一種高純度d-螢光素的製備和純化方法
2023-06-22 07:16:11
專利名稱：一種高純度d-螢光素的製備和純化方法
技術領域：
本發明屬於化學合成領域，具體涉及ー種高純度D-螢光素的製備和純化方法。
背景技術：
D-螢光素是ー種依賴腺苷三磷酸(ATP)生物發光反應的底物，生物發光的原理是螢光素在ATP和氧存在條件下被螢光素酶氧化，其化學反應式如下ATP+D-LUCiferin+02ヰ 0巧111(^作1^11+ム1^+ 1+02+1^8社。螢光素/螢光素酶的生物發光反應常用於ム1 、能轉化為 ATP的代謝物(如AMP、ADP、cAMP)和能產生ATP的酶(如肌酸激酶等)的檢測，因此生物發光反應可應用於廣泛範圍內生物材料的檢測。近幾十年來，ATP生物發光技術得到了很大的發展，已經在細胞増殖、細胞毒性和生物量計數等方面廣泛應用。在食品衛生領域由於 ATP生物發光技術無需培養過程，操作簡便、靈敏度高，數分鐘內可得到結果，具有其它微生物檢測方法無法比擬的優勢，是目前檢測微生物最快的方法。除此之外，螢光素酶基因可作為報告基因，在分子生物學上有廣泛的應用。因此螢光素/螢光素酶生物發光反應具有很大的市場，D-螢光素作為生物發光反應的底物，隨著ATP生物發光反應試劑需求的増加，其需求量越來越大。而D-螢光素目前國內主要依靠進ロ，其價格高，貨期長，另外已有的國產產品含量低，發光活力不高，因此研製高純度的D-螢光素有很好的市場前景和科學意義。發明專利ZL200410051705. 2，發明名稱為D-螢光素化學合成方法及裝置相同，介紹了ー種新的D-螢光素化學合成方法與裝置。通過將高純度的2-氰基-6-甲氧基苯並噻唑和鹽酸吡啶進行高溫脫甲基反應，採用合適的方法提取脫甲基產物2-氰基-6羥基苯並噻唑後經柱層析純化，最後將純化的脫甲基產物與D-半胱氨酸進行縮合反應後可獲得 D-螢光素產品。後續研究發現，隨著反應規模的擴大，脫甲基產物2-氰基-6羥基苯並噻唑的純度有時難以保證，進一步縮合後的螢光素產品純度和發光活力相對有所降低，純度不高的螢光素產品因含抑制物發光活力而達不到要求的水平。由於D-螢光素是ー種立體異構體，在一些溶劑中容易氧化解旋並見光分解，一般的純化方法如柱層析純化效果不好。
發明內容
本發明的目的是提供一種製備純度高的D-螢光素產品、且製備的產品D-螢光素的發光比活力高，得率也高的高純度D-螢光素的製備方法。本發明的高純度D-螢光素的製備方法，它是由2-氰基-6-甲氧基苯並噻唑和鹽酸吡啶進行高溫脫甲基反應，然後提取脫甲基反應產物，經柱層析純化，最後將純化的脫甲基產物2-氰基-6-羥基苯並噻唑與D-半胱氨酸進行縮合反應生成D-螢光素，純化即得 D-螢光素產品，其特徵在幹，所述的將純化的脫甲基產物2-氰基-6-羥基苯並噻唑與D-半胱氨酸進行縮合反應生成D-螢光素，純化即得D-螢光素產品是在充氮氣的條件下，2-氰基-6-羥基苯並噻唑與D-半胱氨酸在鹼性條件下進行縮合反應，反應完畢後在充氮氣的條件下用有一定極性的非水溶性有機溶劑進行萃取，萃取後的水相用鹽酸進行酸化，分離沉澱物，沉澱物用溶水性有機溶劑進行洗滌，離心去上清，沉澱物真空乾燥，即獲得高純度D-螢光素產品。所述的將純化的脫甲基產物2-氰基-6-羥基苯並噻唑與D-半胱氨酸進行縮合反應生成D-螢光素，純化即得D-螢光素產品，其優選步驟為純化後的脫甲基產物2-氰基-6-羥基苯並噻唑(M176彡85% )與D-半胱氨酸鹽酸水合物按質量比1 1 1. 