一種腺苷高半胱氨酸酶基因啟動子區甲基化程度檢測試劑盒及測定方法與流程

2023-06-22 22:41:46 2

本發明屬於生物
技術領域：
，具體涉及一種腺苷高半胱氨酸酶基因啟動子區甲基化程度檢測試劑盒及測定方法。
背景技術：
：腦卒中(cerebralstroke)是一種急性腦血管疾病，是由於腦部血管突然破裂或因血管阻塞導致血液不能流入大腦而引起腦組織損傷的一組疾病，包括缺血性和出血性卒中。腦卒中具有發病率高、死亡率高和致殘率高的特點，臨床表現為嚴重頭痛、昏厥、失去意識等，這也成為了中國成年人殘疾的首要原因。腦卒中患者需要長期服用降壓藥，定期進行常規檢查，控制顱內壓，可見腦卒中患者給社會和家庭帶來了極大的經濟負擔。腦卒中是一種由遺傳和環境因素共同作用引起的複雜性疾病，對腦卒中發病機制的探索進而尋找出適合診斷治療藥物已然成為了現今研究的一個熱點。而在腦卒中的發病機制尚未清晰闡明的情況下，對腦卒中的預防以及早期檢測更是刻不容緩。腺苷高半胱氨酸酶(adenosylhomocysteinase，ahcy)是一種蛋白編碼基因，它能夠催化s-腺苷同型半胱氨酸可逆水解為腺苷和l-高半胱氨酸。該蛋白的缺乏是高蛋氨酸血症的極大風險因素，進而提高腦卒中的患病風險。腺苷高半胱氨酸酶是由位於20號染色體的腺苷高半胱氨酸酶基因(adenosylhomocysteinasegene，ahcy)(chr20：34234840-34311976)編碼而成的。現在國內外的研究已經確定同型半胱氨酸水平與腦卒中的發生有著較大的關聯，但是對同型半胱氨酸水平的影響因素與其調控機制的研究較少。目前關於腺苷高半胱氨酸酶基因啟動子區甲基化程度檢測試劑盒和測定方法。技術實現要素：為了克服現有技術的不足，本發明的目的在於提供一種腺苷高半胱氨酸酶基因啟動子區甲基化程度檢測試劑盒，對指定基因啟動子區域dna甲基化水平的進行測定，是一種檢測方便、普適度高、準確率高的檢測試劑盒。本發明的另一目的在於提供一種腺苷高半胱氨酸酶基因啟動子區甲基化程度的測定方法，該方法檢測方便、普適度高、準確率高。為實現本發明的第一個目的本發明所採用的技術方案如下：一種腺苷高半胱氨酸酶基因啟動子區甲基化程度檢測試劑盒，該檢測試劑盒包括dan提取液、螢光定量pcr反應液、陽性對照、陰性對照和多個帶蓋密封管，所述螢光定量pcr反應液包括一對腺苷高半胱氨酸酶基因啟動子區甲基化特異性擴增引物：primerf：5』-ggtcgtaatcggttgtag-3』(seqidno.1)和primerr：5』-caattcctattcccaaactaaa-3』(seqidno.2)。作為進一步的方案，本發明所述的檢測試劑盒還包括洗滌液和洗脫液。作為進一步的方案，本發明所述的螢光定量pcr反應液還包括10×pcrbuffer、mgcl2、dntps、熱啟動taqdna酶、dna模板、無菌雙蒸水以及螢光染料。作為進一步的方案，本發明所述的螢光染料為2×sybrgreeni。作為進一步的方案，本發明所述的pcr反應液為10×pcrbuffer2μl、25mmol/lmgcl21.5μl、2.5mmol/ldntps1.5μl、10μmprimerf0.25μl、10μmprimerr0.25μl、5u/μl熱啟動taqdna酶0.2μl、dna模板1μl、2×sybrgreeni5μl、無菌雙蒸水補足至20μl。作為進一步的方案，本發明所述的陽性對照為正常人樣本的基因組完全甲基化後所得到的完全dna甲基化樣本；所述陰性對照為無菌雙蒸水。