編碼產黃青酶穀胱苷肽轉移酶的基因及其應用的製作方法
2023-06-22 22:16:51
專利名稱：編碼產黃青酶穀胱苷肽轉移酶的基因及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及新的分離的多核苷酸，具體地說涉及來自產黃青黴的新的編碼穀胱苷肽轉移酶的基因(PcGSTA)。
本發明還涉及該基因編碼的多肽。
本發明還涉及含有該基因的表達載體。
本發明也提供了新基因在提高產黃青黴菌的青黴素產量中的應用。
背景技術：
青黴素是一種重要的β-內醯胺抗生素。在工業生產中，生產菌株Penicillinchrysogenum必需利用苯乙酸作為前體生成青黴素G。苯乙酸要加入到青黴素中首先須經苯乙醯-CoA連接酶激活形成CoA的形式，然後與異青黴素N發生醯基交換，生成終產物青黴素G。該步反應由acyl-CoA6APA轉醯基酶催化，由於該酶有很廣的底物特異性，苯乙酸必須過量的加入到培養基中以促進青黴素G的生成而不是生成其他的青黴素。側鏈前體的利用效率很大程度上依賴於其毒性和對氧化作用的抗性。在工業發酵條件下，並不是所有的苯乙酸都流向青黴素，還有一部分通過其他的途徑代謝掉，如可被細胞色素P450家族的phenylacetate 2-hychorxylase氧化，從而進一步被分解。
有研究表明，穀胱甘肽(glutathione，GSH)相關的代謝途徑可能與苯乙酸的解毒過程有關(Monks et al.1990，Toxicol.Appl.Pharmacol.1061-19；Commandeur et al.1995，Pharmacol.Rev.47271-330；Emri et al.2000，J.Basic.Microbiol.4093-104)。另一方面，GSH在結構上類似於青黴素生物合成途徑中的關鍵中間體-δ-(L-α-氨基已二醯)-L-半胱氨醯-D-纈氨酸(LLD-ACV)，高濃度的GSH可能會對LLL-ACV產生競爭性抑制，從而影響青黴素的合成。
穀胱甘肽S-轉移酶(GST；EC 2.5.1.18)是以二聚體形式存在的II期脫毒酶，可使許多有潛在毒性的異生物質與穀胱甘肽(GSH)連接，然後使帶有GSH分子「標籤」的代謝物被液泡膜或質膜上的「ATP結合性盒型」轉運蛋白識別，並運進液泡或質外體，從而起到解毒作用。GSTs在許多需氧的真核生物和原核生物中存在，根據其基本結構和三級結構，底物和抑制劑的特異性及免疫學特徵，哺乳動物的胞質GSTs已被很好的定性並分為alpha(α)、mu(μ)、pi(π)和theta(θ)類。一些新的GSTs種類從各種生物中發現，如sigma、kapa、zeta及omega。Phi和Tau及Beta類分別是植物和細菌所特有的種類。來自昆蟲的各種GSTs均與對抗生素的耐藥性有關。但關於真菌GSTs的分子系統發育只有很少報導。然而現已很清楚GSTs同工酶在許多真菌存在，如Schizosaccharomyces Pombe，Asperqillus niclulans，Saccharomyces cerevisiae，Issathchenbia orientales，Yarrowia lipalytia，Cunninghamella elegans，Mucorcircinelloides及Phanerochaete chrysosporium，Emericella nidulans，Aspergillusfumigutus。真菌的GSTs具不同的表達模式，在代謝過程中有不同的功能，如在異生物質解毒、真菌耐藥性、抗氧化脅迫及重金屬毒性中起作用。
EMRI等人從酶學角度對產黃青黴P.chrysogenum的GSH代謝及GST進行了廣泛研究，試圖揭示細胞中GSH的濃度、GSH相關的PA代謝及青黴素產量的關係，從而開發出新的高產發酵工藝。研究結果顯示，在青黴素的生物合成過程中在培養基中增加PA會增大GSTs的表達量，但所有有利於提高青黴素產量的培養基成分的改變同樣也有利於GSH的形成。
至今還未見到產黃青黴中GST相關基因研究的報導。
因此，產黃青黴中穀胱苷肽轉移酶編碼基因的克隆及深入研究將進一步揭示苯乙酸的代謝機制，為青黴素生產菌種的基因工程改造提供新的方向和靶點。
發明內容
本發明的一個目的在於提供新的編碼產黃青黴穀胱苷肽轉移酶的基因，定名為PcGSTA。
本發明的另一個目的在於提供上述基因編碼的多肽。
本發明的再一個目的在於提供含有上述基因序列的表達載體。