6在有一定極性的非水溶性有機溶劑中充氮混合，用飽和氮氣的0. 1 2mol/L的碳酸鉀溶液在充氮氣的條件下，調節其pH至8 9，反應5 60min，反應完畢在充氮氣的條件下用有一定極性的非水溶性有機溶劑萃取，水相用0. 2 lmol/L的鹽酸調節pH至1 3，分離沉澱物，再用體積比為1 5 1的水和甲醇混合液洗滌沉澱物，10000 15000r/min離心，去上清，沉澱物經真空乾燥，即可獲得高純度D-螢光素產品。利用本優選方法製備的D-螢光素產品，其純度大於90% (HPLC，％ Wt)，並且可以高得率獲得發光比活力達到甚至高於 Singma L9504D-螢光素的D-螢光素產品。所述的有一定極性的非水溶性有機溶劑優選為醇類、酯類和烴類及其混合物，進一步優選為酯類和烴類，其中所述的在有一定極性的非水溶性有機溶劑中充氮混合中的有一定極性的非水溶性有機溶劑優選為ニ氯甲烷，所述的用有一定極性的非水溶性有機溶劑萃取中的有一定極性的非水溶性有機溶剤，優選為乙酸乙酯或ニ氯甲烷或體積比為1 1 的乙酸乙酯和水混合液或體積比1 5 1的ニ氯甲烷和水的混合液，萃取優選為2 3 次。所述的用體積比為1 5 1的水和甲醇混合液洗滌沉澱物，洗滌次數優選為2次。本發明的第二個目的是提供一種高純度D-螢光素產品的純化方法，其特徵在幹， 將低純度的D-螢光素產品在充氮氣條件下，用鹼性溶液溶解，然後在充氮氣的條件下用有一定極性的非水溶性有機溶劑進行萃取，萃取後的水相用鹽酸進行酸化，分離沉澱物，沉澱物用溶水性有機溶劑進行洗滌，離心去上清，沉澱物真空乾燥，即獲得高純度D-螢光素產
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ΡΠ O所述的高純度D-螢光素產品的純化方法，優選具體步驟為將低純度的D-螢光素產品用飽和氮氣的0. 1 2mol/L的碳酸鉀溶液在充氮氣的條件下溶解，在充氮氣的條件下再用有一定極性的非水溶性有機溶劑萃取，萃取後的水相用0. 2 lmol/L的鹽酸調節pH 至1 3，分離沉澱物，再用體積比為1 5 1的水和甲醇混合液洗滌沉澱物，10000 15000r/min離心，去上清，沉澱物真空乾燥，即可獲得高純度D-螢光素產品。利用該純化方法可以提高D-螢光素產品中D-螢光素的純度，並且還可以提高低純度的D-螢光素的發光比活力，純化的得率也很高。所述的有一定極性的非水溶性有機溶劑優選為醇類、酯類和烴類及其混合物，進一步優選為酯類和烴類及其混合物，如乙酸乙酯或ニ氯甲烷，萃取優選為2 3次。所述的用體積比為1 5 1的水和甲醇混合液洗滌沉澱物，洗滌次數優選為2次。1、脫甲基產物的組成成分與含量分析通過GC-MS進行分析。2、合成的D-螢光素的組成與含量分析用高效液相色譜(HPLC)在有標準樣品対照的情況下進行合成D-螢光素的組成成分與含量分析。3、合成的D-螢光素髮光活力分析用70mmol/L Tris-Maleate (pH 7.75)緩衝液配 D-螢光素為 lmg/ml 的液體， 抽真空通氮氣，可用於測量或_30°C凍存起來，用無菌純水配1 X 10_7mol/LATP標準溶液， 25mmol/L GB(pH 7.2)為酶測試緩衝液，0. 5ml 檢測體系，S卩0. Iml ATP+Xml Ln+ (0. 