為實現本發明的第二個目的本發明所採用的技術方案如下：一種腺苷高半胱氨酸酶基因啟動子區甲基化程度的測定方法，其包括dna提取步驟：提取全血基因組dna並檢測dna的濃度；用甲基化試劑盒對全血基因組dna進行亞硫酸氫鹽轉化步驟：用ezdnamethylation-gold試劑盒將上述提取額全血基因組dna與亞硫酸氫鹽反應會使單鏈中未甲基化的胞嘧啶轉變為胸腺嘧啶，然後經過上樣、洗滌、洗脫等步驟得到轉化後的dna；dna甲基化水平測定步驟：上述轉化後的dna作為樣本dna加入含螢光定量pcr反應液進行pcr擴增反應，使基因序列進行倍數擴增，每一個樣本dna對應一個的擴增曲線；曲線與既設閾值相交的橫坐標點即為ct值，並通過下述計算式計算出甲基化率：δδct＝dna樣本(ct靶基因-ctactb)-陽性對照(ct靶基因-ctactb)；其中，δδct是指甲基化率，ct靶基因是指目標基因的pcr循環數即腺苷高半胱氨酸酶基因的ct值，ctactb是指一種常用的內參基因即actb的pcr循環數。作為進一步的方案，上述測定方法中所述的pcr反應液為10×pcrbuffer2μl、25mmol/lmgcl21.5μl、2.5mmol/ldntps1.5μl、10μmprimerf0.25μl、10μmprimerr0.25μl、5u/μl熱啟動taqdna酶0.2μl、dna模板1μl、2×sybrgreeni5μl、無菌雙蒸水補足至20μl。作為進一步的方案，上述測定方法中所述的甲基化水平測定步驟具體如下：首先將轉化後的dna樣本加入到熱啟動taqdna酶中，然後加入一對腺苷高半胱氨酸酶基因啟動子區甲基化特異性擴增引物primerf和primerr；最後依次加入dna模板、10×pcrbuffer、mgcl2、dntps、2×sybrgreeni以及無菌雙蒸水。作為進一步的方案，上述測定方法中所述的pcr擴增反應條件如下：預變性95℃，10min；95℃，20s，退火溫度，20s，72℃，single，30s，45個循環；溶解曲線95℃，15s，60℃，60s，95℃，continuous；保溫40℃，10min。相比現有技術，本發明的有益效果在於：1.本發明所述的腺苷高半胱氨酸酶基因啟動子區甲基化程度檢測試劑盒採用螢光定量pcr技術，具有實時監測，特異性強，精確定量的優勢，確保診斷結果的精確性；2.本發明所述的腺苷高半胱氨酸酶基因啟動子區甲基化程度檢測試劑盒是基於血漿、唾液、尿液等體液檢查的試劑盒，隨時隨地進行檢測，並且能在較短時間內取得檢測結果；3.本發明所述的腺苷高半胱氨酸酶基因啟動子區甲基化程度檢測試劑盒檢測費用低、易於為大眾所接受。下面結合具體實施方式對本發明作進一步詳細說明。附圖說明圖1為腺苷高半胱氨酸酶基因的染色體定位圖。圖2為腺苷高半胱氨酸酶基因的測序圖。圖3為腺苷高半胱氨酸酶基因的電泳圖。具體實施方式本發明所述的腺苷高半胱氨酸酶基因啟動子區甲基化程度檢測試劑盒，該檢測試劑盒包括dan提取液、螢光定量pcr反應液、陽性對照、陰性對照和多個帶蓋密封管，所述螢光定量pcr反應液包括一對腺苷高半胱氨酸酶基因啟動子區甲基化特異性擴增引物：primerf：5』-ggtcgtaatcggttgtag-3』(seqidno.1)和primerr：5』-caattcctattcccaaactaaa-3』(seqidno.2)。作為進一步的方案，本發明所述的檢測試劑盒還包括洗滌液和洗脫液。作為進一步的方案，本發明所述的螢光定量pcr反應液還包括10×pcrbuffer、mgcl2、dntps、熱啟動taqdna酶、dna模板、無菌雙蒸水以及螢光染料。作為進一步的方案，本發明所述的螢光染料為2×sybrgreeni。作為進一步的方案，本發明所述的pcr反應液為10×pcrbuffer2μl、25mmol/lmgcl21.5μl、2.5mmol/ldntps1.5μl、10μmprimerf0.25μl、10μmprimerr0.25μl、5u/μl熱啟動taqdna酶0.2μl、dna模板1μl、2×sybrgreeni5μl、無菌雙蒸水補足至20μl。作為進一步的方案，本發明所述的陽性對照為正常人樣本的基因組完全甲基化後所得到的完全dna甲基化樣本；所述陰性對照為無菌雙蒸水。