淨化沙丁胺醇和/或克倫特羅的方法及免疫親和色譜柱的製作方法

2023-05-31 18:43:31

專利名稱：淨化沙丁胺醇和/或克倫特羅的方法及免疫親和色譜柱的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種淨化沙丁胺醇和/或克倫特羅的方法及其專用免疫親和色譜柱。
背景技術：
隨著生命科學的發展，人們對生物體內的物質及其變化產生了越來越濃厚的興趣，而生物樣本的分析就成為探索和發現生命奧秘的必要手段。由於生物樣本成分複雜，待測物濃度較低，而且大多數取樣量很少，這就對分析方法的選擇性和靈敏度提出了更高的要求。免疫親和色譜(IAC，immunoaffinity chromatography)是一種將免疫反應與色譜分析方法相結合的分析方法。其高度選擇性和高親和性無疑使分析過程簡化。在獸藥殘留分析中，IAC最簡單而且最有效的應用方式是作為理化測定技術(如HPLC，GC/MS)的樣品淨化手段，這種聯用方法可使免疫學技術和理化技術在選擇性、分離能力、速度和靈敏度方面得到互補，並避免了免疫分析法(如ELISA，RIA)直接測定樣品的諸多不足。目前，該方法在抗體、激素、多肽、酶、重組蛋白、受體病毒及小分子化合物的分析中被廣泛應用。
沙丁胺醇(SAL)與克倫特羅(CL)都屬於苯乙醇胺類β-興奮劑，用於醫學臨床，主要用於擴張支氣管和增加肺通氣量，可治療支氣管哮喘、阻塞性肺炎、平滑肌痙攣和休克等症，在獸醫臨床用作牛、馬的產道鬆弛劑，如SAL用於平喘，CL作為子宮松馳劑等，近年來作為飼料添加劑，在畜牧業非法使用的情況越來越嚴重。
許多國家建立了沙丁胺醇與克倫特羅的殘留檢測方法並且多數國家都禁止其在動物生產過程中使用。有些國家執行最高殘留量(MRLs)限制，如英國規定的MRLs為0.5ng/g，荷蘭規定的MRLs為1ng/g。我國明確規定禁止CL、SAL及其製劑在食品動物的飼養過程中使用。
目前檢測沙丁胺醇與克倫特羅的方法主要有高效液相色譜法(HPLC-UV)、氣-質聯機法(GC-UV)、液-質聯機(LC-MS-MS)和酶聯免疫法(ELISA)等。這些方法的前處理利用液-液分配，常規的SPE柱淨化和分離，都在不同程度地存在著處理過程繁瑣、淨化效果差、有機溶劑浪費多、所需時間長等缺點。

發明內容
本發明的目的是提供一種淨化沙丁胺醇和/或克倫特羅的方法及其專用免疫親和色譜柱。
本發明所提供的淨化沙丁胺醇和/或克倫特羅的免疫親和吸附劑是由固相載體和與其偶聯的沙丁胺醇多克隆抗體或沙丁胺醇單克隆抗體組成；所述沙丁胺醇多克隆抗體或沙丁胺醇單克隆抗體是以沙丁胺醇半抗原與載體蛋白的偶聯物為免疫原得到的；所述沙丁胺醇半抗原是將沙丁胺醇完全溶於甲醇，然後將甲醇蒸乾，得到油狀物，溶解於無水乙醇中，在振蕩的同時加入琥珀酸酐，室溫振蕩反應3小時，便有白色混懸物出現，該白色混懸物即為半抗原。
所述載體蛋白可為牛血清白蛋白或卵清蛋白等常用載體蛋白。
