檢測融合基因atic-alk相對表達量的方法和寡核苷酸的製作方法

2023-06-22 13:24:21

檢測融合基因atic-alk相對表達量的方法和寡核苷酸的製作方法
【專利摘要】本發明公開了定量檢測樣本中ATIC-ALK融合基因相對表達量的方法和寡核苷酸，通過利用檢測ATIC-ALK的上遊引物ATIC-ALK-F、下遊引物ATIC-ALK-R和探針ATIC-ALK-Probe以及檢測內參基因abl的上遊引物abl-F、下遊引物abl-R和探針abl-Probe，能夠對樣本中的ATIC-ALK融合基因相對表達量進行定量檢測，將融合基因相對表達量作為一種中間的輔助手段，有助為人類間變性大細胞瘤患者尋找最佳的治療方案。
【專利說明】檢測融合基因ATIC-ALK相對表達量的方法和寡核苷酸
【技術領域】
[0001]本發明屬生命科學和生物【技術領域】，涉及一種定量檢測樣本中融合基因ATIC-ALK相對表達量的方法和寡核苷酸，通過採用實時螢光定量PCR技術，能夠對樣本中的ATIC-ALK相對表達量進行定量檢測。
【背景技術】
[0002]間變性大細胞淋巴瘤(anaplastic large cell lymphoma, ALCL),是非霍奇金淋巴瘤中的一種獨立類型，由德國病理學家Stein等於1985年應用K1-1 (⑶30)抗體識別，常呈間變性特徵，被命名為間變性大細胞淋巴瘤。REAL分類將B細胞表型者歸為瀰漫性大B細胞性淋巴瘤。目前，ALCL只包括T表型和Null (非T非B)表型。對ALCL確切的病理機制尚知之不多，約60%-85%左右ALCL病例表達間變性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphomakinase, ALK)融合蛋白，這是由於2號染色體上的ALK基因位點的畸變所致。最常見的是t(2 ；5) (p23 ;q35)而形成融 合基因NPM-ALK，它是由位於5號染色體上的核仁磷酸蛋白B23(NPM)基因與位於2號染色體的ALK基因相融合形成，表達的融合蛋白為NPM-ALK蛋白；最近尚有更多的ALK基因與其他基因通過染色體轉位或者是染色體的倒轉而形成的融合基因被發現，如t (I ；2) (q25 ;p23)所形成的TPM3-ALK基因，t (2 ；3) (p23 ;q21)產生的TFG-ALKs 基因，TFG-ALKL 基因和 TFG-ALKxL 基因，inv (2) (p23 ；q35)所形成的 ATIC-ALK基因，t (2 ；17) (p23 ;q23)形成的 CLTCL-ALK 基因及 t (X ；2) (qlI ;p23)形成的 MSN-ALK基因。
[0003]ALK基因位於染色體2p23位點，正常情況下人源的ALK可轉錄產生大小6222bp的mRNA,由29個外顯子構成，編碼1620個胺基酸序列200kD的I型穿膜蛋白ALK，該蛋白為一種受體酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinase, RTK),是RTK胰島素超家族的成員。完整的ALK具有典型的RTK三部分結構，即胞外區、親脂性穿膜區和胞漿內酪氨酸激酶。據文獻報導，ALK蛋白除在極少部分瀰漫性大B細胞淋巴瘤中表達外，可在60%~85%的原發性系統性ALCL中表達，是原發性系統性ALCL相對特異的免疫表型特徵。
[0004]受體型酪氨酸激酶間變性淋巴瘤激酶(Anaplastic lymphoma kinase, ALK)最早發現於間變性大細胞淋巴瘤(ALCL)中，由2號及5號染色體易位所形成的融合蛋白質包含了 ALK的3』端胞內結構域，以及核磷蛋白(Nucleophosmin, NPM)的5』端的結構域。隨後的研究發現，正常的ALK專一表達於神經系統中，如腦和神經索，尤其是新生兒的腦中。
