阿帕替尼在製備BRAFV600E蛋白激酶抑制劑中的應用的製作方法

2023-06-22 07:03:21

本發明涉及醫藥
技術領域：
：，具體地說，是阿帕替尼在製備brafv600e蛋白激酶抑制劑中的應用，以及阿帕替尼在製備治療brafv600e突變腫瘤藥物中的應用。
背景技術：
：：甲磺酸阿帕替尼片(apatinibmesylatetablets，c24h23n5o·ch4o3s，以下簡稱阿帕替尼)是我國自主研製的1.1類新藥，已於2014年批准上市，用於晚期胃腺癌或胃-食管結合部腺癌的三線或三線以後治療。此外，阿帕替尼針對肺癌、乳腺癌和肝癌的臨床試驗研究表明，其對多種實體瘤均具有較好的療效(參見文獻：zhangh.apatinibformoleculartargetedtherapyintumor[j].drugdesign,developmentandtherapy,2015,9:6075-6081.)，提示阿帕替尼具有良好的應用前景。黑色素瘤是臨床上常見的皮膚惡性腫瘤，其發病率呈逐年增加的趨勢。惡性黑色素瘤發病機制尚未清楚，且對常規治療極為不敏感，死亡率高(參見文獻：王馨苑,黃寧.惡性黑色素瘤細胞死亡與治療研究進展[j].腫瘤研究與臨床,2015,(6):426-429.)。結直腸癌是一種臨床常見的腫瘤，其全球發病率、惡化死亡率分別位列惡性腫瘤中的第三位和第四位。結直腸癌的危險因素包括家族遺傳、腸炎、吸菸、酗酒、肥胖等多種因素，且常為多種因素同時出現，為結直腸癌的治療帶來了巨大的困難。近年來，我國結直腸癌發病率和死亡率均呈現上升的趨勢。(參見文獻：brennerh,kloorm,poxcp.colorectalcancer[j].thelancet,2014,383(9927):1490-1502；chenw,zhengr,baadepd,zhangs,zengh,brayf,etal.cancerstatisticsinchina,2015[j].ca:acancerjournalforclinicians,2016,66(2):115-132.)。肺癌是發病率和致死率最高的惡性腫瘤，其中約80％-85％為非小細胞肺癌(non-smallcelllungcancer,nsclc)。nsclc早期症狀不明顯，多數患者在確診時已為不能手術的中晚期，需要進行藥物治療。阿帕替尼針對晚期非鱗非小細胞肺癌患者的ⅱ期臨床研究顯示，接受阿帕替尼治療後，患者的緩解率(responserate,rr)較安慰劑組得到了顯著提高(12.2％vs0.00％)，中位無進展生存期(medianprogression-freesurvival,mpfs)得到了顯著延長(4.7mvs1.9m)。(參見文獻：zhangl,shim,huangc,liux,xiongjp,cheng,etal.aphaseii,multicenter,placebo-controlledtrialofapatinibinpatientswithadvancednonsquamousnon-smallcelllungcancer(nsclc)aftertwoprevioustreatmentregimens.americansocietyofclinicaloncology.2012.)。目前研究表明，阿帕替尼主要通過高效抑制血管內皮細胞生長因子受體-2(vascularendothelialgrowthfactorreceptor2，vegfr2)來抑制血管新生，從而發揮抗腫瘤活性(參見文獻：tians,quanh,xiec,guoh,luf,xuy,etal.yn968d1isanovelandselectiveinhibitorofvascularendothelialgrowthfactorreceptor-2tyrosinekinasewithpotentactivityinvitroandinvivo.cancerscience,2011,102(7):1374-1380.)。