質粒誘導的喪失。
已經生產了帶有各種pUC起點骨架的多重不同質粒，其包括不同的抗生素抗性基因以及原核元素的定向，在NTC3019中產率大於0.5gm/L，應用了在DH5α中30℃至42℃的誘導工藝。這些結果證明，誘導工藝對特定質粒不是特異性的。
還生產了gWiz-GFP質粒，在NTC3019中產率大於500mg/L，應用了在DH1細胞系中30℃至42℃的誘導工藝。這個結果證明了，誘導工藝對特定大腸桿菌菌株不是特異性的。
此外，利用來自這種工藝的細胞，已實現了1克規模的DNA純化。這證明了，在NTC3019補料分批培養基中進行的誘導發酵有助於大規模下遊的處理。
以特定的產率(mg/L/OD600)表示質粒的產率，表明質粒的數量相關於總細胞質量。這裡所述的誘導補料分批工藝在整個工藝的生長階段都維持較低(＜2mg/L/OD600)的質粒水平，而且有助於在生物量生產之後生產前所未有的超高質粒(6-11mg/L/OD600)。高的特定產率是非常理想的，因為提高每克細菌的質粒產量直接導致較高的最終產品純度。
這些結果證明了本發明的補料分批和分批發酵工藝的一般實用性以改進質粒DNA的生產率和質量。
因此，讀者應理解，本發明的生產工藝提供了用於改進質粒生產的方法。
儘管上面描述含有許多特定性，這些不應當被解釋為本發明的限制，而是作為它們的一種優選實施方式的示例。許多其它的變化是可能的。例如，誘導補料分批工藝可以與分批工藝整合，這樣，在NTC3018分批培養基中進行發酵直至營養無缺失，因此，源自NTC3019的補料分批培養基和誘導同時啟動。在這種實施方式中，使用了一些質粒，可以高達37℃進行生長階段，因為質粒拷貝數將隨著更高的生長速率而被減少。本領域的技術人員可以確定，在生長階段使細胞分裂的優化溫度，以及在補料分批階段保持質粒的誘導性。因此，本發明的範圍不應當由舉例的實施方式確定，而由附後的權利要求和它們法定等同物確定。
權利要求
1.一種用於補料分批發酵生產共價閉合超螺旋質粒DNA的方法，它包括如下步驟A)在補料分批階段，以降低的溫度生長含有質粒、粘粒或細菌人工染色體複製子的細菌細胞；和B)在補料分批階段限制生長速率；和C)用溫度向上轉換誘導質粒生產；和D)在升高溫度的條件下繼續生長以累積質粒產物；籍此所述的方法提高質粒的產率。
2.如權利要求1所述的方法，其中在所述補料分批階段所述降低的溫度確保維持所述質粒產率低於大約2mg/L/OD600。
3.如權利要求1所述的方法，其中在所述補料分批階段所述降低的溫度約為30℃。
4.如權利要求1所述的方法，其中所述溫度轉換是在36-45℃的範圍。
5.如權利要求1所述的方法，其中所述質粒含有源於ColE 1的複製起點。
6.如權利要求1所述的方法，其中所述質粒含有包括pUC G到A突變的pMB1複製起點。
7.如權利要求1所述的方法，其中所述質粒衍生自VR1012骨架。
8.如權利要求1所述的方法，其中所述發酵培養基基本上是半合成甘油培養基。
9.一種用於發酵生產共價閉合超螺旋質粒DNA的方法，它包括如下步驟A)在補料分批發酵培養基中生長含有源於pBR322的質粒、粘粒或細菌人工染色體複製子的細菌細胞；和B)在補料分批階段限制生長速率；和C)繼續生長以累積質粒產物；籍此所述的方法提高質粒的產率。
10.如權利要求9所述的方法，其中所述發酵培養基基本上是半合成甘油培養基。
全文摘要
為了確保未來DNA疫苗和DNA治療法的經濟可行性，需要改進質粒DNA生產技術。本發明描述了通用的方法，藉此可在發酵罐中顯著地增加質粒DNA的生產率。這些工藝以補料分批發酵策略為特徵，結合了新的生長和誘導階段溫度轉換。
文檔編號C12P19/34GK101076597SQ200580034956
公開日2007年11月21日 申請日期2005年8月16日 優先權日2004年8月19日
發明者亞倫·E·卡奈斯, 詹姆士·A·威廉士 申請人:自然科技公司