根據本發明的一方面，編碼產黃青黴穀胱苷肽轉移酶的基因，來源於產黃青黴菌(Penicillium chrysogenum)，名稱為PcGSTA，其編碼238個胺基酸，分子量26.9kDa的蛋白質，如序列表中SEQ ID NO.2所示。序列比對，其胺基酸序列具有穀胱甘肽轉移酶(GST)的保守結構域，與真菌GST家族的蛋白高度相似，其中與Botryotinia fuckeliana穀胱甘肽轉移酶(AAG43132)有54％的一致性，與Emericella nidulans GST(AAM48104)有52％的一致性，與Aspergillus fumigutus gstA(AAX07321)、gstB(AAX070318)gstC(AAX070319)的胺基酸序列一致性分別為52％，45％，37％，與Schizosaccharomyces PombeGST-II(O59827)的序列一致性為41％。採用基因工程技術，將本發明分離的基因在表達載體中表達時，其表達的蛋白具有穀胱苷肽轉移酶活性。具體地說，本發明提供了含有下述序列之一的分離的多核苷酸(1)序列表中的SEQ ID No1；(2)編碼序列表中SEQ ID No2蛋白質序列的多核苷酸；(3)與序列表中SEQ ID No1限定的cDNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質的cDNA序列；序列表中SEQ ID No1的cDNA序列長度為717bp。
上述涉及的多核苷酸還包括取代、缺失、和插入變體以及等位變體、剪接變體、片段、衍生物等，其中可以通過取代、缺失、插入或衍生一個或多個核苷酸。優選的這些多核苷酸是那些編碼具有生物學活性的穀胱苷肽轉移酶的多核苷酸。
本領域技術人員可以理解的是，上述的分離的多核苷酸也包括那些與SEQID NO.1所示序列具有較高同源性的序列，例如同源性大於90％、甚至95％、甚至98％的序列；還包括那些在嚴謹條件下可與SEQ ID NO.1所示序列雜交的序列；或者可與SEQ ID NO.1所示序列互補的序列。
根據本發明的另一方面，提供新的多肽，其含有上述核苷酸序列所編碼的胺基酸序列，即含有SEQ ID NO.2所示的序列，編碼蛋白為產黃青黴(Penicillium chrysogenum)的一種GST，名稱為PcGSTA，是具有序列表中SEQID No2的胺基酸殘基序列的蛋白質或將SEQ ID No2的胺基酸殘基序列經過一個或幾個胺基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與SEQ ID No2相同活性的由SEQ ID No2衍生的蛋白質。序列表中的SEQ ID No2是由239個胺基酸殘基組成。
根據本發明的另一方面，本發明亦提供包括一種或多種上述多核苷酸的重組載體，以及包含上述多核苷酸的載體的基因工程宿主細胞。在優選的實施方案中，這種重組載體包括上述的多核苷酸，它編碼含SEQ ID NO2的多肽，其含SEQ ID NO1的序列所示的多核苷酸。在本發明的一個具體實施方案中，構建了含本發明多核苷酸的原核表達載體並成功地表達出具有GST活性的蛋白。
本發明也涉及到包括任何一種上述重組載體的宿主細胞。在已經構建載體之後，可以插入全部或部分載體至適合的宿主細胞，以便擴增和/或多肽表達。宿主細胞可以是原核生物宿主細胞(例如E.coli)或者真核生物宿主細胞(例如絲狀真菌細胞、酵母細胞，昆蟲細胞，或脊椎動物細胞)。
本發明同時提供了苯乙酸對本發明的新基因PcGSTA的表達的影響，進而提供了將本發明的新基因PcGSTA應用於產黃青黴菌改造以提高青黴素產量的途徑。
本發明從產黃青黴中成功地分離獲得了編碼新的產黃青黴穀胱苷肽轉移酶的基因，並構建了基因工程載體和宿主，表達出了有GST活性的蛋白，而且證明了該基因的表達與苯乙酸的補加相關，本發明為利用基因工程手段改造產黃青黴菌從而提高青黴素產量提供了方向和靶點，對於青黴素的生產具有重要意義。
附圖的簡要說明
圖1為PcGSTA蛋白的表達及純化後的SDS-PAGE結果圖；其中泳道1，2，3，4，5，6分別為誘導前總蛋白、誘導後總蛋白、誘導後上清蛋白，誘導後沉澱蛋白，純化後PcGSTA，蛋白分子量標準；圖2為苯乙酸對不同產量菌株的PcGSTA表達影響的定量PCR分析結果。
發明的
具體實施例方式
下面結合附圖，通過對本發明較佳實施例的描述，詳細說明本發明。
在下面使用的試劑材料如無特別說明，均為市售分析純試劑，購自天津試劑公司。
實施例1PcGSTA基因的克隆將產黃青黴WIS 54-1255(ATCC28089)在YPD(1％酵母提取物，2％蛋白腖，2％葡萄糖)培養基中培養24小時，過濾收集菌絲，取0.1克溼菌絲液N2研磨，加1ml Trizol試劑(Invitrogen公司，15596-260)抽提產黃青黴總RNA，將所得產黃青黴總RNA溶解於DEPC水中，-70℃下保存備用。另取0.1克菌絲，加液N2磨碎後用Easy-DNA kit(Invitrogen公司，K1800-01)提取產黃青黴基因組DNA。