但通過與已有文獻比較，我們認為對該作用機制表示疑義，主要原因如下：1)作用於vegfr、pdgfr等的多靶點酪氨酸激酶抑制劑——索拉菲尼，其對晚期非鱗非小細胞肺癌患者的ⅲ期臨床研究試驗結果顯示，索拉菲尼的客觀緩解率(objectiveresponserate，orr)為4.9％，mpfs為2.8m(參見文獻：paz-aresl,hirshv,zhangl,demarinisf,yangjc-h,wakeleeha,etal.monotherapyadministrationofsorafenibinpatientswithnon–smallcelllungcancer(mission)trial.journalofthoraciconcology,2015,10(12):1745-1753.)，該結果與阿帕替尼的ⅱ期臨床試驗結果(rr：12.2％，mpfs：4.7m)具有較大差距；2)不同種族患者對vegf/vegfr靶向抑制劑的敏感性差異較大，且亞洲人群對其響應較差(參見文獻：parkdj,thomasnj,yoonc,yoonss.vascularendothelialgrowthfactorainhibitioningastriccancer.gastriccancer:officialjournaloftheinternationalgastriccancerassociationandthejapanesegastriccancerassociation,2015,18(1):33-42.；vancutseme,dehaass,kangyk,ohtsua,tebbuttnc,mingxuj,etal.bevacizumabincombinationwithchemotherapyasfirst-linetherapyinadvancedgastriccancer:abiomarkerevaluationfromtheavagastrandomizedphaseiiitrial.journalofclinicaloncology:officialjournaloftheamericansocietyofclinicaloncology,2012,30(17):2119-2127.)。braf是一個驅動基因，其v600突變多見於黑色素瘤、甲狀腺乳頭狀癌、卵巢交界性腫瘤、結直腸癌、非小細胞肺癌和多毛細胞白血病(參見文獻：daviesh,bignellgr,coxc,stephensp,edkinss,cleggs,etal.mutationsofthebrafgeneinhumancancer[j].nature,2002,417(6892):949-954.)，並以v600e突變最常見(參見文獻：hymandm,puzanovi,subbiahv,farisje,chaui,blayjy,etal.vemurafenibinmultiplenonmelanomacancerswithbrafv600mutations[j].thenewenglandjournalofmedicine,2015,373(8):726-736.)。目前尚未有文獻報導阿帕替尼對brafv600e蛋白激酶的抑制作用，以及阿帕替尼對brafv600e突變腫瘤患者的治療作用。技術實現要素：本發明的目的在於提供阿帕替尼的新作用靶點和適應症，即其可以作為brafv600e蛋白激酶抑制劑，並通過抑制brafv600e蛋白激酶發揮治療brafv600e突變腫瘤的作用。本發明從體外細胞培養、體內動物實驗和臨床研究三個方面研究了阿帕替尼對brafv600e突變的黑色素瘤、結直腸癌和非小細胞肺癌的抑制作用。通過臨床前實驗發現，阿帕替尼能有效抑制brafv600e突變的黑色素瘤細胞系和結直腸癌細胞系的增殖，實驗還表明，阿帕替尼主要作用機制為抑制braf下遊mek、erk信號蛋白的活化，而非抑制vegfr2的磷酸化。體內實驗發現，阿帕替尼能明顯抑制a375和colo205腫瘤在裸鼠皮下的生長速度，且效果優於brafv600e靶向製劑維羅菲尼。本發明的第一方面，提供阿帕替尼在製備brafv600e蛋白激酶抑制劑中的應用。本發明發現了阿帕替尼能夠明顯抑制braf下遊mek、erk蛋白的磷酸化，從而選擇性抑制brafv600e蛋白激酶的活性，具體見實施例1和實施例3。本發明的第二方面，提供阿帕替尼在製備治療brafv600e突變腫瘤藥物中的應用。