一種黃單胞菌生產高黏度黃原膠的發酵方法

2023-06-22 05:10:51 3

專利名稱：：一種黃單胞菌生產高黏度黃原膠的發酵方法
技術領域：
：本發明涉及利用微生物發酵工程生產黃原膠
技術領域：
，尤其是涉及一種黃單胞菌生產高黏度黃原膠的發酵方法。
背景技術：
：黃原膠(Xanthangum),又稱黃膠、漢生膠，是野油菜黃單胞菌(Xanthomonascampestris)以碳水化合物為主要原料，經發酵工程生產的一種用途廣泛的微生物胞外多糖。1952年由美國農業部依利諾斯州皮奧裡爾北部研究所分離到甘藍黑腐病黃單胞菌，並使甘藍提取物轉化為水溶性的酸性胞外雜多糖而得到。由於該多糖具有很高的黏度、流動觸變性和穩定的理化性質，且無毒，故作為添加劑在日用化學領域具有廣闊的市場前景，是目前國際上集增稠、懸浮、乳化、穩定於一體、性能最優越的生物膠，廣泛應用於食品、醫藥、採油、紡織、陶瓷、印染、香料、化妝品及消防等領域。但是，現有技術中利用微生物發酵工程生產黃原膠的生產成本是較高的，存在諸多不足與缺陷，其一傳統的黃原膠生產方法，即利用微生物發酵，用玉米澱粉或蔗糖和蛋白腖或玉米漿做發酵培養基生產黃原膠，所用原料均為多糖和蛋白質等高分子化合物，導致被微生物利用緩慢而延長發酵周期，國內文獻報導其發酵時間多在6075小時，發酵時間長自然導致對水、電、蒸汽等能源的較大消耗；而部分採用現場糖化與水解法進行降解又增加工藝成本；其二、傳統的發酵法多採用間斷補料或一次性在培養基中將營養成分配製完畢，導致接種量大而須三級或更多級發酵，傳熱不充分引起能源利用率低下，未利用原料增加發酵液黏度引起氧傳遞效率的降低；其三、由於黃原膠產品高黏度的特性而發酵本身是一個高耗氧的過程，導致發酵後期工藝嚴重缺氧，發酵時間越長產品的黏度性能會逐漸下降，例如側鏈基團的脫落和缺失，對獲得高品質的黃原膠產品越不利。長期以來研究人員一直致力於通過各種方法努力降低其生產成本，例如中國專利申請號為200810137040.5的專利文獻公開了一種黃單胞菌多糖培養基及其製備方法，特點是利用廢澱粉水做培養基。而中國專利號為ZL03124005.4的專利文獻公開了一種利用甜菜糖蜜發酵生產黃原膠的生產工藝等。本研究則針對傳統生產工藝中存在的上述問題對其發酵培養基及其發酵方法進行了研究與創新，提出了一種黃單胞菌生產高黏度黃原膠的發酵方法。
發明內容本發明要解決的技術問題就是公開一種黃單胞菌生產高黏度黃原膠的發酵方法，以克服現有技術在發酵周期、原料成本和能源消耗上存在的不足和缺陷，達到縮短髮酵周期、降低原料成本、降低能源消耗之目的。實現本發明之目的技術解決方案如下一種黃單胞菌生產高黏度黃原膠的發酵方法，包括斜面母種、搖瓶培養、種子罐培養、全培養基發酵培養、發酵液提取階段，其特徵在於全培養基發酵培養階段設計為基礎培養基發酵培養階段包括補料培養基A流加，補料培養基B流加、PH調控環節，具體步驟如下(1)根據黃單胞菌可以充分快速利用單糖和水解蛋白等碳、氮源培養基，作為發酵培養基快速增殖黃單胞菌的原理，首先配製基礎培養基，其基礎培養基組分(g/L重量體積比)與製備為葡萄糖10;水解大豆蛋白腖l;尿素2，玉米槳乾粉3;K2HP045，檸檬酸1，MgS04'7H200.3，CaC033，121。C20min滅菌，滅菌後NaOH調PH至6.5~7.5，裝料係數0.6;(2)將級聯放大培養後的黃單胞菌液體(菌種號CICC10258)接種至基礎發酵培養基中，接種量10%(體積比)，pH值控制在6.57.5，溫度3(TC，發酵時間持續8~12小時；補料培養基A和補料培養基B的組分(g/L重量體積比)與製備為a、補料培養基A玉米澱粉120，玉米漿乾粉60，檸檬酸2;b、補料培養基B玉米粉300，檸檬酸2;培養溫度3(TC，培養pH值6.57.5;培養方式耗氧培養；培養基採用上述組分，均12rC，20min滅菌製備；5(3)用流加補料的方式按一定速率補加補料培養基A和補料培養基B到基礎發酵培養基中，在其發酵液菌體繁殖到光密度為OD60010.0~12.0條件下將補料培養基A—次性補入發酵液中，發酵時間持續6~8小時即發酵前期；在補料培養基A按以上步補料結束後，即使用補料培養基B開始流加補料，快速流加補料16~20小時後將補料培養基B—次性補入發酵液中，同時將發酵液PH值調節到4.5~5.5培養，發酵時間持續持6~8小時即發酵末期結束髮酵。