沙丁胺醇是小分子物質，只有免疫反應性，沒有免疫原性，不能誘發機體產生免疫應答，必須與大分子載體蛋白偶聯後才具有免疫原性。本發明將沙丁胺醇(SAL)用琥珀酸酐醯化，接出了一個含4個碳的間隔臂形成半抗原，這樣突出了沙丁胺醇半抗原決定簇的特徵結構，有助於制出針對沙丁胺醇抗原特異性較強的抗體。再將沙丁胺醇半抗原採用混合酸酐法與載體蛋白偶聯得到免疫原。半抗原與載體蛋白的結合比例過低或過高都對免疫不利，半抗原與卵清蛋白(OVA)、牛血清蛋白(BSA)的結合摩爾比分別為12∶1和15∶1。
所述沙丁胺醇鼠單克隆抗體優選為對沙丁胺醇和克倫特羅都具有交叉反應的單克隆雜交瘤細胞株A-2-1 CGMCC No.1607分泌的單克隆抗體。
所述對沙丁胺醇和克倫特羅都具有交叉反應的單克隆雜交瘤細胞株A-2-1CGMCC No.1607已於2006年2月9日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC)。
所述固相載體可為纖維素、葡聚糖凝膠、聚丙烯醯胺凝膠、多孔玻璃、瓊脂糖凝膠、聚丙烯醯胺-瓊脂糖凝膠等，優選為Sepharose 4B。
所述免疫親和吸附劑可裝載入柱中製成免疫親和色譜柱，該免疫親和色譜柱也屬於本發明的保護範圍。
含有上述免疫親和吸附劑或免疫親和色譜柱的試劑盒也屬於本發明的保護範圍。
所述試劑盒中還包括洗脫液I和洗脫液II；所述洗脫液I為甲醇；所述洗脫液II為乙醇∶去離子水∶pH4.0的乙酸緩衝液的體積比為80∶15∶5的混合液。
所述試劑盒中還包括洗滌液、保存液；所述洗滌液為pH7.4，0.01mol/L的磷酸鹽緩衝液，所述pH7.4，0.01mol/L的磷酸鹽緩衝液為1L水中含磷酸二氫鉀0.27g，12水合磷酸氫二鈉2.86g，氯化鉀0.2g，氯化鈉8.8g；所述保存液為1L溶液中含有磷酸二氫鉀0.27g，12水合磷酸氫二鈉2.86g，氯化鉀0.2g，氯化鈉8.8g，NaN30.2g，pH7.4。
該免疫親和吸附劑基於免疫反應和色譜反應，適合從生物樣品(如動物尿液)中提純沙丁胺醇和克倫特羅，便於殘留分析。在該免疫親和吸附劑中，沙丁胺醇鼠單克隆抗體和沙丁胺醇兔多克隆抗體與溴化氰活化的Sepharose 4B的偶聯率分別是97.2±1.5％，96.7±1.5％，該沙丁胺醇多克隆抗體或對沙丁胺醇和克倫特羅都具有交叉反應的單克隆雜交瘤細胞株A-2-1 CGMCC No.1607分泌的單克隆抗體對克倫特羅有很高的交叉反應性，偶聯有對沙丁胺醇和克倫特羅都具有交叉反應的單克隆雜交瘤細胞株A-2-1 CGMCC No.1607分泌的單克隆抗體的免疫親和色譜柱對沙丁胺醇和克倫特羅動態柱容量分別為400ng/mL和419ng/mL，絕對柱容量分別為40ng/mgIgG和42ng/mg IgG，連續使用10次後柱容量降為總柱容量的55％左右，保存期為1年。
本發明所提供的淨化沙丁胺醇和/或克倫特羅的方法，包括以下步驟1)樣品的前處理動物尿樣將樣品用洗滌液稀釋10倍；動物組織在勻漿樣品中，加入0.01M鹽酸溶液，渦動3分鐘，3000g離心10分鐘，將得到上清液經0.2um的濾膜過濾後，用洗滌液稀釋10倍，得到樣品溶液；2)將步驟.1)得到的樣品溶液過免疫親和色譜柱，然後用去離子水洗滌，再用上述3ml洗脫液I和1ml洗脫液II同時洗脫，得到純化的沙丁胺醇和/或克倫特羅溶液。