本發明發現了阿帕替尼通過抑制brafv600e活性發揮抗腫瘤作用，包括對brafv600e突變的黑色素瘤、結直腸癌細胞和非小細胞肺癌的治療作用。所述的brafv600e突變腫瘤包括brafv600e突變黑色素瘤、甲狀腺乳頭狀癌、卵巢交界性腫瘤、結直腸癌、非小細胞肺癌和多毛細胞白血病。優選的，所述的阿帕替尼在製備治療黑色素瘤藥物中的應用。更優選的，所述的阿帕替尼在製備治療brafv600e突變的黑色素瘤藥物中的應用。優選的，所述的阿帕替尼在製備治療brafv600e突變的結直腸癌藥物中的應用。優選的，所述的阿帕替尼在製備治療brafv600e突變的非小細胞肺癌藥物中的應用。優選的，所述的阿帕替尼在製備治療brafv600e突變的腫瘤藥物中的應用，所述的應用具體是，阿帕替尼在給藥前，先檢測腫瘤樣本中braf基因是否發生v600e突變。本發明的第三方面，提供檢測brafv600e突變的試劑在製備黑色素瘤、brafv600e突變的結直腸癌，或brafv600e突變的非小細胞肺癌診斷試劑盒中的應用。本發明優點在於：本發明為阿帕替尼提供了新的靶點和適應症。本發明也為brafv600e突變的黑色素瘤、結直腸癌和非小細胞肺癌等腫瘤的治療提供了新的思路。附圖說明圖1：阿帕替尼對攜帶brafv600e突變的人黑色素瘤和結直腸癌細胞株在體外的生長具有明顯的抑制作用；圖2：阿帕替尼能明顯抑制braf下遊mek、erk蛋白的磷酸化，而對vegfr2的磷酸化幾乎無影響；圖3：阿帕替尼能明顯抑制人黑色素瘤細胞株a375和結直腸癌細胞株colo205在裸鼠皮下的生長速度；其中，上圖為阿帕替尼對a375細胞生長的抑制作用，下圖為阿帕替尼對colo205細胞生長的抑制作用；圖4：阿帕替尼能明顯抑制人非小細胞肺癌細胞株hcc364在裸鼠皮下的生長速度；圖5：阿帕替尼能選擇性抑制brafv600e突變的人非小細胞肺癌細胞株hcc364在體外生長。具體實施方式下面結合實施例對本發明提供的具體實施方式作詳細說明。實施例1.阿帕替尼對多種激酶的體外抑制作用篩查取阿帕替尼用dmso配製100nm溶液，基於life公司的lanthascreenbinding和zlyte平臺對138個蛋白激酶庫進行篩查。結果顯示，除對已知靶點vegfr2、kit外，阿帕替尼可以與brafv600e蛋白激酶結合，並對其具有較好的抑制活性，抑制率為51％。實施例2.阿帕替尼對人黑色素瘤和結直腸癌細胞株在體外生長的抑制作用取對數生長期的人黑色素瘤細胞(a375，sk-mel-28)和結直腸癌細胞(colo205，ht29)，胰酶消化法製備細胞懸液，離心收集細胞沉澱，用含10％fbs的rpmi1640完全培養基(阿帕替尼終濃度分別為0，50，100，200，400，800nm)調整細胞密度至1×105個/ml，接種細胞到96孔細胞培養板，每孔添加100μl細胞懸液，輕晃培養板使其分布均勻，37和℃5％co2條件下培養細胞，並於接種後48小時採用cck-8法檢測細胞活性。檢測前，每孔細胞加入10μlcck-8溶液，輕晃使其分布均勻，37和℃5％co2繼續培養4小時，酶標儀檢測490nm波長細胞液的吸光度值，根據吸光度值製作細胞對數期生長曲線。所有實驗均為5次獨立生物學重複。結果如圖1所示，阿帕替尼對4個細胞系的增殖均具有明顯抑制作用，且隨著阿帕替尼濃度的提高，阿帕替尼對brafv600e突變細胞系增殖的抑制作用逐漸增強，提示阿帕替尼對brafv600e突變的黑色素瘤和結直腸癌細胞系的體外增殖具有明顯抑制作用。實施例3.阿帕替尼對mapk信號通路的抑制作用取對數生長期的人黑色素瘤a375細胞，胰酶消化法製備細胞懸液，離心收集細胞沉澱，用含10％fbs的rpmi1640完全培養基(阿帕替尼終濃度為50nm)調整細胞密度至1×105個/ml，接種細胞到6孔細胞培養板，每孔添加2ml細胞懸液，輕晃培養板使分布均勻，37和℃5％co2條件下培養，並於接種後3小時去掉培養基，向培養板中加入1mldpbs洗細胞兩遍，去掉dpbs，每孔加入0.5ml細胞裂解液，按照試劑盒說明書提取細胞總蛋白，bca法定量細胞總蛋白濃度。