所述的一種黃單胞菌生產高黏度黃原膠的發酵方法，其特徵在於，補料流加方式按一定速率流加是指:補料培養基A的補料初始速率分別按30~60L/hr流加；補料培養基B的補料速率按40~50L/hr流加。所述的一種黃單胞菌生產高黏度黃原膠的發酵方法，特徵在於，發酵過程中發酵液光密度總OD600控制在13.0-15.0;當總OD600在10.012.0時將補料培養基A—次性補加至基礎發酵培養基中。所述的一種黃單胞菌生產高黏度黃原膠的發酵方法，特徵在於，所述的發酵過程中前期發酵pH值控制在6.5~7.5的範圍內，發酵末期控制在4.55.5範圍內。所述的一種黃單胞菌生產高黏度黃原膠的發酵方法，其特徵在於發酵時間周期控制在40~48小時左右。所述的碳源包括葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、玉米澱粉、土豆澱粉、玉米粉、木薯粉、薯乾粉等一種或多種；所述氮源包括硫酸銨、氯化銨、尿素、水解大豆蛋白腖、牛肉膏、酵母膏、玉米漿乾粉等一種或多種。與現有技術相比，本發明產生的優點及其有益效果是其關鍵技術是將級聯放大的黃單胞菌接入含單糖和水解蛋白等能被微生物快速利用的碳氮源培養基中，在嚴格控制發酵液光密度的情況下依次分兩步流加澱粉和含有澱粉質粗農產品，逐步增加碳氮比，通過酸鹼中和液控制發酵pH值，達到了將工藝發酵時間從60-75小時縮短至40-48小時、發酵時間縮短30%左右；將高成本的工業原料改進為低成本的初農產品替代，原料成本降低15~20%，發酵時間縮短後節約電能、工藝調整後節約消毒蒸汽致使能源消耗降低25~30%，通過試驗的數據表明，原料轉化率達到8590%，黏度提高10~20%。圖1是本發明所述的傳統發酵法各工藝步驟示意框圖。圖2是本發明所述的改進後的發酵法各工藝步驟示意框圖。圖3是本發明所述的改進後的二次發酵法產品應用性能對比圖表。具體實施例方式結合附圖與實施例對本發明做進一步的具體說明。從圖1可知，傳統的發酵法包括斜面母種、搖瓶培養、種子罐培養、二級種子培養、全培養基發酵培養、發酵液提取階段。從圖2可知，本發明所述的改進後的發酵法各工藝步驟是針對圖l傳統的發酵法中全培養基發酵培養階段，本發明進行了創新設計，將該階段設置為基礎培養基發酵培養階段包括補料培養基A流加、補料培養基B流加、PH調控等各技術環節步驟。具體步驟包括首先配製基礎發酵培養基開始發酵，其基礎發酵培養基組分(g/L重量體積比)為，葡萄糖10;水解大豆蛋白腖l;尿素2，玉米漿乾粉3;K2HP045，檸檬酸1，MgS04'7H200.3，CaC033，滅菌後NaOH調PH至6.57.5，裝料係數0.6;其次，將級聯放大培養後的菌種號為CICC10258的黃單胞菌液體接種至基礎發酵培養基中，接種量10%(體積比)，pH值控制在6.57.5，溫度3(TC，發酵時間持續8~12小時；其三，補料培養基A和補料培養基B的組分是重要的，通過試驗證明玉米澱粉與玉米漿乾粉的原料轉化率分別為88%與87%，因此選用了玉米澱粉與玉米漿乾粉等作為補料培養基的原料組分，其製備如下a、補料培養基A(g/L重量體積比)玉米澱粉120，玉米漿乾粉60，檸檬酸2;b、補料培養基B玉米粉300，檸檬酸2;培養溫度30°C，培養pH值6.57.5;培養方式耗氧培養。