幹擾素調節因子9(irf9)及其抑制劑在冠狀動脈粥樣硬化性心臟病中的應用的製作方法
2023-06-22 17:35:11
幹擾素調節因子9(irf9)及其抑制劑在冠狀動脈粥樣硬化性心臟病中的應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開一種幹擾素調節因子9（IRF9）在冠狀動脈粥樣硬化性心臟病中的應用，屬於基因的功能與應用領域。本發明以IRF9基因敲除小鼠為實驗對象，通過結紮小鼠心臟左冠狀動脈前降支（LAD）造成心肌缺血再灌注損傷模型，結果表明與WT小鼠對比，IRF9基因敲除小鼠心肌梗死面積明顯減少，心功能明顯改善。從而發現IRF9基因在冠狀動脈粥樣硬化性心臟病中的功能，主要體現在IRF9基因能夠惡化冠狀動脈粥樣硬化性心臟病的作用。針對IRF9的上述功能，提供IRF9作為藥物靶標在研製冠狀動脈粥樣硬化性心臟病藥物中應用，及IRF9的抑制劑在製備治療冠狀動脈粥樣硬化性心臟病藥物中應用。
【專利說明】幹擾素調節因子9(IRF9)及其抑制劑在冠狀動脈粥樣硬化性心臟病中的應用
[0001]
【技術領域】
[0002]本發明屬於基因的功能與應用領域，特別涉及一種IRF9(interferon regulatoryfactor 9)及其抑制劑在冠狀動脈粥樣硬化性心臟病中的應用。
[0003]
【背景技術】
[0004]心肌梗死(myocardial infarction, Ml)是冠狀動脈急性、持續性缺血缺氧所引起的心肌壞死，是缺血性心臟病的常見類型，在急性心肌梗死發作後的幾分鐘內，缺血中央區的心肌細胞便會由於缺血而死亡，是嚴重威脅人類健康和生命的常見病之一。如何幹預心肌缺血引發的心肌梗死及保護心臟愈來愈受到重視。而最有效挽救心肌梗塞的方法是儘快恢復缺血心肌的血流，即再灌注。目前，常採用溶栓療法、經皮腔內冠脈血管成型術、動脈搭橋術、心臟外科體外循環等幹預手段。然而，有效的再灌注只能挽救大約I / 3人的生命。
[0005]無論在發達國家還是發展中國家，急性心肌梗死均是導致成年人病殘和死亡的主要原因之一。雖然恢復心肌缺血區支配血管的血流灌注是改善患者生存率的主要治療，但是血流灌注的恢復亦可導致「再灌注損傷」。心肌缺血/再灌注損傷(myocardialischemia / reperfusion i njury, MIRI)是指心肌在短時間內血供中斷,恢復血供後一定時間內，原缺血心肌發生較血供恢復前更為嚴重的損傷。一般認為缺血的組織、器官在可逆損傷以前得到再灌注便可存活並恢復，但發現在有些情況下，經過一定時間缺血的組織器官並未發生明顯的功能結構改變，在得到血液再灌注時卻發生了不可逆性的損傷。有研究表明已經發生嚴重的缺血性損傷的細胞，再灌注並不使其損傷減輕，反而會加速細胞的死亡。在缺血引起的心肌細胞損傷中，心肌細胞代謝率明顯降低，組織出現緩慢但較為明顯的損傷。如果在缺氧基礎上再復氧，這種損傷就會加快、加重。儘管再灌注重新提供給組織細胞氧及營養物質，但這種再復氧反而加速機體損傷是因為再復氧的同時也促進氧自由基釋放。再灌注在機體多種病理、生理改變中發揮重要作用，缺血後再灌注將導致更嚴重的後果。研究發現，有多種因素在缺血再灌注損傷機制中發揮重要作用，包括炎症過程、氧自由基損傷、鈣超載、氧化應激等。
[0006]心肌缺血/再灌注損傷己引起廣大基礎和臨床工作者的高度重視，如何防治心肌缺血再灌注損傷的藥物已成為研究的熱點。然而，目前臨床所應用的各種藥物均有一定的局限性，還不能滿足需要。尋找新的、安全有效的藥物用於防治心肌缺血再灌注損傷成為醫學研究的重要課題之一。
[0007]幹擾素調節因子(interferon regulatory factor, IRF)家族現已發現有10個成員，其組成為IRFl~IRF10。現有的研究提示，IRF家族成員參與了廣泛的生物學過程，主要涉及天然免疫和獲得性免疫反應，調控細胞生長及生存、凋亡和增殖，參與造血，抗腫瘤形成等。IRF9又稱為P48,幹擾素刺激基因因子(IFN-stimulated gene factor 3 y ,ISGF3 y)0目前有IRF-9的研究主要集中在抗病毒，IRF-9和HBV幹擾素刺激應答元件樣結構域結合後，其表達迅速上調可以增強IFN-α誘導的HBV mRNA水平的顯著抑制。最近有報導，小鼠在IRF9基因敲除(Knockout，KO)後，表現為增加小腸粘液和淋巴結裡的T細胞及中性粒細胞數目，這提示IRF9與炎症有著密切聯繫。(Lohoff M等，Nature reviewsImmunology.2005;5 (2):125-35; Honda K等，Nature reviews Immunology.2006; 6(9):644-58.)