本發明所述的腺苷高半胱氨酸酶基因啟動子區甲基化程度的測定方法，其包括dna提取步驟：提取全血基因組dna並檢測dna的濃度；利用甲基化試劑盒對全血基因組dna進行亞硫酸氫鹽轉化步驟：用ezdnamethylation-gold試劑盒將上述提取額全血基因組dna與亞硫酸氫鹽反應會使單鏈中未甲基化的胞嘧啶轉變為胸腺嘧啶，然後經過上樣、洗滌、洗脫等步驟得到轉化後的dna；dna甲基化水平測定步驟：上述轉化後的dna作為樣本dna加入含螢光定量pcr反應液進行pcr擴增反應，使基因序列進行倍數擴增，每一個樣本dna對應一個的擴增曲線；曲線與既設閾值相交的橫坐標點即為ct值，並通過下述計算式計算出甲基化率：δδct＝dna樣本(ct靶基因-ctactb)-陽性對照(ct靶基因-ctactb)；其中，δδct是指甲基化率，ct靶基因是指目標基因的pcr循環數即腺苷高半胱氨酸酶基因的ct值，ctactb是指一種常用的內參基因即actb的pcr循環數。作為進一步的方案，上述方法中所述的pcr反應液為10×pcrbuffer2μl、25mmol/lmgcl21.5μl、2.5mmol/ldntps1.5μl、10μmprimerf0.25μl、10μmprimerr0.25μl、5u/μl熱啟動taqdna酶0.2μl、dna模板1μl、2×sybrgreeni5μl、無菌雙蒸水補足至20μl。作為進一步的方案，上述方法中所述的甲基化水平測定步驟具體如下：首先將轉化後的dna樣本加入到熱啟動taqdna酶中，然後加入一對腺苷高半胱氨酸酶基因啟動子區甲基化特異性擴增引物primerf和primerr；最後依次加入dna模板、10×pcrbuffer、mggl2、dntps、2×sybrgreeni以及無菌雙蒸水。作為進一步的方案，上述方法中所述的pcr擴增反應條件如下：預變性95℃，10min；95℃，20s，退火溫度，20s，72℃，single，30s，45個循環；溶解曲線95℃，15s，60℃，60s，95℃，continuous；保溫40℃，10min。由於腺苷高半胱氨酸酶(adenosylhomocysteinase，ahcy)是一種蛋白編碼基因，它能夠催化s-腺苷同型半胱氨酸可逆水解為腺苷和l-高半胱氨酸。腺苷高半胱氨酸酶基因啟動子區域的高甲基化水平會導致該基因的低表達甚至表達沉默，導致血氨大幅度升高，可能成為腦卒中的風險因素。因此，通過檢測腺苷高半胱氨酸酶基因啟動子區甲基化水平作為非診斷性檢測腦卒中的一種方法，為輔助診斷腦卒中提供依據。以下是本發明具體的實施例，在下述實施例中，除在本發明有特殊限定外，所採用的試劑、原料和設備均可以通過購買獲得。實施例1一種腺苷高半胱氨酸酶基因啟動子區甲基化程度檢測試劑盒，該檢測試劑盒包括dan提取液、螢光定量pcr反應液、陽性對照、陰性對照和多個帶蓋密封管，所述螢光定量pcr反應液包括所述的pcr反應液為10×pcrbuffer2μl、25mmol/lmgcl21.5μl、2.5mmol/ldntps1.5μl、10μmprimerf0.25μl、10μmprimerr0.25μl、5u/μl熱啟動taqdna酶0.2μl、dna模板1μl、2×sybrgreeni5μl、無菌雙蒸水補足至20μl；其中primerf和primerr核苷酸序列如下：primerf：5』-ggtcgtaatcggttgtag-3』(seqidno.1)和primerr：5』-caattcctattcccaaactaaa-3』(seqidno.2)：所述的陽性對照為正常人樣本的基因組完全甲基化後所得到的完全dna甲基化樣本；所述陰性對照為無菌雙蒸水。實施例2一種腺苷高半胱氨酸酶基因啟動子區甲基化程度的測定方法，其包括dna提取步驟：利用lab-aid820全自動核酸提取儀提取全血基因組dna並利用nanodrop2000超微量分光光度計檢測dna的濃度；用甲基化試劑盒對全血基因組dna進行亞硫酸氫鹽轉化步驟：用ezdnamethylation-gold試劑盒將上述提取額全血基因組dna與亞硫酸氫鹽反應會使單鏈中未甲基化的胞嘧啶轉變為胸腺嘧啶，然後經過上樣、洗滌、洗脫等步驟得到轉化後的dna；dna甲基化水平測定步驟：上述轉化後的dna作為樣本dna加入含螢光定量pcr反應液進行pcr擴增反應，使基因序列進行倍數擴增，每一個樣本dna對應一個的擴增曲線，曲線與既設閾值相交的橫坐標點即為ct值，並通過下述計算式計算出甲基化率：δδct＝dna樣本(ct靶基因-ctactb)-陽性對照(ct靶基因-ctactb)；其中，δδct是指甲基化率，ct靶基因是指目標基因的pcr循環數即腺苷高半胱氨酸酶基因的ct值，ctactb是指一種常用的內參基因即actb的pcr循環數。