鬱金香苯丙氨酸解氨酶TfPAL蛋白及其編碼基因的製作方法
2023-06-22 19:05:21
鬱金香苯丙氨酸解氨酶TfPAL蛋白及其編碼基因的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種鬱金香苯丙氨酸解氨酶TfPAL蛋白及其編碼基因，所述蛋白質為如SEQ?ID?NO.2所示的胺基酸序列組成的蛋白質或如SEQ?ID?NO.2所示的胺基酸序列經過取代、缺失或者添加一個或幾個胺基酸且具有鬱金香苯丙氨酸解氨酶活性的蛋白質。本發明還提供了一種編碼上述蛋白質的如SEQ?ID?NO.1所示的核酸序列。本發明為今後利用基因工程技術調控鬱金香TfPAL基因的時空表達特性，從而調控花色提供了理論依據，具有實踐應用價值。
【專利說明】鬱金香苯丙氨酸解氨酶TfPAL蛋白及其編碼基因
【技術領域】
[0001]本發明屬於植物分子生物學領域，涉及鬱金香花色苷合成途徑中的關健酶及其編碼基因，具體涉及一種鬱金香苯丙氨酸解氨酶TfPAL蛋白及其編碼基因。
【背景技術】
[0002]苯丙氨酸解氨酶(Phenylalanine ammonia-1yase, PAL)為植物苯丙烷類物質代謝途徑的關鍵酶(Okada等，2008)，是連接初生代謝和次生代謝的紐帶，它在類黃酮、黃酮醇、花青素、單寧、異黃酮、黃烷酮、木質素、香豆素、芥子酸酯和水楊酸等次生代謝產物合成中起著重要作用，這些物質涉及植物生長發育、抗蟲抗病、信號轉導、紫外線防禦和花粉育性等方面(Dixon等，2002)，因此PAL與植物有著十分密切的關係，是近年來的研究熱點。
[0003]近年來，已有研究者對包括鳳仙花、尾穗莧、甜葉菊、甘薯、玉米、棉花和桃在內多種植物的PAL活性進行了研究，結果表明:(I)PAL的活性與植物花色苷含量明顯正相關。
(2)強光、激素、低溫、機械損傷及病蟲害侵染都可以誘異PAL活性升高。(3)PAL活性與組織中氮素含量呈負相關。具體到PAL活性與花色苷合成的關係，Arakawa認為，活性受光調節的PAL才是花色苷合成的關鍵酶(Arakawa 0，1988)。蘋果果皮中PAL活性的增加伴隨著花色苷含量的增加，但可能不是控制花色苷的唯一關鍵酶(周愛琴等，1997)。另有研究證實乙烯可以通過誘導PAL活性而提高花色苷合成量(Cheng G和Breen P, 1991)
[0004]PAL基因在植物中以多基因家族的形式存在，覆盆子中至少有2個基因成員，擬南芥中有4個成員，番爺中至少有26個,而馬鈴薯(Solanum tuberosum)中更多,估計有40~50 個(Chang 等 2008 Joos 和 Hahlbrock, 1992 ；Kumar 和 Ellis, 2001)。PAL 存在於所有綠色植物中，已從水稻、小麥、玉米等多種植物中得到分離純化，真菌和藻類細胞中也有發現(Heilmann 和 Mer fort, 1998)。但鬱金香(Tulipa fosteriana)中 PAL 基因的克隆及其表達模式尚不清楚。目前，未有任何與鬱金香PAL蛋白及其編碼基因序列相關的文獻報導。
【發明內容】
[0005]本發明的目的在於提供一種鬱金香苯丙氨酸解氨酶TfPAL蛋白及其編碼基因。本發明提供了一種鬱金香TfPAL蛋白序列，以及一種編碼上述蛋白質的核酸序列；公開了鬱金香TfPAL蛋白及其核苷酸序列在鬱金香不同器官、不同發育階段的表達模式；為今後利用基因工程技術調控鬱金香TfPAL基因的時空表達特性，從而主調控花色提供了理論依據，具有一定的應用價值。
[0006]本發明的目的是通過以下技術方案實現的，
[0007]第一方面，本發明涉及一種具有鬱金香苯丙氨酸解氨酶活性的蛋白質，所述蛋白質是由如SEQ ID N0.2所示的胺基酸序列組成的蛋白質；或由SEQ ID N0.2所示的胺基酸序列經過取代、缺失或者添加一個或幾個胺基酸且具有鬱金香苯丙氨酸解氨酶活性的由(a)衍生的蛋白質。該蛋白質在花朵花瓣的不同著色階段、不同器官內的有無及活性大小存在較大差異。[0008]優選的，所述蛋白質為SEQ ID N0.2所示胺基酸序列經過I~50個胺基酸的缺失、插入和/或取代，或者在C末端和/或N末端添加I~20個以內胺基酸而得到的序列。
[0009]進一步優選的，所述蛋白質為SEQ ID N0.2所示胺基酸序列中I~10個胺基酸被性質相似或相近的胺基酸所替換而形成的序列。
[0010]第二方面，本發明涉及一種編碼上述蛋白質的核酸序列。
[0011]優選的，所述核酸序列具體為:
[0012](a)鹼基序列如SEQ ID N0.1第I~2136位所示；
[0013]或(b)與SEQ ID N0.1第I~2136位所示的核酸有至少70%的同源性的序列；
[0014]或(c)能與SEQ ID N0.1第I~2136位所示的核酸進行雜交的序列。
[0015]優選的，所述核酸序列具體為SEQ ID N0.1第I~2136位所示的核酸序列中I~90個核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5』和/或3』端添加60個以內核苷酸形成的序列。