【發明內容】
[0008]為解決上述現有技術的缺陷和不足，本發明的首要目的在於提供IRF9作為藥物靶標在篩選治療冠狀動脈粥樣硬化性心臟病藥物中應用。
[0009]本發明的另一目的在於提供一種IRF9的抑制劑在製備治療冠狀動脈粥樣硬化性心臟病藥物中的應用
本發明的目的通過下述技術方案實現: 本發明以IRF9基因敲除小鼠為實驗對象，通過結紮小鼠心臟左冠狀動脈前降支(LAD)造成心肌缺血再灌注損傷模型，結果表明與WT小鼠對比，IRF9基因敲除小鼠心臟梗死面積明顯減少，心功能明顯好轉。這提示IRF9基因具有惡化心臟功能的作用，能促進心肌梗死的發展，IRF9基因發揮著促進冠狀動脈粥樣硬化性心臟病發生的作用。為研究防治冠狀動脈粥樣硬化性心臟病的新靶點和新策略提供了理論依據和臨床基礎。
[0010]針對IRF9的上述功能，提供IRF9作為藥物靶標在篩選治療冠狀動脈粥樣硬化性心臟病藥物中的應用。
[0011]針對IRF9基因的上述功能，提供IRF9的抑制劑在製備治療冠狀動脈粥樣硬化性心臟病藥物中的應用。
[0012]一種治療冠狀動脈粥樣硬化性心臟病的藥物，包含IRF9。
[0013]所述的IRF9的抑制劑優選為IRF9基因的siRNA、IRF9基因的RNA幹擾載體或IRF9的抗體中的一種。
[0014]本發明的研究成果表明，IRF9 KO小鼠在結紮冠狀動脈引起的心肌缺血再灌注損傷中，小鼠的心臟梗死面積明顯變小，心臟功能明顯好轉。證明IRF9基因在冠狀動脈粥樣硬化性心臟病模型中有著重要的惡化作用。
[0015]本發明相對於現有技術具有如下的優點及效果:
1.本發明發現IRF9基因的新功能，即IRF9基因能夠惡化冠狀動脈粥樣硬化性心臟病的作用。
[0016]2.本發明針對IRF9在惡化冠狀動脈粥樣硬化性心臟病中的作用，為研製冠狀動脈粥樣硬化性心臟病的藥物提供靶標。
[0017]3.本發明針對IRF9在惡化冠狀動脈粥樣硬化性心臟病中的作用，提供IRF9的抑制劑在冠狀動脈粥樣硬化性心臟病中的應用。
[0018]
【專利附圖】
【附圖說明】[0019]圖1是小鼠在MI手術後的梗死染色圖。
[0020]A為WT和IRF9-K0小鼠I/R手術後24h的TTC染色圖；
B為AAR面積統計柱狀圖；C為梗死面積統計柱狀圖；
圖2是WT和IRF9-K0小鼠I/R模型後的超聲檢測心功能結果圖。
[0021]A為收縮期末壓(mmHg)；
B為射血分數(%)；
C為左室內壓最大上升速率(mmHg/sec)；
D為左室內壓最小上升速率(mmHg/sec)；
圖3是WT和IRF9-K0小鼠I/R模型後的TUNEL染色及結果統計柱狀圖。
[0022]
【具體實施方式】
[0023]下面結合實施例及附圖對本發明作進一步詳細的描述，但本發明的實施方式不限於此。
[0024]實驗用動物及飼養:
實驗動物:8-10周齡、體重在23.5-27.5g，背景為雄性C57BL/6品系的野生型小鼠(WT，購自北京華阜康生物科技有限公司)、IRF9基因敲除小鼠(IRF9-K0，C57BL/6J背景，購買自 RIKEN BRC 公司(BRC 編號:RBRC00916))。