所述的pcr反應液為10×pcrbuffer2μl、25mmol/lmgcl21.5μl、2.5mmol/ldntps1.5μl、10μmprimerf0.25μl、10μmprimerr0.25μl、5u/μl熱啟動taqdna酶0.2μl、dna模板1μl、2×sybrgreeni5μl、無菌雙蒸水補足至20μl；所述的pcr擴增反應條件如表1：表1由圖1可知被檢測序列所在區域具體位置為chr20：32891017-32891140，據此進行後續甲基化分析；由圖2的dna序列分析結果表明，模板dna的亞硫酸氫鹽轉化成功；圖3顯示毛細管電泳證實擴增片段長度為124bp。應用實施例1選擇樣本：對深圳地區腦卒中病人172例作為病例組(62.00(61.00，67.00)歲)和年齡匹配且無腦卒中家族史的289名正常者作為對照組(65.00(59.00，69.00)歲)；所有研究對象在知情同意的前提下，抽血檢測尿酸水平、甘油三酯等一般生化指標，同時抽取靜脈血3ml作為樣本入edta抗凝管中，-80℃低溫儲存，備用；dna提取步驟：利用lab-aid820全自動核酸提取儀(中國廈門，致善生物科技)提取全血基因組dna並利用nanodrop2000超微量分光光度計(美國，thermofisherscientific)檢測dna的濃度；用甲基化試劑盒對全血基因組dna進行亞硫酸氫鹽轉化步驟：用ezdnamethylation-gold試劑盒將上述提取額全血基因組dna與亞硫酸氫鹽反應會使單鏈中未甲基化的胞嘧啶轉變為胸腺嘧啶，然後經過上樣、洗滌、洗脫等步驟得到轉化後的dna；dna甲基化水平測定步驟：上述轉化後的dna作為樣本dna加入含螢光定量pcr反應液進行pcr擴增反應，使基因序列進行倍數擴增，每一個樣本dna對應一個的擴增曲線，曲線與既設閾值相交的橫坐標點即為ct值，並通過下述計算式計算出甲基化率：δδct＝dna樣本(ct靶基因-ctactb)-陽性對照(ct靶基因-ctactb)；其中，δδct是指甲基化率，ct靶基因是指目標基因的pcr循環數即腺苷高半胱氨酸酶基因的ct值，ctactb是指一種常用的內參基因即actb的pcr循環數。所述的pcr反應液為10×pcrbuffer2μl、25mmol/lmgcl21.5μl、2.5mmol/ldntps1.5μl、10μmprimerf0.25μl、10μmprimerr0.25μl、5u/μl熱啟動taqdna酶0.2μl、dna模板1μl、2×sybrgreeni5μl、無菌雙蒸水補足至20μl；所述的pcr擴增反應條件與實施例2的表1中相同；甲基化率的計算結果參見表2-4：表2：深圳地區病例組與對照組間的比較(n＝784)註：n表示樣本個數，p值是兩個數組之間進行對照的結果，若其小於0.05，則表示這兩個數組間具有較大的統計學差異，表述為陽性結果，用字符加粗來強調。pa是腦卒中患者與高血壓患者進行對比的結果；pb是腦卒中患者與正常人進行對比的結果；pc是高血壓患者與正常人進行對比的結果。不符合正態分布的數據，用中位數(四分位數)來表示，其計算所得p值後加#；符合正態分布的數據，用平均數±方差來表示，其計算所得p值後加*，具有其合理性。以下下表格同。