3-X) mlGB+0. ImlFL (不含螢光素的凍幹酶粉1瓶配2ml酶液)，X為測試中螢光素液體的量(ml)， 以Sigma L9504螢光素作為比對分析樣，在GLOMAX 20/20發光檢測儀上進行發光分析，測試結果以樣品螢光素的發光活力CP3S與標準螢光素的CP3S的比值表示，本專利實驗中X 選 25 μ L0利用本發明的高純度D-螢光素的製備方法，可以獲得高純度的D-螢光素產品，並且其D-螢光素的發光比活力較高，得率也高，如果用原料脫甲基產物2-氰基-6-羥基苯並噻唑的純度(Μ176彡85%)時，其製備的高純度的D-螢光素產品的純度可達90% (HPLC，% Wt)以上，發光比活力達到甚至高於Sigma L9504D-螢光素。D-螢光素的發光比活力與合成原料2-氰基-6-羥基苯並噻唑的純度有關，純度越高原料得到的產品發光比活力越高。利用本發明的高純度D-螢光素產品的純化方法純化低純度的D-螢光素產品，不但能夠有效的提高D-螢光素的純度，還能提高D-螢光素的發光比活力，且其得率也比較尚ο
圖1是一次性合成提取和純化D-螢光素2011111702HPLC圖譜。
具體實施例方式以下實施例是對本發明的進一步說明，而不是對本發明的限制。一、D-螢光素粗品的合成，其合成與專利號為ZL200410051705. 2，發明名稱為 D-螢光素化學合成方法及裝置相同，具體的方法為1、脫甲基反應D-螢光素的反應原材料為2-氰基-6-甲氧基苯並噻唑(99%，NEW JERSEY, USA1-800-ACR0S-01)和鹽酸吡啶(98%，ACR0S 0RGANICS)，反應比例為2-氰基-6-甲氧基苯並噻唑鹽酸吡啶=1 1 3，反應溫度為180 250°C，環境為抽真空通氮氣，反應時間為0. 5 3h。2、脫甲基目標產物的提取脫甲基反應後的產物用1 1 3的乙酸乙酯和冰水洗滌反應後的混合物三次， 每次的用量約為反應原材料的50 100倍。通過萃取有機層後用旋轉真空蒸發儀進行濃縮乾燥。3、脫甲基產物的純化脫甲基後的目標產物純化是用80 400目的粗孔矽膠進行柱層析，層析柱最好用帶三通的可加壓式層析純化柱。用體積比5 1 3氯仿/乙酸乙酯做洗脫溶劑，對直徑為25mm，高為250mm的層析柱，洗脫流速為1 lOml/min，通過HTLC (高效薄層層析)檢測， 收集目標產物濃度的較高部分，合併之後進行旋轉真空蒸發濃縮乾燥。
4、純化後的脫甲基產物與D-半胱氨酸的縮合反應純化後的脫甲基產物與D-半胱氨酸水合物在鹼性混合溶劑中於室溫下避光反應 10 30min，用鹽酸調pH值至1 6，通過1000 15000r/min室溫條件下離心10 20min， 收集沉澱，並將此沉澱在真空條件下乾燥，即可得D-螢光素粗品。按上述方法得到2011052501號D-螢光素樣品、2011052502號D-螢光素樣品、 2011052503號D-螢光素樣品和Itlll.5.8號D-螢光素樣品，供下述實驗用。對比例1 反相色譜柱層析純化1、合成螢光素的柱層析純化過程1. 1、2011052502 號 D-螢光素樣品 ^9mg，經 C18 反相柱層析(1.6cmX38cm，V = 76ml)，A液30%甲醇+70%乙酸銨；B液90%甲醇+10%乙酸銨；約2. Oml/min。A液平衡120ml，上樣，A液洗50管(約IOml/管)，B液洗IOml/管約收20管。點HTLC板，收集板上目標物較多的管，合併，旋轉真空乾燥，用1 1甲醇水洗下轉入12ml離心管中， IOOOOg (10500r/min), 5. Omin，17°C離心，去上清，抽真空，通氮氣乾燥器中吸乾水份，用分析天平稱重為M2. lmg，得到純化後的D-螢光素樣品，命名為2011090801號D-螢光素樣品，得率為80. 