[0005]基因ATIC位於2號染色體的長臂35的位置(2q35)。正常情況下人源的ATIC基因可轉錄產生大小2084bp的mRNA,由16個外顯子構成。它所編碼的蛋白為5-氨基咪唑-4-甲酸胺的核苷酸甲酸轉移酶(5-aminoimidazole-4-carboxamide ribonucleotideformyltransferase/IMP cyclohydrolase,由 592 個胺基酸序列組成，分子量為 38kD,是一種調節細胞周期的雙功能蛋白，催化嘌呤合成的最後兩個途徑。該蛋白的N端結構具有催化磷酸氨基咪唑甲醯胺甲醯轉移的作用，C端結構具有IMP環，包含核定位信號以及二聚體結構域，可以產生大的同源二聚體及異源二聚體。該蛋白還與前核糖體顆粒運輸及核糖體生物發生，調節細胞分裂、DNA修復、轉錄和基因組穩定性相關聯。
[0006]基因ALK在某些ALCL中的異常表達來源於不同的染色體易位。ALK易位的基因組斷裂點多發生在16及17號外顯子中間的內含子，而17-26號外顯子編碼ALK胞內結構域，每個易位產生一種不同的融合蛋白，由配偶體的5』端和ALK酪氨酸激酶結構域3』端融合得到。大多數情況下，5』端的配偶體具有可以形成同源或異源二聚體的結構域，使得ALK激酶結構域交互磷酸化，相互作用增強並且使多種下遊蛋白質磷酸化。基因ATIC的5』端與ALK的3』端融合，導致ATIC的氨基端與ALK梭基端的酪氨酸激酶增高，使其功能近似原癌蛋白質，這些融合蛋白質定位在不同的亞細胞區域上，因此可能導致不同的細胞功能改變。
[0007]大約10-20%ALK陽性的ALCL表達ATIC-ALK，它是由染色體inv (2) (p23)和酪氨酸激酶功能區融合。ATIC對ATIC-ALK融合蛋白發揮轉化功能非常重要，缺乏ATIC 二聚體結構域的突變體小能轉化細胞，提示二聚化作用是信號傳遞的關鍵因素。轉基因模型小鼠的研究結果顯示ATIC-ALK可導致惡性的淋巴瘤。
[0008]正常情況下ALK只在神經系統中表達。人體中ALK基因表達量隨著大腦的發育成熟而下降，成熟大腦組織中的量很低，表達存在一定的區域性；其它系統尤其是造血系統中未發現ALK的表達。ALK基因在絕大多數非造血系統腫瘤和正常組織中缺乏表達，表明ALK蛋白的分布範圍是極其狹窄的。ALK蛋白是ALCL重要的分子標誌物，在ALCL的診斷中具有很高的價值。
[0009]許多學者認為ALCL患者預後與其染色體是否發生易位有關。在兒童和年青患者的侵襲性NHL中，ALK陽性系統性ALCL治癒可能性最大，預後優於任何其他形式的外周T細胞淋巴瘤。ALK陽性和ALK陰性ALCL之間預後的差異性首先由Shiota等報導，他們指出，ALK陽性病例的5年生存率(79.8%)遠好過ALK陰性病例(32.9%),P<0.01。fcunangeloFalini等對78例ALCUALK陽性53例，ALK陰性25例)患者預後統計顯示，ALK陽性病例中有77.3%獲得完全緩解，15.0%獲得了部分緩解，緩解率達到92.3%，同時4例(7.7%)對化療耐受；ALK陰性病例中有56.0`%獲得完全緩解，28.0%獲得了部分緩解，緩解率達到84.0%，同時4例(16.0%)對化療耐受；所有病例中位生存年領為2.1年(0.07年-13.17年)，ALK陽性病例總生存率(71.0%±6.0%)遠好過ALK陰性病例(15.0%±11.0%)，P〈0.0007。ALK陽性病例10年無病生存率(82.0%±6.0%)也遠好過ALK陰性病例(28.0%±14.0%), Ρ〈0.0001。Randy D等研究也顯示ALK陽性ALCL病例的5年生存率(93.0%)遠好過ALK陰性ALCL病例(37.0%)，Ρ〈0.00001。眾多研究表明有ALK融合基因的ALCL病例的預後明顯好於陰性病例，但確切的機制倘不清楚，但有一點是可以肯定的，就是ALK陽性的ALCL的預後明顯好於ALK陰性病例，因此對於臨床診斷來說很有必要檢測ALCL中有無ALK融合基因。目前，染色體易位和ALK的表達已經被WHO規定為ALCL的臨床診斷中間指標之一。