表3：深圳地區男性高血壓患者與對照組間的比較(n＝330)分組高血壓患者正常人p值甲基化率0.08(0，0.80)0.05(0，0.18)0.003#年齡71.10±5.7365.30±9.482.93e-07*ua(μmol/l)395.79±98.26385.99±87.680.040*tg(mmol/l)1.39(0.97，1.79)1.49(1.06，2.06)0.077#tc(mmol/l)4.92±1.104.95±1.040.460*ldl(mmol/l)2.92±0.763.10±0.760.940*表4：深圳地區女性高血壓患者與對照組間的比較(n＝282)應用實施例2選擇樣本：收集寧波地區腦卒中病人56例作為病例組(63.00(56.00，71.75)歲)和年齡匹配且無腦卒中家族史的137名正常者作為對照組(63.00(56.50，72.50)歲)對所有研究對象在知情同意的前提下，抽血檢測尿酸水平、甘油三酯等一般生化指標，同時抽取靜脈血3ml作為樣本入edta抗凝管中，-80℃低溫儲存，備用；按照上述應用實施例1的步驟進行檢測、計算甲基化率並將結果與應用實施例中深圳組的結果進行對比，結果參見表5-7：表5寧波地區病例組與對照組間的比較(n＝193)分組腦卒中患者正常人p值甲基化率0.38±1.601.03±10.700.290*性別(男/女)35/2181/560.664年齡63.00(56.00，71.75)63.00(56.50，72.50)0.867#ua(μmol/l)288.50(239.75，348.50)278.00(202.00，363.00)0.470#tg(mmol/l)1.56±1.181.33±1.100.326*tc(mmol/l)4.09(3.43，4.99)4.49(3.71，5.38)0.125#ldl(mmol/l)2.34(1.82，3.00)2.77(2.19，3.41)0.025#表6深圳與寧波地區病例組間的比較(n＝228)表7深圳與寧波地區對照組間的比較(n＝426)分組深圳正常人寧波正常人p值甲基化率0.04(0，0.17)0.06(0，0.17)0.689#性別(男/女)175/11481/560.778年齡65.00(59.00，69.00)63.00(56.50，72.50)0.774#ua(μmol/l)354.00(302.00，411.00)278.00(202.00，363.00)3.36e-12#tg(mmol/l)1.52(1.09，2.09)1.10(0.79，1.57)5.88e-09#tc(mmol/l)5.04(4.41，5.64)4.49(3.71，5.38)8.95e-06#ldl(mmol/l)3.09(2.64，3.63)2.77(2.19，3.41)9.57e-05#由表2和表5可見：基因啟動子區域高甲基化是導致腦卒中患者發病的一個較大危險因素(pc＝0.013)，而高血壓等潛在的因素也會大大提高腦卒中患者的患病風險，他們的甲基化水平差異有著較好的統計學意義(pa＝7.04e-05)。就深圳地區的年齡因素考慮，腦卒中患者、高血壓患者與正常人之間存在著較為顯著的統計學差異(pa＝0.013，pb＝0.006，pc＝1.59e-10)。由於深圳地區的高血壓患者和正常人之間就性別因素考量有著較大的差異，因此本研究把深圳地區的男/女性高血壓患者與其對應的正常人進行比較研究，得出深圳地區男性高血壓患者與正常人之間存在較好的統計學意義，而女性對比差異不明顯，見表3、表4)。據表6可知寧波地區和深圳地區的腦卒中患者的甲基化率存在顯著差異，由表6和7顯示寧波地區和深圳地區的正常人的諸多生化指標(如ua、tg、tc、ldl等)皆有著明顯的不同(p＜0.05)，可見地域因素也是腦卒中患者發病的一個不容忽視的原因。上述實施方式僅為本發明的優選實施方式，不能以此來限定本發明保護的範圍，本領域的技術人員在本發明的基礎上所做的任何非實質性的變化及替換均屬於本發明所要求保護的範圍。sequencelisting深圳市南山區慢性病防治院一種腺苷高半胱氨酸酶基因啟動子區甲基化程度檢測試劑盒及測定方法深圳市南山區慢性病防治院2patentinversion3.3120dna1ggtcgtaatcggttgtag20222dna2caattcctattcccaaactaaa22當前第1頁12