定量後的細胞總蛋白，每組10μl進行垂直電泳，sds-聚丙烯醯胺凝膠分離膠濃度為10％，經110v電壓90分鐘電泳後，立春紅染色觀察蛋白條件是否完整，400ma電流轉膜90分鐘，轉膜後5％的脫脂牛奶封閉2h，4℃一抗過夜孵育，p-mek，mek，p-erk1/2，erk1/2，p-vegfr2，vegfr2和betaactin一抗稀釋(tbst)比分別為1:300,1:300，1:400，1:600，1:500和1:800；tbst洗膜3次，加入二抗孵育2h，羊抗鼠二抗稀釋比為1:4000；tbst洗膜2次，添加化學發光液反應底物，暗室曝光，掃描曝光底片，統計目的條帶光密度值並比較蛋白磷酸化水平變化。實驗進行3次獨立生物學重複。實驗結果如圖2所示，經阿帕替尼對a375處理3小時後，braf下遊信號蛋白mek，erk1/2的磷酸化明顯減弱，而vegfr2的磷酸化幾乎不變，提示阿帕替尼通過抑制braf發揮對brafv600e突變細胞株的抑制作用。實施例4.阿帕替尼對a375和colo205細胞株體內生長的抑制作用將1×106a375和colo205細胞分別接種於雌性裸鼠(6周齡，購自南京大學模式動物研究所)皮下，待腫瘤長至100-150mm3時，將裸鼠隨機分為空白溶劑對照組、維羅菲尼對照組(125mg/kg，bid)和不同劑量阿帕替尼處理組(32,65,100mg/kg，qd)，每組各6隻，給藥21天後處死。測量並記錄腫瘤體積大小(腫瘤體積大小的計算公式為：體積＝1/2×腫瘤長徑×短徑2)。結果如圖3所示，經阿帕替尼處理後，a375和colo205細胞在小鼠皮下的生長速度均明顯減慢。阿帕替尼濃度的提高和作用時間的延長，阿帕替尼對a375和colo205細胞在小鼠皮下的生長抑制作用逐漸增強，且抑制效果優於brafv600e靶向製劑維羅菲尼，進一步證明了阿帕替尼對這兩種細胞系在小鼠體內的成瘤能力具有較好的抑制作用。實施例5.阿帕替尼對brafv600e突變的肺癌患者治療作用採用braf檢測試劑盒，1名晚期非小細胞肺癌患者經檢測為brafv600e突變陽性，服用阿帕替尼(750mg/d)8周後，胸部ct示患者靶病灶較用藥前減少大於30％，評估病情為部分緩解。實施例6.阿帕替尼對hcc364細胞株體內生長的抑制作用將1×106hcc364細胞接種於雌性裸鼠(6周齡，購自南京)皮下，待腫瘤長至100-150mm3時，將裸鼠隨機分為空白溶劑對照組、維羅菲尼對照組(125mg/kg，bid)和不同劑量阿帕替尼處理組(32,65,100mg/kg，qd)，每組各6隻，給藥26天後處死。每周2次測量腫瘤體積大小(腫瘤體積大小的計算公式為：體積＝1/2×腫瘤長徑×短徑2)。結果如圖4所示，經阿帕替尼處理後，hcc364細胞在小鼠皮下的生長速度均明顯減慢。隨著阿帕替尼濃度的提高和作用時間的延長，阿帕替尼對hcc364細胞在小鼠皮下的生長抑制作用逐漸增強，且抑制效果優於brafv600e靶向製劑維羅菲尼，證明阿帕替尼對brafv600e突變的非小細胞肺癌細胞系在小鼠體內的成瘤能力具有較好的抑制作用。實施例7.阿帕替尼對非小細胞肺癌hcc364和hcc827細胞株的體外生長抑制作用取對數期人非小細胞肺癌hcc364和hcc827細胞，胰酶消化法製備細胞懸液，離心收集細胞沉澱，用含10％fbs的rpmi1640完全培養基(阿帕替尼終濃度分別為0，25，50，100，200，400，800，1600nm)調整細胞密度至1×105個/ml，接種細胞到96孔細胞培養板，每孔添加100μl細胞懸液，輕晃培養板使其分布均勻，37℃和5％co2條件下培養細胞，並於接種後48小時採用cck-8法檢測細胞活性。檢測前，每孔細胞加入10μlcck-8溶液，輕晃使其分布均勻，37℃和5％co2繼續培養4小時，酶標儀檢測490nm波長細胞液的吸光度值，根據吸光度值計算細胞抑制率並計算ic50。所有實驗均為5次獨立生物學重複。結果如圖5所示，hcc364和hcc827細胞的ic50值分別為84.1nm和1024.1nm，提示阿帕替尼對brafv600e突變的人非小細胞肺癌細胞株hcc364的生長抑制作用具有較強的靶向性。以上已對本發明創造的較佳實施例進行了具體說明，但本發明創造並不限於所述實施例，熟悉本領域的技術人員在不違背本發明創造精神的前提下還可做出種種的等同的變型或替換，這些等同的變型或替換均包含在本申請權利要求所限定的範圍內。當前第1頁12當前第1頁12