97%。1.2、2011052502 號0-螢光素樣品 207.%^，經(18反相柱層析(1. 6cmX38cm, V =76ml)，A液30%甲醇+70%乙酸銨；B液90%甲醇+10%乙酸銨；約2. Oml/min。A液平衡120ml，上樣，A液洗50管(約IOml/管)，B液洗IOml/管約收20管。點HTLC板， 收集板上目標物較多的管，合併，旋轉真空乾燥，用1 1甲醇水洗下轉入12ml離心管中，10000g(10500r/min)，5. Omin, 17°C離心，去上清，抽真空，通氮氣乾燥器中吸乾水份， 得到純化後的D-螢光素樣品，命名為2011090901號D-螢光素樣品，用分析天平稱重為 169. lmg，得率為81. 5%01.3、2011052503 號0-螢光素樣品 27511^，經(18反相柱層析(1.6cmX8cm，V = 76ml)，A液30%甲醇+70%乙酸銨；B液90%甲醇+10%乙酸銨；約2. Oml/min。A液平衡120ml，上樣，A液洗50管(約IOml/管)，B液洗IOml/管約收20管。點HTLC板， 收集板上目標物較多的管，合併，旋轉真空乾燥，用1 1甲醇水洗下轉入12ml離心管中，10000g(10500rpm)，5. Omin，17°C離心，去上清，抽真空，通氮氣於乾燥器中吸乾水份， 得到純化後的D-螢光素樣品，命名為2011091601號D-螢光素樣品，用分析天平稱重為 228. Omg，得率為82. 91%。2、純化後的D-螢光素樣品的發光比活力測試通過HPLC檢測經柱層析純化前後的螢光素樣品中目標物質D-Luciferin的含量， 通過不含螢光素的純化螢火蟲螢光素酶檢測其發光活力，以Sigma L9504螢光素為檢測標準，其目標物質的純化得率和樣品發光活力結果見表1。表1 經C18反相柱層析純化的D-螢光素樣品其D-Luciferin的含量及樣品發光比活力
權利要求
1.一種高純度D-螢光素的製備方法，它是由2-氰基-6-甲氧基苯並噻唑和鹽酸吡啶進行高溫脫甲基反應，然後提取脫甲基反應產物，經柱層析純化，最後將純化的脫甲基產物 2-氰基-6-羥基苯並噻唑與D-半胱氨酸進行縮合反應生成D-螢光素，純化即得D-螢光素產品，其特徵在幹，所述的將純化的脫甲基產物2-氰基-6-羥基苯並噻唑與D-半胱氨酸進行縮合反應生成D-螢光素，純化即得D-螢光素產品是在充氮氣的條件下，2-氰基-6-羥基苯並噻唑與D-半胱氨酸在鹼性條件下進行縮合反應，反應完畢後在充氮氣的條件下用有一定極性的非水溶性有機溶劑進行萃取，萃取後的水相用鹽酸進行酸化，分離沉澱物，沉澱物用溶水性有機溶劑進行洗滌，離心去上清，沉澱物真空乾燥，即獲得高純度D-螢光素產品。
2.根據權利要求1所述的高純度D-螢光素的製備方法，其特徵在幹，所述的將純化的脫甲基產物2-氰基-6-羥基苯並噻唑與D-半胱氨酸進行縮合反應生成D-螢光素，純化即得D-螢光素產品，其具體步驟為純化後的脫甲基產物2-氰基-6-羥基苯並噻唑 (M176彡85% )與D-半胱氨酸鹽酸水合物按質量比1 1 1. 6在有一定極性的非水溶性有機溶劑中充氮混合，用飽和氮氣的0. 1 2mol/L的碳酸鉀溶液在充氮氣的條件下，調節其PH至8 9，反應5 60min，反應完畢在充氮氣的條件下用有一定極性的非水溶性有機溶劑萃取，水相用0. 2 lmol/L的鹽酸調節pH至1 3，分離沉澱物，再用體積比為1 5 1的水和甲醇混合液洗滌沉澱物，10000 15000r/min離心，去上清，沉澱物經真空乾燥，即可獲得高純度D-螢光素產品。