[0010]目前臨床上已經將ATIC-ALK融合基因作為動態評估患者病情及預後的輔助方法中的一種。常用的檢測融合基因的技術有螢光原位雜交(FISH)、逆轉錄PCR(RT-PCR)、實時螢光定量PCR(RQ-PCR)等方法。FISH法是現今經典的融合基因檢測方法，結果較為直觀，具有較高的檢測結果準確性，而且對於融合基因表達量低的樣本具有較高的檢出率，杜絕了微小殘留漏檢現象，提高了檢測精度。但FISH需要花費大約2天時間，試劑種類繁多，方法繁瑣，步驟多導致的各種誤差，還存在環境因素對結果產生的不確定性，且結果需經驗豐富的專業人士來判讀，結果判讀存在較大的主觀性。而單純RT-PCR法則為終點定量，無法對起始模板量進行準確的估算。此外，由於砷劑及全反式維甲酸的應用，急性早幼粒細胞白血病(APL)治療效果得到很大的提高，微小殘留是其復發的主要原因，因而急需一種高敏感性、高特異性、高自動化程度、汙染控制好的方法來對融合基因mRNA殘留進行檢測。
[0011]實時螢光定量PCR技術(real time quantitative PCR, RQ-PCR)具有較高的靈敏度和特異性，而且能對擴增產物進行實時檢測。常見的實時螢光定量PCR技術有SYBRGreen I染料法,雙探針雜交法以及Taqman探針法等。其中SYBR Green I由於採用非飽和染料，對於任何DNA雙螺旋結構都能夠產生非特異性結合，必須通過觀察溶解曲線來判斷其特異性，因而特異性不理想；雙探針雜交法由於使用了 2條探針，儘管特異性非常好，但是成本過於昂貴。而Taqman探針法,採用I條Taqman探針,利用報告基團、淬滅基團的相互作用，既保證了反應的特異性，同時很好地控制了成本，該法綜合生物學、酶學和螢光化學於一體，從擴增到結果分析均在PCR反應管封閉狀態下進行，解決了 PCR產物汙染而導致假陽性的問題，同時也提高了敏感度，其結果用拷貝數表示，實現了對PCR產物的準確定量，易於統一標準，與定性PCR技術相比，具有特異度好，靈敏度高，線性關係好，操作簡單，自動化程度高、防汙染，有較大的線性範圍等優點，而且也能夠滿足ATIC-ALK融合基因mRNA微量殘留的檢測，被認為是目前首選檢測方法，用於評價治療效果、預測預後。對於大量樣本，尤其是高危人群的的篩查具有極大的現實意義。因此本發明採用實時螢光PCR技術結合Taqman探針法應用於ATIC-ALK融合基因的檢測。

【發明內容】

[0012]本發明設計了檢測ATIC-ALK融合基因的寡核苷酸，所述寡核苷酸包括檢測AT IC-ALK的上遊引物AT IC-ALK-F、下遊引物AT IC-ALK-R和探針AT I C-ALK-Probe以及檢測內參基因Ab I的上遊引物ab 1-F、下遊引物ab 1-R和探針ab 1-Probe，採用螢光定量PCR技術，利用雙標準曲線的方法，分別構建內參基因Abl和目的基因ATIC-ALK的定量標準曲線，檢測ATIC-ALK相對於內參基因的表達量。通過調整兩個基因的引物探針比例，以及PCR反應條件，使擴增效率和速率均達到最佳。
[0013]本發明提供用於定量檢測ATIC-ALK融合基因相對表達量的寡核苷酸，其特徵在於，所述寡核苷酸包括檢測所述融`合基因的上遊引物ATIC-ALK-F、下遊引物ATIC-ALK-R和探針ATIC-ALK-Probe，其序列為:
[0014]ATIC-ALK-F:ACGCTCGAGTGACAGTGG
[0015]ATIC-ALK-R:CTACAACCCCAACTACTGCT
[0016]ATIC-ALK-Probe:FAM-AGAGGACTATGTGGTGGTGTCCA-TAMRA ；以及檢測內參基因
[0017]Abl的上遊引物abl-F、下遊引物abl_R和探針abl-Probe，其序列為:
[0018]abl-F:GCCGTGAAGACCTTGAAGGAG
[0019]abl-R:ATGATATAGAACGGGGGCTC
[0020]abl-Probe:FAM-ACCTGGTGCAGCTCCTTGGG-TAMRA。
[0021]進一步地，ATIC-ALK-F:ATIC-ALK-R:ATIC-ALK-Probe的使用濃度比為 2:2:1。
[0022]進一步地，abl-F、abl-R和 abl-Probe 的使用濃度比為 2:2:1。
[0023]本發明還提供一種定量檢測ATIC-ALK融合基因相對表達量的方法，包括:
[0024](I)提取樣本中的RNA ；[0025](2)將(I)提取出的RNA逆轉錄為cDNA，並將所產生的cDNA加入到反應管中；