本發明的免疫親和吸附劑具有高選擇性，使樣品前處理過程大大簡化，尤其適用於動物尿樣、肝臟、肌肉樣品中沙丁胺醇和/或克倫特羅的前處理，分析質量得到改善。免疫親和吸附劑的高選擇性使得沙丁胺醇和/或克倫特羅分析方法的檢測限將主要取決於取樣量，這是單純理化手段難以達到的；本發明的免疫親和吸附劑對待測組分有很強的保留和濃縮能力，只要加樣量不超過柱容量，在實測樣品條件下免疫親和吸附劑對組分的保留能力幾乎不受樣品體積或組分濃度的影響。本發明的方法對組分淨化的同時還可提供定性信息。本發明的方法水相操作，操作簡單，淨化效果好，免疫親和色譜柱能重複使用，能節省大量的有機溶劑，降低分析成本和環境汙染。本發明的提純方法結合色譜法高效檢測沙丁胺醇和克倫特羅的含量，彌補了單純免疫測定技術直接測定樣本的信息量太少、定量準確差，或理化方法選擇性低等不足，體現了免疫學技術和常規理化技術在分析機制的互補性。


圖1為沙丁胺醇和克倫特羅標準品的色譜2為在豬尿中沙丁胺醇和克倫特羅淨化樣品效果色譜圖
具體實施例方式
下述實施例中的實驗方法，如無特別說明，均為常規方法。
實施例1、淨化沙丁胺醇和/或克倫特羅的免疫色譜柱的製備1、沙丁胺醇多克隆抗血清的製備沙丁胺醇半抗原的合成將沙丁胺醇完全溶於甲醇中，在旋轉蒸發儀上將甲醇蒸乾，得到油狀物，振蕩溶解於20ml無水乙醇中，在振蕩的同時加入與沙丁胺醇同摩爾數的琥珀酸酐，室溫振蕩反應3小時，得到白色混懸物，即為沙丁胺醇半抗原。
免疫原的製備採用混合酸酐法將沙丁胺醇半抗原與蛋白質載體牛血清蛋白(BSA)或卵清蛋白(OVA)偶聯，製成BSA-SAL或OVA-SAL偶聯物，即免疫原。
動物免疫採用紐西蘭大白兔作為免疫動物，免疫劑量為1mg·ml-1BSA-SAL偶聯物。將紐西蘭兔子飼養數周后接種免疫，首次免疫用1ml完全弗氏佐劑乳化，加強免疫用1ml不完全弗氏佐劑乳化。每次免疫間隔2周，一共免疫8次，最後一次免疫不加佐劑直接耳靜脈注射，最後一次免疫7-10d後採血檢測，測定血清效價後，頸動脈放血，收集血清。所獲得的沙丁胺醇抗血清經競爭ELISA檢測，結果顯示對克倫特羅具有很高的交叉反應性。
2、多克隆抗血清的純化採用飽和硫酸胺鹽法(SAS)和DEME纖維素離子交換層析法純化抗血清。其具體步驟如下(1)SAS鹽析1)50％飽和度鹽析取上述製備的兔抗血清5ml，加等量0.01mol/L、pH7.4的PBS(1L溶液中含有磷酸二氫鉀0.27g，12水合磷酸氫二鈉2.86g，氯化鉀0.2g，氯化鈉8.8g)混勻，然後逐漸滴加等體積的飽和硫酸銨(pH7.4)溶液，邊加邊攪拌，室溫放置30min，3000g離心30min，棄上清液留沉澱。2)33％飽和度鹽析在步驟1)得到的沉澱中分別加入5ml 0.01mol/L PBS(1L溶液中含有磷酸二氫鉀0.27g，12水合磷酸氫二鈉2.86g，氯化鉀0.2g，氯化鈉8.8g)溶解沉澱，再加飽和硫酸銨溶液達到33％飽和度，邊加邊攪拌，室溫放置30min，棄上清液留沉澱。重複操作2次。3)脫鹽取0.01mol/L、pH7.4的PBS(1L溶液中含有磷酸二氫鉀0.27g，12水合磷酸氫二鈉2.86g，氯化鉀0.2g，氯化鈉8.8g)分別溶解步驟2)得到的沉澱，裝於透吸袋中，懸於盛有0.01mol/L、pH7.4的PBS(1L溶液中含有磷酸二氫鉀0.27g，12水合磷酸氫二鈉2.86g，氯化鉀0.2g，氯化鈉8.8g)的燒杯中脫鹽，放置於4℃，每天換液3-4次，1％BaCl2檢測直至透析液中無硫酸根離子為止。4)透析完畢，3000g離心5min，取上清液進行DEME-纖維素離子交換層析。