[0016]本發明提供的分尚出的DNA分子,該分子包括:具有SEQ ID N0.1所不核苷酸序列的DNA分子；或者編碼具有鬱金香TfPAL蛋白質活性的多肽的核苷酸序列，而且與SEQ IDN0.1所示序列有至少70%的同源性；或者能與SEQ ID N0.1所示序列的核苷酸序列雜交。
[0017]在本發明中，「分離的DNA」、「純化的DNA」是指，該DNA或片段已從天然狀態下位於其兩側的序列中分離出來，還指該DNA或片段已經與天然狀態下伴隨核酸的組分分開，而且已經與在細胞中相伴隨的蛋白質分開。
[0018]在本發明中，術語「鬱金香苯丙氨酸解氨酶TfPAL蛋白編碼基因」指編碼具有鬱金香TfPAL蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID N0.1所示核苷酸序列及其簡併序列。該簡併序列是指，位於SEQ ID N0.1所示序列中，有一個或多個密碼子被編碼相同胺基酸的簡併密碼子所取代後而產生的序列。由於密碼子的簡併性，所以與SEQ ID N0.1所示序列的同源性低至約70%的簡併序列也能編碼出SEQ ID N0.2所示的胺基酸序列。該術語還包括與SEQ ID N0.1所示序列中從核苷酸第I~2136位的核苷酸序列的同源性至少70%的核苷酸序列。
[0019]該術語還包括能編碼具有與天然的鬱金香TfPAL相同功能的蛋白的SEQ ID N0.1所示序列的變異形式。這些變異形式包括(但並不限於):通常為I~90個核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5』和/或3』端添加為60個以內核苷酸。
[0020]在本發明中，術語「鬱金香苯丙氨酸解氨酶TfPAL蛋白」是指具有鬱金香TfPAL蛋白活性的SEQ ID N0.2所示序列的多肽。該術語還包括具有與天然鬱金香TfPAL相關相同功能的、SEQ ID N0.2所示序列的變異形式。這些變異形式包括(但並不限於):通常為I~50個胺基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或為20個以內胺基酸。例如，在本領域中，用性能相近或相似的胺基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數個胺基酸通常也不會改變蛋白質的功能。該術語還包括鬱金香TfPAL蛋白的活性片段和活性衍生物。
[0021]本發明的鬱金香TfPAL多肽的變異形式包括:同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導突變體、在高或低的嚴謹條件下能與鬱金香TfPAL相關DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用鬱金香TfPAL多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。
[0022]在本發明中，「鬱金香TfPAL保守性變異多肽」指與SEQ ID N0.2所示序列的胺基酸序列相比，有至多10個胺基酸被性質相似或相近的胺基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據表1進行替換而產生。
[0023]表1
[0024]
【權利要求】
1.一種如下(a)或(b)的蛋白質: (a)由如SEQID N0.2所示的胺基酸序列組成的蛋白質； (b)SEQID N0.2所示的胺基酸序列經過取代、缺失或者添加一個或幾個胺基酸且具有鬱金香苯丙氨酸解氨酶活性的由(a)衍生的蛋白質。
2.如權利要求1所 述的蛋白質，其特徵是，所述蛋白質為SEQID N0.2所示胺基酸序列經過I~50個胺基酸的缺失、插入和/或取代，或者在C末端和/或N末端添加I~20個以內胺基酸而得到的序列。
3.如權利要求2所述的蛋白質，其特徵是，所述蛋白質為SEQID N0.2所示胺基酸序列中I~10個胺基酸被性質相似或相近的胺基酸所替換而形成的序列。
4.一種編碼如權利要求1所述蛋白質的核酸序列。
5.如權利要求4所述的核酸序列，其特徵是，所述核酸序列具體為: (a)喊基序列如SEQ ID N0.1第I~2136位所不； 或(b)與SEQ ID N0.1第I~2136位所示的核酸有至少70%的同源性的序列； 或(c)能與SEQ ID N0.1第I~2136位所示的核酸進行雜交的序列。
6.如權利要求4所述的核酸序列，其特徵是，所述核酸序列具體為SEQID N0.1第I~2136位所示的核酸序列中I~90個核苷酸的缺失、插入和/或取代，或者在5』和/或3』端添加60個以內核苷酸形成的序列。
【文檔編號】C12N9/88GK103695406SQ201310689303
【公開日】2014年4月2日 申請日期:2013年12月16日 優先權日:2013年12月16日
【發明者】袁媛, 史益敏, 唐東芹, 馬曉紅, 陶秀花 申請人:上海交通大學