其四、把握好每步驟流加補料方式。需先按一定速率流加後再一次性補加；一定速率流加是指:補料培養基A的補料初始速率分別按30L/hr，40L/hr，50L/hr，60L/hr流加，補料培養基B補料速率40L/hr不變；補料培養基B的補料速率分別按30L/hr，40L/hr，50L/hr，60L/hr流加，補料培養基A補料速率50L/hr不變。用流加的方法按一定速率補加補料培養基A和補料培養基B到基礎發酵培養基中，在其發酵液菌體繁殖到光密度為OD60010.0~12.0條件下將補料培養基A—次性補入發酵液中，發酵時間持續68小時；在補料培養基A按以上步補料結束後，即使用補料培養基B開始流加補料，快速流加補料16~20小時後將補料培養基B—次性補入發酵液中，同時將發酵液PH值調節到4.55.5培養，發酵時間持續持68小時後結束髮酵，整個周期4048小時。其五，發酵過程中發酵液光密度總OD600控制在13.0~15.0也是重要的；當總OD600在10.0~12.0時將補料培養基A—次性補加至基礎發酵培養基中。其六發酵過程中，發酵前期pH值控制在6.5~7.5的範圍內，發酵末期控制在4.5~5.5範圍內。發酵時間周期控制在4048小時左右。發酵結果如下表(表l)tableseeoriginaldocumentpage8圖3是本發明所述的改進後的二次發酵法產品應用性能對比圖表，可以證明本發明產生的有益效果。所述的基礎發酵培養基所需的的碳源包括葡萄糖、庶糖、麥芽糖、玉米澱粉、土豆澱粉、玉米粉、木薯粉、薯乾粉等一種或多種可以選擇使用。基礎發酵培養基所需的氮源包括硫酸銨、氯化銨、尿素、水解大豆蛋白腖、牛肉膏、酵母膏、玉米漿乾粉等一種或多種可以選擇使用。酸鹼PH調節劑包括NaOH、碳酸鈣、氧化鈣、硫酸、磷酸等一種或多種可以選擇使用。從下面表2可知本發明所述方法與單純用澱粉或蔗糖發酵法相比，原料成本降低15~20%，能耗降低25~30%，黏度提高1020%左右。不同原料對黃原膠產量的影響(表2)tableseeoriginaldocumentpage8實施例1本發明採用二級發酵法搖瓶培養配製搖瓶培養基3L，搖瓶培養基組分(g/L體積重量比)葡萄糖15;水解大豆蛋白腖20;NaC110;PH調節到7.0，分裝6份，滅菌，超淨臺上各接lml甘油管工作種子，3(TC，16小時培養；種子罐培養種子培養基組分(g/L體積重量比)葡萄糖15;水解大豆蛋白腖20;NaCl10;配製種子培養基600L於1000L發酵罐中，PH調節到7.0，滅菌，接入搖瓶種子液，攪拌150~250轉/min，通氣0.3vvm，30°C，810小時培養，總OD到4.03移種；發酵培養基礎發酵培養基組分(g/L體積重量比)葡萄糖10;水解大豆蛋白腖l;尿素2;玉米漿乾粉3;K2HP045;檸檬酸1;MgSO4'7H2O0.3;CaC033;121。C、20min滅菌，滅菌後NaOH調pH至6.5~7.5，配製基礎發酵培養基6噸於10噸發酵罐中。補料培養基A組分(g/L體積重量比)玉米澱粉120，玉米漿乾粉60，檸檬酸2;補料培養基B組分(g/L體積重量比)玉米粉300，檸檬酸2;培養溫度30°C,培養pH值6.57.5;培養方式耗氧培養。培養基採用上述組分，均121"C，20min滅菌製備；配製補料培養基Al噸於2個600L補料罐中，5%泡敵於50L泡敵罐中，酸鹼罐空消，滅菌，種子液移種至滅菌發酵液中，100~150轉/min，通氣0.30.6vvm，PH調節至6.5，30'C培養；同時按30L/小時開始補料，每隔4小時補料速率加倍，並取樣檢測OD600，發酵過程總OD控制在13.0~15.0;當總OD在10.0時，將剩餘補料培養基A—次補入發酵液中，配製補料培養基B1噸，滅菌待用；在上步補料結束後開始按40L/小時再補料，補料時間1620小時後將剩餘補料一次性加入發酵液中，同時將PH控制在4.5到發酵結束，發酵時間周期控制在44小時左右。