(2)DEME-纖維素離子交換層析1)DE-52纖維素的處理稱取2g DE-52纖維素粉末，置於盛有重蒸餾水的燒杯中，充分攪拌，靜置後去掉多餘溶液，然後加入0.5mol/LNaOH溶液，攪拌均勻，1h後布氏漏鬥抽濾，接著用重蒸水充分洗滌至中性。再用0.5mol/L HCl溶液以同樣的方法處理。最後換用0.5mol/L NaOH溶液處理一次，充分水洗至中性。2)平衡將經步驟1)處理的DE-52纖維素浸泡於0.01mol/L、pH7.4的PBS(1L溶液中含有磷酸二氫鉀0.27g，12水合磷酸氫二鈉2.86g，氯化鉀0.2g，氯化鈉8.8g)中，充分洗滌，靜置後去掉多餘溶液，如此反覆2-3次，直至上清液pH達到7.4為止。3)裝柱將平衡後的DE-52纖維素用滴管連續加入層析柱中，用洗脫液(1L溶液中含有磷酸二氫鉀0.27g，12水合磷酸氫二鈉2.86g，氯化鉀0.2g，氯化鈉8.8g，pH7.4)連續洗脫，充分流洗，直到流出液pH值與洗脫液的pH值相同為止。4)加樣將經步驟(1)SAS鹽析得到的抗體用0.01mol/L、pH7.4的磷酸鹽緩衝液(1L溶液中含有磷酸二氫鉀0.27g，12水合磷酸氫二鈉2.86g，氯化鉀0.2g，氯化鈉8.8g))稀釋，然後沿層析柱壁緩慢加入，打開層析柱出口，讓IgG稀釋液流入柱床內，再用磷酸鹽緩衝液衝洗柱壁。5)洗脫和收集加入洗脫液(1L溶液中含有磷酸二氫鉀0.27g，12水合磷酸氫二鈉2.86g，氯化鉀0.2g，氯化鈉8.8g，pH7.4)，每管2ml收集，邊收集邊用20％磺基水楊酸檢測IgG洗脫情況。6)測定IgG溶液在280nm和260nm處的OD值，結果表明純化後的兔多克隆抗體的濃度為27mg/mL。
3、沙丁胺醇鼠單克隆抗體的製備免疫原的製備採用混合酸酐法，將沙丁胺醇半抗原與蛋白質載體牛血清蛋白(BSA)偶聯，製成BSA-SAL，即免疫原。
動物免疫採用BALA/C小鼠作為免疫動物、以上述沙丁胺醇半抗原與蛋白質載體的偶聯物BSA-SAL為免疫原，免疫劑量為100μg/只，加等體積的完全弗氏佐劑乳化，進行首次免疫。兩周後，取同樣量免疫抗原加不完全弗氏佐劑，乳化，進行第二次免疫。間隔兩周，進行第三次免疫，方法同第二次免疫。再隔兩周，進行第四次免疫，方法同第二次免疫。融合前3天再對BALB/C小鼠加強免疫一次，腹腔注射100μg抗原，不加佐劑。融合前摘眼球放血，獲得陽性血清，然後將小鼠拉頸脫臼處死，取脾臟。
細胞融合脾細胞按5∶1比例與SP2/0骨髓瘤細胞進行細胞融合。
雜交瘤細胞克隆化採用有限稀釋法篩選雜交瘤細胞，直到得到完全同質的對沙丁胺醇與克倫特羅都具有交叉反應性的單克隆抗體和穩定的單克隆雜交瘤細胞株-對沙丁胺醇與克倫特羅都具有交叉反應性的單克隆雜交瘤細胞株A-2-1 CGMCCNo.1607。對沙丁胺醇與克倫特羅都具有交叉反應性的單克隆雜交瘤細胞株A-2-1CGMCC No.1607已於2006年2月9日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC)。