為去除RNA中可能的DNA汙染，取產黃青黴總RNA 5μg，在100μl反應體系中加入5μlRQ1 RNase-free DNase(Promega公司，M6101)，10μlRQ1RNase-free DNase反應緩衝液(10X)，37℃保溫30分鐘，用酚氯仿抽提，乙醇沉澱，溶於10μlDEPC水。取5μl去除DNA的RNA樣品，用隨機引物(Random Hexamers，Promega公司，C1181)進行反轉錄，得cDNA，所用反轉錄酶為SuperscriptTMII RNase H-(Inritrogen公司，18064-022)。
以cDNA為模板進行，以pg15』-cat ATGTCTTCAAAC ATT ACC CTG-3』和pg25』-ggattcTCA ATG CTG ATC GGA AGT AG-3』為引物做PCR擴增，PCR條件為94℃5分鐘；94℃1分鐘，56℃1分鐘，72℃1分鐘-35cycles；72℃7分鐘。
將RT-PCR產物按常規方法克隆到pGEM-T載體(Promega公司)並測序，結果表明該RT-PCR產物具有SEQ ID NO.1的開放閱讀框架，長度為717bp。將其命名為PcgstA。
以基因組DNA為模版，以pg1/pg2為引物做PCR，得到PcgstA的基因組序列，通過與cDNA序列比較，證明該基因有2個內含子，長度分別為64bp，59bp。
PcgstA編碼238個胺基酸，分子量26.9kDa的蛋白質，如序列表中SEQ IDNO.2所示。序列比對，其胺基酸序列具有穀胱甘肽轉移酶(GST)的保守結構域，與真菌GST家族的蛋白高度相似，其中與Botryotinia fuckeliana穀胱甘肽轉移酶(AAG43132)有54％的一致性，與Emericella nidulans GST(AAM48104)有52％的一致性，與Aspergillus fumigutus gstA(AAX07321)、gstB(AAX070318)gstC(AAX070319)的胺基酸序列一致性分別為52％，45％，37％，與Schizosaccharomyces Pombe GST-II(O59827)的序列一致性為41％。
實施例2PcGSTA的原核表達原核表達載體pET-11a購自Stratagene公司。
用限制性內切酶Nde I，BamH I將PcgstA從載體pGEM-T上切下，與用同樣酶切得的載體pET-11a連接，得到質粒pET/GSTA。
將構建好的質粒pET/GSTA轉化表達宿主菌BL21(DE3)-RP，挑取陽性克隆至LB培養基(酵母粉蛋白腖NaCl)37℃培養至OD600＝0.6，加入0.5mmol/L IPTG誘導外源基因表達，37℃200rpm繼續培養3.5小時，收集菌體，SDS-PAGE分析。
稱取菌體0.4g用16ml Buffer A(50mmol/L Tris-HCl pH7.5，0.5mmol/LEDTA，50mmol/L NaCl，5％甘油)重懸，超聲破碎，10,000g 4℃10min離心，分別取上清和沉澱，SDS-PAGE電泳分析，結果表明重組表達的PcGSTA只有少部分為可溶性蛋白，絕大多數為包涵體的形式存在，結果見圖1。
實施例3重組PcGSTA蛋白的純化將包涵體用含2％的脫氧膽酸鈉的Buffer A洗2次，每次均先室溫放置10min，然後10,000g 4℃10min離心，棄上清。沉澱溶於含0.3％十二烷基肌氨酸鈉的BufferA，室溫放置30min，4℃透析過夜，SDS-PAGE檢驗純度達80％以上。
實施例4PcGSTA的活性測定PcGSTA的活性測定按照(Habig W.H.Jakoby W.B.Methods Enzymol 77398-405.1981)方法選用底物為CDNB(1-chloro-2，4-dinitrobenzene)，100μl反應體系，反應基質為0.1mol/L的磷酸鈉緩衝液(pH6.5)，CDNB和GSH的終濃度分別為1mol/L和0.5mol/L，加入純化的PcGSTA約5.38μg，按OD340的增加值測定反應速度，用考馬斯亮藍法測定蛋白濃度，結果表明透析後的PcGSTA比活性為9.67U/mgProtein，Km CDNB為7.52μmol/L，Vmax CDNB為78.9μmol/min.mgProtein。
實施例5苯乙酸對PcgstA表達的影響選用產黃青黴菌株WIS54-1255在YPD培養基中培養68h，分兩種處理方法，一種在培養過程中補加0.2ml13％的苯乙酸(PA)三次，另一種不補PA。收集菌絲，提取RNA，用RNase free的DNase處理後作定量PCR，試劑為SYBR Green，儀器為ABI PRISM 7000定量PCR儀。結果顯示，加入PA對PcgstA表達均有明顯的抑制作用。結果見圖2。
以上對本發明的詳細描述並不限制本發明，本領域技術人員可以根據本發明做出各種改變和變形，只要未脫離本發明的精神，均應屬於本發明權利要求所定義的範圍。