實施例2除變更單因素外，培養基其它成分維持不變，均121'C，20min滅菌製備；搖瓶培養配製搖瓶培養基3L，pH調節到7.0，分裝6份，滅菌，超淨臺上各接lml甘油管工作種子，30°C，16hr培養；種子培養配製種子培養基600L於1000L發酵罐中，pH調節到7.0，滅菌，接入搖瓶種子液，攪拌15CT250轉/min，通氣0.3vvm，30°C，810hr培養，總OD到4.21移種；發酵培養配製發酵培養基6噸於10噸發酵罐中，配製補料培養基A1噸於2個600L補料罐中，5%泡敵於50L泡敵罐中，酸鹼罐空消，滅菌，種子液移種至滅菌發酵培養液中，100150轉/min，通氣0.30.6vvm，pH調節至6.9，30。C培養；同時按40L/hr開始補料，每隔4hr補料速率加倍，並取樣檢測0D600，發酵過程總OD控制在13.015.0;當總0D在10.93時，將剩餘補料培養基A—次補入發酵液中，並配製補料培養基B1噸，滅菌待用；在上步補料結束後開始按40L/hr補料，補料時間16~20hr後將剩餘補料一次性加入發酵液中，同時將pH控制在4.9到發酵結束，發酵時間周期控制在40小時左右。實施例3除變更單因素外，培養基其它成分維持不變，均121'C，20min滅菌製備；搖瓶培養配製搖瓶培養基3L，pH調節到7.0，分裝6份，滅菌，超淨臺上各接lml甘油管工作種子，30°C，16hr培養；種子培養配製種子培養基600L於1000L發酵罐中，pH調節到7.0，滅菌，接入搖瓶種子液，攪拌150~250轉/rain，通氣0.3vvm，30°C，8~10hr培養，總OD到4.18移種；發酵培養配製發酵培養基6噸於10噸發酵罐中，配製補料培養基A1噸於2個600L補料罐中，5W包敵於50L泡敵罐中，酸鹼罐空消，滅菌，種子液移種至滅菌發酵培養液中，100150轉/min，通氣0.3~0.6vvm，pH調節至7.2，3(TC培養；同時按50L/hr開始補料，每隔4hr補料速率加倍，並取樣檢測0D600，發酵過程總OD控制在13.0~15.0;當總OD在11.54時，將剩餘補料培養基A一次補入發酵液中，並配製補料培養基B1噸，滅菌待用；在上步補料結束後開始按40L/hr補料，補料時間1620hr後將剩餘補料一次性加入發酵液中，同時將pH控制在5.2到發酵結束，發酵時間周期控制在45小時左右。實施例4除變更單因素外，培養基其它成分維持不變，均12廠C，20min滅菌製備；搖瓶培養配製搖瓶培養基3L，pH調節到7.0，分裝6份，滅菌，超淨臺上各接lml甘油管工作種子，30°C，16hr培養；種子培養配製種子培養基600L於1000L發酵罐中，pH調節到7.0，滅菌，接入搖瓶種子液，攪拌15CT250轉/min，通氣0.3vvm，30°C，810hr培養，總OD到4.33移種；發酵培養配製發酵培養基6噸於10噸發酵罐中，配製補料培養基A1噸於2個600L補料罐中，5y。泡敵於50L泡敵罐中，酸鹼罐空消，滅菌，種子液移種至滅菌發酵培養液中，10(Tl50轉/min,通氣0.3~0.6vvm，pH調節至7.5，3(TC培養；同時按60L/hr開始補料，每隔4hr補料速率加倍，並取樣檢測OD600，發酵過程總OD控制在13.0-15.0;當總OD在12.0時，將剩餘補料培養基A—次補入發酵液中，並配製補料培養基B1噸，滅菌待用；在上步補料結束後開始按40L/hr補料，補料時間16~20hr後將剩餘補料一次性加入發酵液中，同時將pH控制在5.5到發酵結束，發酵時間周期控制在48小時左右。