單克隆雜交瘤細胞的保存在液氮-20℃下保存，使用時37℃水浴快速解凍。
單克隆抗體大量生長及提純採用體內誘生法，將BALB/c小鼠腹腔注入滅菌石蠟油，7-14天後腹腔注射對沙丁胺醇與克倫特羅都具有交叉反應性的單克隆雜交瘤細胞株A-2-1 CGMCC No.16075×105-106個/只，7-10天後採集腹水。
4、單克隆抗體的純化採用辛酸-飽和硫酸銨法純化單克隆抗體。其具體步驟如下取上述方法腹腔注射對沙丁胺醇與克倫特羅都具有交叉反應性的單克隆雜交瘤細胞株A-2-1 CGMCC No.1607得到的腹水5mL，加入0.06mol/L、pH4.0的NaAc-HAc緩衝液10mL，攪拌均勻，用1mol/L NaOH溶液調pH至7.2。在室溫下邊攪拌邊加入165μL辛酸，攪拌30min。在4℃6000g離心30min，取上清液，用1mol/L NaOH溶液調pH至7.2。然後在4℃條件下，邊攪拌邊加入15mL飽和硫酸銨溶液，使硫酸銨的最終質量百分含量為50％，攪拌30min後，在4℃6000g離心30min，棄上清液，將沉澱懸浮於5.5mL 0.01M pH7.2的PBS(1L溶液中含有磷酸二氫鉀0.27g，12水合磷酸氫二鈉2.86g，氯化鉀0.2g，氯化鈉8.8g)中。將沉澱懸浮液邊攪拌邊加入4.5mL飽和硫酸銨溶液，此操作在4℃條件下完成。此時硫酸銨終濃度為45％，攪拌30min後，4℃6000g離心30min，棄上清液，將沉澱懸浮於1mL 0.01M pH7.2 PBS中。將沉澱懸浮液裝入透析袋中，用0.01M pH7.2 PBS透析，4～6小時換液一次，換液2～3次。用紫外分光光度計測定IgG溶液在280nm和260nm處的OD值，得到對沙丁胺醇與克倫特羅都具有交叉反應性的單克隆雜交瘤細胞株A-2-1 CGMCCNo.1607分泌的單克隆抗體，純化後的IgG在-20℃冰箱保存。
5、免疫色譜柱(IAC)的製備基質的準備取溴化氰活化的Sepharose 4B幹凍粉，在盛有1.0mmol l-1HCl的G3漏鬥中膨脹。
抗體IgG的準備用0.1mol/L的NaHCO3溶液將純化的兔多克隆抗體或對沙丁胺醇與克倫特羅都具有交叉反應性的單克隆雜交瘤細胞株A-2-1 CGMCC No.1607分泌的單克隆抗體稀釋至適宜濃度，調溶液的pH值為8.4。
偶聯反應將膨脹的溶膠用0.1mol/L的NaHCO3溶液平衡後，轉入上述兔多克隆抗體或沙丁胺醇單克隆抗體溶液中，混合，4℃下緩慢攪拌20-24hr。偶聯率的檢測結果表明，兔多克隆抗體與溴化氰活化的Sepharose 4B的偶聯率是96.7±1.5％，對沙丁胺醇與克倫特羅都具有交叉反應性的單克隆雜交瘤細胞株A-2-1 CGMCC No.1607分泌的沙丁胺醇單克隆抗體與溴化氰活化的Sepharose 4B的偶聯率是97.2±1.5％。
活化位點的封閉將上述偶聯後的凝膠轉入盛有0.1mol/L、pH8.0的Tris-HCl緩衝液中，混合，4℃下緩慢攪拌2hr，以封閉未偶聯的活化位點。