3.根據權利要求2所述的高純度D-螢光素的製備方法，其特徵在幹，所述的有一定極性的非水溶性有機溶劑為醇類、酯類或烴類或其混合物。
4.根據權利要求2所述的高純度D-螢光素的製備方法，其特徵在幹，所述的在有一定極性的非水溶性有機溶劑中充氮混合中的有一定極性的非水溶性有機溶劑為ニ氯甲烷，所述的用有一定極性的非水溶性有機溶劑萃取中的有一定極性的非水溶性有機溶劑為乙酸乙酯或ニ氯甲烷或體積比為1 1的乙酸乙酯和水混合液或體積比1 5 1的ニ氯甲烷和水的混合液。
5.根據權利要求2所述的高純度D-螢光素的製備方法，其特徵在幹，所述的萃取次數為2 3次，所述的用體積比為1 5 1的水和甲醇混合液洗滌沉澱物，洗滌次數為2次。
6.一種高純度D-螢光素產品的純化方法，其特徵在幹，將低純度的D-螢光素產品在充氮氣條件下，用鹼性溶液溶解，然後在充氮氣的條件下用有一定極性的非水溶性有機溶劑進行萃取，萃取後的水相用鹽酸進行酸化，分離沉澱物，沉澱物用溶水性有機溶劑進行洗滌，離心去上清，沉澱物真空乾燥，即獲得高純度D-螢光素產品。
7.根據權利要求6所述的高純度D-螢光素產品的純化方法，其特徵在幹，其具體步驟為將低純度的D-螢光素產品用飽和氮氣的0. 1 2mol/L的碳酸鉀溶液在充氮氣的條件下溶解，在充氮氣的條件下再用有一定極性的非水溶性有機溶劑萃取，萃取後的水相用 0. 2 lmol/L的鹽酸調節pH至1 3，分離沉澱物，再用體積比為1 5 1的水和甲醇混合液洗滌沉澱物，10000 15000r/min離心，去上清，沉澱物真空乾燥，即可獲得高純度 D-螢光素產品。
8.根據權利要求7所述的高純度D-螢光素產品的純化方法，其特徵在幹，所述的有一定極性的非水溶性有機溶劑為醇類、酯類或烴類或其混合物。
9.根據權利要求8所述的高純度D-螢光素產品的純化方法，其特徵在幹，所述的有一定極性的非水溶性有機溶劑為乙酸乙酯或ニ氯甲烷。
10.根據權利要求7所述的高純度D-螢光素的製備方法，其特徵在幹，所述的萃取次數為2 3次，所述的用體積比為1 5 1的水和甲醇混合液洗滌沉澱物，洗滌次數為2次。
全文摘要
本發明公開了一種高純度D-螢光素的製備和純化方法。本發明的製備方法是在充氮氣的條件下，2-氰基-6-羥基苯並噻唑與D-半胱氨酸在鹼性條件下進行縮合反應，反應完畢後在充氮氣的條件下用有一定極性的非水溶性有機溶劑進行萃取，萃取後的水相用鹽酸進行酸化，分離沉澱物，沉澱物用溶水性有機溶劑進行洗滌，離心去上清，沉澱物真空乾燥，即獲得高純度D-螢光素產品。利用本發明的高純度D-螢光素的製備方法，可以獲得高純度的D-螢光素產品，並且其D-螢光素的發光比活力較高，得率也高，如果用原料脫甲基產物2-氰基-6-羥基苯並噻唑的純度(M176≥85％)時，其製備的高純度的D-螢光素產品的純度可達90％(HPLC，％Wt)以上，發光比活力達到甚至高於Sigma L9504D-螢光素。
文檔編號C09K11/06GK102532053SQ20111045984
公開日2012年7月4日 申請日期2011年12月30日 優先權日2011年12月30日
發明者吳慧清, 吳清平, 張菊梅, 李程思 申請人:廣東環凱微生物科技有限公司, 廣東省微生物研究所