最佳實施例各培養基按權利要求書中的比例配製並滅菌；搖瓶培養配製搖瓶培養基3L，pH調節到7.0，分裝6份，滅菌，超淨臺上各接lml甘油管工作種子，3(TC，16h培養；種子培養配製種子培養基600L於1000L發酵罐中，pH調節到7.0，滅菌，接入搖瓶種子液，攪拌150~250轉/min，通氣0.3vvm，30°C，10h培養，總OD到4.2移種；發酵培養配製發酵培養基6噸於10噸發酵罐中，配製1)補料培養基1噸於2個600L補料罐中，5y。泡敵於50L泡敵罐中，酸鹼罐空消，滅菌，種子液移種至滅菌發酵液中，100~150轉/min，通氣0.30.6vvm，pH調節至7土0.5，3(TC培養；同時按40L/h開始補加補料培養基A，每隔4h補料速率加倍，並取樣檢測0D600，發酵過程總OD控制在13.0~15.0;當總OD在10.80時，將剩餘補料培養基A—次補入發酵液中，並配製補料培養基B1噸，滅菌待用；在上步補料結束後開始按50L/hr補料，補料時間16hr後將剩餘補料一次性加入發酵液中，同時將pH控制在5.0士0.2，8hr後結束髮酵。發酵過程數據如下:項目^\048121620242832364044溫度'c130.030.130.230.230.130.030.029.929.629.729.829.6230,130.230.830.130.130.229.829.729.129.930.2329.730.230.130.130.129.929.829.730.127.530.229.8pH16.997.197.036.956.986,987.006.986.986.935.105.0126.736.877.006.966.996.997.007.077,005.034.896.676.837.357.146.706.826.997.447.357.234.935.05溶氧。/n191.969.649.633.629.10.425.313.20.823.610.40.4297.490.933.51.605.50005070.395.163.655.2000001000轉速r/min199100100101150150151149.15014814914921021011001011501511501491491491483102100100100151150150149151150149147空氣流量L/m10.30.30.30.40.50.60.60.60.60.60.60.620.30.30.40.50.60.60.60.60.60.60.630.40.40.40.50.60.60.60.60.60.60.60.6罐壓MPa,10.040.040.040.040.040.050.060.060.060.060.060.0620.040.040.030.040.040.060.070.070.070.070.0630.040.040.030.030.040.060.060.060.060.060.060.06下面提供本發明所做的研究試驗實施例數據:1、不同補料培養基對黃原膠產量的影響試驗除補料培養基外，其餘培養基中碳源採用葡萄糖，氮源採用水解大豆蛋白腖，其餘成分維持不變，在補料培養基A成分改變時，補料培養基B不變，反之亦然，發酵工藝方法同上；1)補料培養基A碳源分別採用蔗糖、玉米澱粉、玉米粉，氮源採用玉米漿乾粉，補料培養基B用蔗糖作為碳源；2)補料培養基B碳源分別採用蔗糖、玉米澱粉、玉米粉；補料培養基A碳源用玉米澱粉，氮源用玉米漿乾粉。