洗滌凝膠用5倍體積的0.1mol/L、pH4.0醋酸鹽緩衝液和0.1mol/L、pH8.0Tris-HCl緩衝液交替衝洗3次。用0.01mol/L、pH7.4的PBS(1L溶液中含有磷酸二氫鉀0.27g，12水合磷酸氫二鈉2.86g，氯化鉀0.2g，氯化鈉8.8g)平衡後，抽乾的凝膠轉入0.01mol/L、pH7.4的含0.1％NaN3磷酸鹽緩衝液(1L溶液中含有磷酸二氫鉀0.27g，12水合磷酸氫二鈉2.86g，氯化鉀0.2g，氯化鈉8.8g，NaN31g)中，4℃下存放備用。
裝柱將偶聯有沙丁胺醇多克隆抗體或沙丁胺醇單克隆抗體的免疫吸附劑轉入到含G3濾板的層析柱裡，製成偶聯有沙丁胺醇多克隆抗體或沙丁胺醇單克隆抗體的免疫色譜柱(IAC柱)。
6、IAC柱容量的確定將步驟5製備的偶聯有沙丁胺醇多克隆抗體或沙丁胺醇單克隆抗體的免疫色譜柱，用20ml 0.01mol/L、pH7.4的PBS(1L溶液中含有磷酸二氫鉀0.27g，12水合磷酸氫二鈉2.86g，氯化鉀0.2g，氯化鈉8.8g)洗柱，輕輕上下晃動IAC柱，趕走柱裡的氣泡，再以10ml 0.01mol/L、pH7.4的PBS(1L溶液中含有磷酸二氫鉀0.27g，12水合磷酸氫二鈉2.86g，氯化鉀0.2g，氯化鈉8.8g)平衡。將含有100ng·ml-1沙丁胺醇或克倫特羅的PBS(1L溶液中含有磷酸二氫鉀0.27g，12水合磷酸氫二鈉2.86g，氯化鉀0.2g，氯化鈉8.8g)連續加到IAC柱，自然重力下流出。當柱達到飽和後(流出液中沙丁胺醇或克倫特羅濃度和加樣液濃度相同)，用20ml去離子水洗滌，除去提取液中幹擾雜質。最後用用3ml甲醇與1ml分析純乙醇∶去離子水∶pH4.0的乙酸緩衝液的體積比為80∶15∶5的混合液將沙丁胺醇和克倫特羅洗脫，自然重力下流出，收集，吹乾，進行GC/MS測定。計算出動態柱容量和絕對柱容量。動態柱容量(dynamic column capacity)是指每毫升免疫吸附劑(或柱床體積)對待測物的最大吸收值。絕對柱容量(specific column capacity)是指每毫克固定抗體對待測物的最大結合容量。結果表明偶聯有沙丁胺醇鼠單克隆抗體的免疫親和色譜柱對沙丁胺醇和克倫特羅動態柱容量分別為400ng/mL和419ng/mL，絕對柱容量分別為40ng/mg IgG和42ng/mg IgG，實施例2、偶聯有沙丁胺醇兔多克隆抗體或對沙丁胺醇與克倫特羅都具有交叉反應性的單克隆雜交瘤細胞株A-2-1 CGMCC No.1607分泌的沙丁胺醇單克隆抗體的免疫色譜柱的試劑盒的製備及其對沙丁胺醇和/或克倫特羅的淨化效果1、淨化沙丁胺醇和/或克倫特羅的試劑盒的製備主要由盒體，免疫色譜柱(IAC柱)，沙丁胺醇、克倫特羅標準溶液，洗滌液，洗脫液I，洗脫液II，保存液，海綿託架所組成，海綿託架上設有孔和凹槽。海綿託架的凹槽內有裝有沙丁胺醇、克倫特羅標準溶液、洗滌液、洗脫液I、洗脫液II、保存液的試劑瓶，海綿託架的孔內裝有IAC柱。其中免疫色譜柱為實施例1製備的偶聯有沙丁胺醇多克隆抗體或對沙丁胺醇與克倫特羅都具有交叉反應性的單克隆雜交瘤細胞株A-2-1 CGMCC No.1607分泌的沙丁胺醇單克隆抗體的免疫色譜柱。