[0026](3)加入檢測內參基因Abl的上遊引物abl-F、下遊引物abl-R和探針abl-Probe ；
[0027](4)加入檢測所述融合基因的上遊引物ATIC-ALK-F、下遊引物ATIC-ALK-R和探針ATIC-ALK-Probe ；
[0028](5)進行PCR擴增反應；
[0029](6)計算所述融合基因的相對表達量，其特徵在於:
[0030]ATIC-ALK-F:ACGCTCGAGTGACAGTGG[0031 ] ATIC-ALK-R:CTACAACCCCAACTACTGCT
[0032]ATIC-ALK-Probe:FAM-AGAGGACTATGTGGTGGTGTCCA-TAMRA
[0033]abl-F:GCCGTGAAGACCTTGAAGGAG
[0034]abl-R:ATGATATAGAACGGGGGCTC
[0035]abl-Probe:FAM-ACCTGGTGCAGCTCCTTGGG-TAMRA。
[0036]進一步地，所述PCR擴增反應條件為:95°C預變性Imin ；95°C 15s，58°C 35sec，40個循環。
[0037]本發明還提供一種定量檢測ATIC-ALK融合基因相對表達量的試劑盒，其包括紅細胞裂解液，TRIzol，氯仿，無水乙醇；檢測體系PCR反應液；陽性對照品，陰性對照品和空白對照品，其中，所述檢測體系`PCR反應液包括檢測所述融合基因的上遊引物ATIC-ALK-F、下遊引物ATIC-ALK-R和探針ATIC-ALK-Probe以及檢測內參基因Abl的上遊引物abl_F、下遊引物abl-R和探針abl-Probe,其特徵在於:
[0038]ATIC-ALK-F:ACGCTCGAGTGACAGTGG ；
[0039]ATIC-ALK-R:CTACAACCCCAACTACTGCT ；
[0040]ATIC-ALK-Probe:FAM-AGAGGACTATGTGGTGGTGTCCA-TAMRA ；
[0041 ] abl-F:GCCGTGAAGACCTTGAAGGAG ；
[0042]abl-R:ATGATATAGAACGGGGGCTC ；
[0043]abl-Probe:FAM-ACCTGGTGCAGCTCCTTGGG-TAMRA。
[0044]進一步地，所述紅細胞裂解液由NH4C1、NaHC03、EDTA 二鈉和ddH20組成。
[0045]進一步地，所述陽性對照品為含ATIC-ALK基因的溶液；所述陰性對照品為不含ATIC-ALK基因的溶液；所述空白對照品為生理鹽水或不加任何物質。
[0046]本發明的有益效果:本發明將實時螢光PCR技術結合採用Taqman探針，利用雙標準曲線的方法，分別構建內參基因abl和目的基因ATIC-ALK的定量標準曲線，檢測受試者體內ATIC-ALK的相對於內參基因的表達量。相比於以往的免疫組化方法和現今流行的AACT法，該試劑盒具有精度高，結果便於判讀等優點。加之該方法將反應體系所需的引物、探針進行合理配比和優化，使實驗條件達到最佳，從而省去了繁瑣的條件摸索環節，大大提升了實驗效率。該方法經測試特異性好，靈敏度高，操作簡便。有助於臨床上ACLC患者體內ATIC-ALK融合基因的微量殘留檢測，對於及時幹預治療避免血液學復發、調整治療方案、評價治療效果、預測預後、預防臨床復發都具有重要輔助意義。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0047]圖1ATIC-ALK陽性結果圖；[0048]圖2ATIC-ALK陰性結果圖。
【具體實施方式】
[0049]下面結合具體實施例和附圖，進一步闡述本發明。應當注意的是，實施例中未說明的常規條件和方法，通常按照所屬領域實驗人員常規採用方法:譬如，奧斯柏和金斯頓主編的《精編分子生物學實驗指南》第四版，或者按照製造廠商所建議的步驟和條件。
[0050]實施例1
[0051]檢測ATIC-ALK融合基因的寡核苷酸和試劑盒
[0052]用於定量檢測ATIC-ALK融合基因相對表達量的寡核苷酸，包括檢測所述融合基因的上遊引物AT IC-ALK-F、下遊引物ATIC-ALK-R和探針ATIC-ALK-Probe，其序列為:
[0053]ATIC-ALK-F:ACGCTCGAGTGACAGTGG
[0054]ATIC-ALK-R:CTACAACCCCAACTACTGCT
[0055]ATIC-ALK-Probe:FAM-AGAGGACTATGTGGTGGTGTCCA-TAMRA `；以及檢測內參基因
[0056]Abl的上遊引物abl-F、下遊引物abl_R和探針abl-Probe，其序列為:
[0057]abl-F:GCCGTGAAGACCTTGAAGGAG
[0058]abl-R:ATGATATAGAACGGGGGCTC
[0059]abl-Probe:FAM-ACCTGGTGCAGCTCCTTGGG-TAMRA。
[0060]一種檢測樣本中ATIC-AL`K融合基因相對表達量的試劑盒，將檢測到的ATIC-ALK融合基因相對表達量用作輔助臨床上人類ACLC早期預防、早期診斷的輔助性指標；還可以對高危人群進行較為準確的篩查。該試劑盒包括:
[0061]紅細胞裂解液；TRIzol ;氯仿；無水乙醇；
[0062]檢測體系PCR 反應液:ReverTra Ace qPCR RT Kit (T0Y0B0 公司)；THNDERBIRDProbe qPCR Mix (2X )、作為目的基因的ATIC-ALK上、下遊引物各0.8uM、ATIC-ALK探針
0.4uM ;作為內參基因的abl上、下遊引物各0.8uM、探針abl-probe0.4uM，其中，
[0063]ATIC-ALK-F:ACGCTCGAGTGACAGTGG ；
[0064]ATIC-ALK-R:CTACAACCCCAACTACTGCT ；
[0065]ATIC-ALK-Probe:FAM-AGAGGACTATGTGGTGGTGTCCA-TAMRA ；
[0066]abl-F:GCCGTGAAGACCTTGAAGGAG ；
[0067]abl-R:ATGATATAGAACGGGGGCTC ；
[0068]abl-Probe:FAM-ACCTGGTGCAGCTCCTTGGG-TAMRA ；
[0069]陽性對照品:含ATIC-ALK基因的溶液；
[0070]陰性對照品:不含ATIC-ALK基因的溶液；
[0071]空白對照品:生理鹽水或不加任何物質。
[0072]實施例2
[0073]本發明試劑盒的使用方法:
[0074](I)抽提血液中的組織RNA:在潔淨的1.5ml的離心管中加入Iml紅細胞裂解液，取抗凝血0.5ml混勻。室溫靜置IOmin ；5000rpm離心5min,棄上清，收集底部的細胞；再次加入0.5ml紅細胞裂解液，5000rpm離心5min，棄上清，收集底部的細胞；向細胞中加入Iml TRIzol,反覆吹打直至沉澱完全溶解，室溫靜止5min ;加入0.2ml氯仿，震蕩均勻；14000rpm4°C離心lOmin，吸取上清層轉移至另一新的離心管中；加入等體積的異丙醇，上下充分混勻，室溫靜置IOmin ;14000rpm4°C離心IOmin,棄上清，加入75%乙醇Iml,輕輕上下顛倒洗漆管壁；14000rpm4°C離心5min,棄乙醇；室溫乾燥10_15min,加入20ulRNase-free水溶解沉澱。其中，IOX紅細胞裂解液配方為:NH4C182g，NaHC038.4g，EDTA 二鈉 3.72g，加 ddH20 定容至 1000ml0
[0075](2)RNA逆轉錄:參考TOYOBO公司的Rever Tra Ace qPCR RT Kit試劑盒說明書，將RNA逆轉錄為cDNA。
[0076](3)試劑配置:按檢測人份數配置檢測體系PCR反應液各X ul，每人份23ul分裝:
[0077]X=23ul反應液X (8份內參基因(標準曲線)+8份目的基因(標準曲線)+η份標本+1份陽性對照+1份陰性對照+1份空白對照)；
[0078](4)加樣:取2ul (2)中的cDNA，加入到檢測體系PCR反應液中；對陽性對照和陰性對照實驗而言，直接加2ul陽性對照品和陰性對照品；對空白對照實驗而言，加2ul生理鹽水或不加任何物質；對空白對照實驗而言，加2ul生理鹽水或不加任何物質。