05P101405.ST25.txtSEQUENCE LISTING110華北製藥集團新藥研究開發有限責任公司120編碼產黃青酶穀胱苷肽轉移酶的基因及其應用13005P1014051602170PatentIn version 3.12101211717212DNA213產黃青黴菌(Penicillium chrysogenum)220
221CDS222(1)..(717)223編碼穀胱甘肽轉移酶4001atg tct tca aac att acc ctg tat agc tgg cct acg ccg aat ggc gtc 48Met Ser Ser Asn Ile Thr Leu Tyr Ser Trp Pro Thr Pro Asn Gly Val1 5 10 15aaa gcc tcc atc acc ctc gaa gaa ctt ggg ctg tct tat aaa gcc gaa 96Lys Ala Ser Ile Thr Leu Glu Glu Leu Gly Leu Ser Tyr Lys Ala Glu20 25 30ggc ctt gat atc tcc tcc agc tca aat ccc cag aag gaa gaa tgg ttc144Gly Leu Asp Ile Ser Ser Ser Ser Asn Pro Gln Lys Glu Glu Trp Phe35 40 45ctg aag att aat ccc aat ggc cgc atc ccc gcc cta ctc gat ggt tcg192Leu Lys Ile Asn Pro Asn Gly Arg Ile Pro Ala Leu Leu Asp Gly Ser50 55 60cag cgc gtt ttc gag agc gga gca atc atg aca tat cta gtt gac aag240Gln Arg Val Phe Glu Ser Gly Ala Ile Met Thr Tyr Leu Val Asp Lys65 70 75 80tac gac acc gac cgc aag atc agt tac gct ccc ggc atc cct gag cac288Tyr Asp Thr Asp Arg Lys Ile Ser Tyr Ala Pro Gly Ile Pro Glu His85 90 95gcc gaa caa acc tcc tgg ttg atg ttc cag atg gct ggt ctc ggg cct336Ala Glu Gln Thr Ser Trp Leu Met Phe Gln Met Ala Gly Leu Gly Pro100 105 110att caa gga caa gcg aac cat ttc cgt ctc ttc gcc aac acg cgc tcc384Ile Gln Gly Gln Ala Asn His Phe Arg Leu Phe Ala Asn Thr Arg Ser
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1.一種分離的多核苷酸，含有下述核苷酸序列之一(1)SEQ ID No1所示的序列；(2)編碼SEQ ID No2所示的蛋白質序列的多核苷酸序列；(3)與SEQ ID No1所示的cDNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質的cDNA序列。
2.一種分離的多核苷酸，含有與權利要求1所示的核苷酸序列互補的核苷酸序列。
3.由權利要求1所述的核苷酸序列編碼的多肽。
4.權利要求3所述的多肽，其具有SEQ ID NO.2所示的序列，具有穀胱苷肽轉移酶活性。
5.含有權利要求1所述的多核苷酸的表達載體。
6.權利要求5所述的表達載體，其中所述的表達載體為原核表達載體。
7.含有權利要求5所述的表達載體的宿主細胞。
8.權利要求1所述的分離的多核苷酸在提高產黃青黴菌的青黴素產量中的應用。
全文摘要
本發明涉及來自產黃青黴的新的編碼穀胱苷肽轉移酶的基因(PcGSTA)，該基因編碼的多肽及含有該基因的表達載體。本發明同時提供了苯乙酸對本發明的新基因PcGSTA的表達的影響，進而提供了將本發明的新基因PcGSTA應用於產黃青黴菌改造以提高青黴素產量的途徑。
文檔編號C12N15/63GK1978652SQ20051012615
公開日2007年6月13日 申請日期2005年11月30日 優先權日2005年11月30日
發明者王富強, 鄭桂珍, 趙穎, 任志紅, 穆岷, 豐玫玫, 蘇彩雲, 張春珍, 賈茜, 賀建功 申請人:華北製藥集團新藥研究開發有限責任公司