洗滌液為磷酸鹽緩衝液(0.01M，pH7.4)，配製方法為1L溶液中含有磷酸二氫鉀0.27g，12水合磷酸氫二鈉2.86g，氯化鉀0.2g，氯化鈉8.8g。
洗脫液I為色譜級的甲醇。
洗脫液II為分析純乙醇∶去離子水∶pH4.0的乙酸緩衝液的體積比為80∶15∶5的混合液。
保存液為1L溶液中含有磷酸二氫鉀0.27g，12水合磷酸氫二鈉2.86g，氯化鉀0.2g，氯化鈉8.8g，NaN30.2g，pH7.4。
將偶聯有沙丁胺醇多克隆抗體或單克隆雜交瘤細胞株A-2-1 CGMCC No.1607分泌的沙丁胺醇單克隆抗體的免疫色譜柱的試劑盒放在4℃，有效期為12個月。
2、沙丁胺醇和克倫特羅的淨化效果實驗IAC淨化原理是，將沙丁胺醇多克隆抗體或對沙丁胺醇與克倫特羅都具有交叉反應性的單克隆雜交瘤細胞株A-2-1 CGMCC No.1607分泌的沙丁胺醇單克隆抗體和惰性基質偶聯，製備免疫吸附劑，裝柱。當含待測的沙丁胺醇和/或克倫特羅的混合物流過IAC柱時，固定抗體選擇性地結合沙丁胺醇和/或克倫特羅，其它不被識別的樣品雜質則不受阻礙地流出IAC柱，經洗滌後，將抗原-抗體複合物解離洗脫，沙丁胺醇和/或克倫特羅得到淨化或分離。IAC柱經再生處理後可重複使用。
檢測樣品的處理取未接觸過沙丁胺醇和克倫特羅豬尿樣品2g(mL)，分別添加沙丁胺醇標準品和克倫特羅標準品，使沙丁胺醇和克倫特羅的終濃度均為10μg/mL，經上述試劑盒中所述的洗滌液稀釋10倍得到尿樣溶液；取未接觸過沙丁胺醇和克倫特羅豬肌肉、豬肝勻漿物樣品，分別添加沙丁胺醇標準品和克倫特羅標準品，使沙丁胺醇和克倫特羅的終濃度均為10μg/kg，然後分別加入10ml 0.01M鹽酸溶液，渦動3分鐘，3000g離心10分鐘，取上清液過0.20μM濾膜，濾液即為樣品溶液。
將偶聯有沙丁胺醇多克隆抗體或單克隆雜交瘤細胞株A-2-1 CGMCC No.1607分泌的沙丁胺醇單克隆抗體的免疫色譜柱平衡到室溫，用20ml上述試劑盒中的洗滌液衝洗，然後將上述的樣品溶液分別過柱，再用20ml去離子水洗滌，目的是為了除去非特異性吸附的雜質。用3ml上述試劑盒中的洗脫液I和1ml上述試劑盒中的洗脫液II共同洗脫，在45℃N2氣流下吹乾，然後進行GC/MS分析，測定沙丁胺醇和克倫特羅的含量，以沙丁胺醇和克倫特羅標準品(10μg/kg)為對照。IAC柱用20ml的保存液平衡保存在4℃冰箱裡備用。測定結果表明用IAC進行樣品淨化，不幹擾藥物色譜峰，能夠完全分離，說明製備的IAC非特異性吸附極小，其中，偶聯有雜交瘤細胞株A-2-1 CGMCC No.1607分泌的沙丁胺醇單克隆抗體的免疫色譜柱在添加10μg/kg濃度的沙丁胺醇和克倫特羅標準品的豬尿樣品中淨化效果如圖1和圖2所示。
權利要求
1.一種淨化沙丁胺醇和/或克倫特羅的免疫親和吸附劑，是由固相載體和與其偶聯的沙丁胺醇多克隆抗體或沙丁胺醇單克隆抗體組成；所述沙丁胺醇多克隆抗體或沙丁胺醇單克隆抗體是以沙丁胺醇半抗原與載體蛋白的偶聯物為免疫原得到的；所述沙丁胺醇半抗原是將沙丁胺醇完全溶於甲醇，然後將甲醇蒸乾，得到油狀物，溶解於無水乙醇中，在振蕩的同時加入琥珀酸酐，室溫振蕩反應3小時，便有白色混懸物出現，該白色混懸物即為半抗原。