[0079](5)檢測:檢測在實時螢光PCR儀上進行，可用儀器包括ABI7300，7500 (美國Applied Biosystems 公司)等。反應條件:95°C預變性 Imin ；95°C 15s, 58°C 35sec40 個循環，突光信號於58°C 35sec時米集。
[0080](6)結果判斷:將閾值線調整至背景信號及陰性擴增線以上，系統根據標準曲線和CT值自動計算出拷貝數。
[0081]I)內參陽性時，檢測結果才認為有效；
[0082]2)判斷標準:Ct 38，為結果陰性。
[0083]實施例3
[0084]臨床標本檢測
[0085]取送檢ALCL患者抗凝血樣本共10例，按實施例2所述方法提取組織RNAjf RNA逆轉錄為cDNA、配製試劑、加樣和進行螢光定量檢測。
[0086]對每份樣本而言，取2ul經逆轉錄產生的cDNA，加入到檢測體系PCR反應液中，同時做陽性、陰性、空白對照實驗各一次，內參基因/目的基因的標準曲線各一份。一臺96孔的螢光PCR儀可同時檢測38份樣本，每個樣本2次重複。用螢光PCR儀檢測，時間為100分鐘。
[0087]實驗結果與融合基因檢測方法FISH法的報告結果相比較，確定樣本檢測的準確率。部分陽性結果如下表1:
[0088]表1:
[0089]
樣本編號 Ifish法檢測結果(%) |本方法檢測結果(%)
61323.6523.60
6li2.372.40
【權利要求】
1.用於定量檢測ATIC-ALK融合基因相對表達量的寡核苷酸，其特徵在於，所述寡核苷酸包括檢測所述融合基因的上遊引物ATIC-ALK-F、下遊引物ATIC-ALK-R和探針ATIC-ALK-Probe，其序列為:
ATIC-ALK-F: ACGCTCGAGTGACAGTGG
ATIC-ALK-R: CTACAACCCCAACTACTGCT ATIC-ALK-Probe: FAM-AGAGGACTATGTGGTGGTGTCCA-TAMRA ；以及檢測內參基因 Abl 的上遊引物abl-F、下遊引物abl-R和探針abl-Probe，其序列為:abl-F: GCCGTGAAGACCTTGAAGGAGabl-R: ATGATATAGAACGGGGGCTCabl-Probe: FAM-ACCTGGTGCAGCTCCTTGGG-TAMRA。
2.如權利要求1所述的寡核苷酸，其特徵在於，
AT IC-ALK-F: AT IC-ALK-R: AT I C-ALK-Pr ob e 的使用濃度比為 2:2:1。
3.如權利要求1至2之一所述的寡核苷酸,其特徵在於，abl-F、abl_R和abl-Probe的使用濃度比為2:2:1。
4.一種定量檢測ATIC-ALK融合基因相對表達量的方法，包括: (1)提取樣本中的RNA； (2)將(I)提取出的RNA逆轉錄為cDNA，並將所產生的cDNA加入到反應管中； (3)加入檢測內參基因Abl的上遊引物abl-F、下遊引物abl-R和探針abl-Probe； (4)加入檢測所述融合基 因的上遊引物ATIC-ALK-F、下遊引物AT IC-ALK-R和探針ATIC-ALK-Probe ； (5)進行PCR擴增反應； (6)計算所述融合基因的相對表達量，其特徵在於:
ATIC-ALK-F: ACGCTCGAGTGACAGTGG
ATIC-ALK-R: CTACAACCCCAACTACTGCT
ATIC-ALK-Probe: FAM-AGAGGACTATGTGGTGGTGTCCA-TAMRA
abl-F: GCCGTGAAGACCTTGAAGGAG
abl-R: ATGATATAGAACGGGGGCTC
abl-Probe: FAM-ACCTGGTGCAGCTCCTTGGG-TAMRA。
5.如權利要求4所述的方法，其特徵在於，所述PCR擴增反應條件為:95°C預變性Imin ；95°C 15s,58°C 35sec，40 個循環。
【文檔編號】C12N15/11GK103757101SQ201310717956
【公開日】2014年4月30日 申請日期:2013年12月23日 優先權日:2013年12月23日
【發明者】王淑一, 李文靜 申請人:成都艾迪康醫學檢測實驗室有限公司