發酵結果如下表試驗l)12tableseeoriginaldocumentpage13試驗2):tableseeoriginaldocumentpage133、補料更換菌體濃度對黃原膠產量的影響實驗設計發酵工藝方法不變，培養基配方按權利要求書中所述配方；補料培養基A更換為B時的發酵液總0D600分別為9.0、10.5、11.5、13.0進行發酵實驗；發酵結果如下:tableseeoriginaldocumentpage144、本發明與其它廠家生產的黃原膠性能對比情況A:本發明所述方法生產的黃原膠，B、C:國內其它兩個廠家生產地黃原膠；將三種黃原膠按相同比例與其他成分復配進行檢測，數據如下tableseeoriginaldocumentpage14權利要求1、一種黃單胞菌生產高黏度黃原膠的發酵方法，包括斜面母種、搖瓶培養、種子罐培養、全培養基發酵培養、發酵液提取階段，其特徵在於全培養基發酵培養階段設計為基礎培養基發酵培養階段包括補料培養基A流加，補料培養基B流加、PH調控環節，具體步驟如下(1)根據黃單胞菌可以充分快速利用單糖和水解蛋白等碳、氮源培養基，作為發酵培養基快速增殖黃單胞菌的原理，首先配製基礎培養基，其基礎培養基組分(g/L重量體積比)與製備為葡萄糖10；水解大豆蛋白腖1；尿素2，玉米漿乾粉3；K2HPO45，檸檬酸1，MgSO4·7H2O0.3，CaCO33，121℃20min滅菌，滅菌後NaOH調PH至6.5~7.5，裝料係數0.6；(2)將級聯放大培養後的黃單胞菌液體(菌種號CICC10258)接種至基礎發酵培養基中，接種量10％(體積比)，pH值控制在6.5~7.5，溫度30℃，發酵時間持續8~12小時；補料培養基A和補料培養基B的組分(g/L重量體積比)與製備為a、補料培養基A玉米澱粉120，玉米漿乾粉60，檸檬酸2；b、補料培養基B玉米粉300，檸檬酸2；培養溫度30℃，培養pH值6.5~7.5；培養方式耗氧培養；培養基採用上述組分，均121℃，20min滅菌製備；(3)用補料流加的方式按一定速率補加補料培養基A和補料培養基B到基礎發酵培養基中，在其發酵液菌體繁殖到光密度為OD600條件下將補料培養基A一次性補入發酵液中，發酵時間持續6~8小時即發酵過程前期；在補料培養基A按以上步補料結束後，即使用補料培養基B開始流加補料，快速流加補料16~20小時後將補料培養基B一次性補入發酵液中，同時將發酵液PH值調節到4.5~5.5培養，發酵時間持續持6~8小時即發酵末期結束髮酵。2、根據權利要求1所述的一種黃單胞菌生產高黏度黃原膠的發酵方法，其特徵在於，補料流加方式按一定速率流加是指補料培養基A的補料初始速率分別按30~60L/hr流加；補料培養基B的補料速率按40~50L/hr流加。3、根據權利要求1所述的一種黃單胞菌生產高黏度黃原膠的發酵方法，其特徵在於，發酵過程中發酵液光密度總0D600控制在13.015.0;當總OD600在10.012.0時將補料培養基A—次性補加至基礎發酵培養基中。4、根據權利要求1所述的一種黃單胞菌生產高黏度黃原膠的發酵方法，其特徵在於，所述的發酵過程前期發酵pH值控制在6.5、.5的範圍內，發酵末期pH值控制在4.55.5的範圍內。5、根據權利要求1所述的一種黃單胞菌生產高黏度黃原膠的發酵方法，其特徵在於發酵時間周期控制在4048小時左右。全文摘要本發明公開一種黃單胞菌生產高黏度黃原膠的發酵方法，涉及利用微生物發酵工程生產黃原膠
技術領域：
。傳統的黃單胞菌生產黃原膠的發酵方法，包括斜面母種、搖瓶培養、種子罐培養、全培養基發酵培養、發酵液提取階段；本發明將發酵培養階段設計為基礎培養基發酵培養階段包括補料培養基A流加、料培養基B流加、pH調控環節。在嚴格控制發酵液光密度的情況下依次分兩步流加澱粉和含有澱粉質粗農產品，逐步增加碳氮比，通過酸鹼中和液控制發酵pH值，達到了將工藝發酵時間從60-75小時縮短至40-48小時，高成本的工業原料改進為低成本的初農產品替代，原料成本降低15～20％，發酵時間縮短使能源消耗降低25～30％，通過試驗數據表明，原料轉化率達到85～90％，黏度提高10～20％。文檔編號C12R1/64GK101560537SQ20091005932公開日2009年10月21日申請日期2009年5月19日優先權日2009年5月19日發明者張永奎,李亨全申請人:四川恆益科技有限公司