2.根據權利要求1所述的吸附劑，其特徵在於所述固相載體為纖維素、葡聚糖凝膠、聚丙烯醯胺凝膠、多孔玻璃、瓊脂糖凝膠或聚丙烯醯胺-瓊脂糖凝膠，優選為Sepharose 4B。
3.根據權利要求1所述的吸附劑，其特徵在於所述沙丁胺醇單克隆抗體為沙丁胺醇鼠單克隆抗體；所述沙丁胺醇多克隆抗體為沙丁胺醇兔多克隆抗體。
4.根據權利要求3所述的吸附劑，其特徵在於所述沙丁胺醇鼠單克隆抗體為對沙丁胺醇和克倫特羅都具有交叉反應的單克隆雜交瘤細胞株A-2-1 CGMCC No.1607分泌的單克隆抗體。
5.根據權利要求1所述的吸附劑，其特徵在於所述載體蛋白為牛血清白蛋白或卵清蛋白。
6.裝載有權利要求1-5任一所述的免疫親和吸附劑的免疫親和色譜柱。
7.含有權利要求1-5任一所述的免疫親和吸附劑的試劑盒或含有權利要求6所述的免疫親和色譜柱的試劑盒。
8.根據權利要求7所述試劑盒，其特徵在於所述試劑盒中還包括洗脫液I和洗脫液II；所述洗脫液I甲醇；所述洗脫液II為乙醇∶水∶pH4.0的乙酸緩衝液的體積比為80∶15∶5的混合液。
9.根據權利要求8所述試劑盒，其特徵在於所述試劑盒中還包括洗滌液、保存液；所述洗滌液為pH7.4，0.01mol/L的磷酸鹽緩衝液，所述pH7.4，0.01mol/L的磷酸鹽緩衝液為1L中含有磷酸二氫鉀0.27g，12水合磷酸氫二鈉2.86g，氯化鉀0.2g，氯化鈉8.8g的溶液；所述保存液為1L溶液中含有磷酸二氫鉀0.27g，12水合磷酸氫二鈉2.86g，氯化鉀0.2g，氯化鈉8.8g，NaN30.2g，pH7.4。
10.一種淨化沙丁胺醇和/或克倫特羅的方法，包括以下步驟1)樣品的前處理動物尿樣將樣品用權利要求9所述的洗滌液稀釋10倍；動物組織在動物組織樣品勻漿物中，加入0.01M鹽酸溶液，渦動3分鐘，3000g離心10分鐘，將得到上清液經0.2um的濾膜過濾後，用權利要求9所述的洗滌液稀釋10倍，得到樣品溶液；2)將步驟1)得到的樣品溶液過權利要求6所述的免疫親和色譜柱，然後用去離子水洗滌，再用3ml權利要求8所述的洗脫液I和1ml權利要求8所述的洗脫液II同時洗脫，得到純化的沙丁胺醇和/或克倫特羅溶液。
全文摘要
本發明公開了一種淨化沙丁胺醇和/或克倫特羅的方法及其專免疫親和色譜柱。該淨化沙丁胺醇和/或克倫特羅的免疫親和色譜柱裝載有免疫親和吸附劑，該吸附劑是由固相載體和與其偶聯的沙丁胺醇多克隆抗體或單克隆抗體組成；所述沙丁胺醇多克隆抗體或沙丁胺醇單克隆抗體是以沙丁胺醇半抗原與載體蛋白的偶聯物為免疫原得到的。本發明的提純方法結合色譜法高效檢測沙丁胺醇和克倫特羅的含量，彌補了單純免疫測定技術直接測定樣本的信息量太少、定量準確差，或理化方法選擇性低等不足，體現了免疫學技術和常規理化技術在分析機制的互補性。
文檔編號G01N33/53GK1830546SQ200610007259
公開日2006年9月13日 申請日期2006年2月16日 優先權日2006年2月16日
發明者沈建忠, 何方洋, 王建平, 史為民, 吳聰明 申請人:中國農業大學