[0025]飼養環境:所有實驗小鼠均飼養在武漢大學心血管病研究所SPF級實驗動物中心。小鼠專用飼料由中國軍事醫學科學院動物中心提供。飼養條件:室溫在22-24°C之間，溼度在40-70%之間，明暗交替照明時間為12h，自由飲水攝食。
[0026]【實施例1】心肌缺血/再灌注損傷(MIRI)模型獲得
1.實驗動物分組:雄性C57BL/6品系小鼠(WT)、IRF9基因敲除小鼠(KO)通過結紮小鼠心臟左冠狀動脈前降支(LAD)造成心肌缺血/再灌注損傷模型。隨機分為4組，每組:C57BL/6品系小鼠假手術組(WT SHAM)及I/R術組(WT MI )、IRF9基因敲除小鼠假手術組(K0 SHAM)及 I/R 術組(K0 MI )。
[0027]2.1/R模型採用結紮小鼠心臟左冠狀動脈前降支(LAD)造成心肌缺血/再灌注損傷，模型操作流程:
2.1稱重麻醉備皮:用電子天平於動態模式下準確稱取小鼠體重(g)，用雙蒸水準確配置3%戊巴比妥鈉溶液，輕輕搖動使其充分溶解，採用80mg/kg體重劑量，計算所需戊巴比妥鈉溶液體積後用ImL注射器準確抽取相應體積溶液，行腹腔注射麻醉小鼠，待小鼠充分麻醉倒(約3min)後，用小鼠剃毛器剃除小鼠胸部及腋下毛髮(充分暴露手術區)。
[0028]2.2氣管插管:麻醉一定時間(約20_30min)後，夾趾檢測無反應即可開始手術。打開外置光源、顯微鏡開關，打開呼吸機，設置好各參數(呼吸頻率lOObpm、恆壓16-17mmHg)，將小鼠門齒用橡皮經固定在自製斜面上，外置光源照向小鼠頸部，眼科鑷拉出小鼠舌頭調節光源亮度及位置，此時可見小鼠聲門隨呼吸呈開閉運動，聲門開啟時將氣管插管沿聲門送入氣管，取下小鼠接上呼吸機，觀察小鼠呼吸狀況，胸廓起伏與呼吸機頻率一致表示插管成功， 即可進行下步手術，整個手術過程用加熱墊維持小鼠體溫在37°C左右。
[0029]2.3開胸:小鼠採用右側臥位，用醫用膠帶固定好小鼠四肢(左前肢位於右前肢前以充分暴露手術區)，用醫用碘酊及75%醫用酒精對手術區皮膚進行消毒清潔處理，用眼科剪在左前肢下0.5cm處沿肋骨走向剪開皮膚，逐層分離筋膜、肌肉等組織(儘量避開較大血管，若不能避免則先行阻斷再剪斷血管)，用顯微剪於三、四肋間打開胸腔充分暴露心臟，用顯微直鑷輕輕夾起少量心包並於左心耳下撕開少許心包，充分暴露左冠狀動脈前降支(LAD)或所在區域。
[0030]2.4結紮冠狀動脈:於顯微鏡下找到LAD走向或可能所在位置(小鼠LAD走行於左心耳與肺動脈圓錐間，多發出於左心耳下緣處)，用無齒持針器持取7-0帶針縫合線，於左心耳下緣Imm處進針,肺動脈圓錐旁出針,進針深度0.5mm,寬度為1mm,縫線從LAD下方穿過，穩定5s後,在心臟表面結紮處放置一長度2mm,大小為10號的聚乙烯塑料棒(要求表面光滑，大小為取出棒後結紮線不會壓迫血管)，後在其上打一活結，輕拉以結紮LAD (力度以能完全阻斷LAD血流為準，寧輕勿重)，剪去線頭，結紮成功，則可見左室前壁明顯由鮮紅色變為蒼白而不再恢復。(Sham組不結紮LAD，直接關胸)。
[0031]2.5缺血再灌:自結紮LAD成功，心肌缺血60分鐘時，打開胸腔，鬆開結紮線，用顯微鑷迅速準確的抽去聚乙烯塑料棒,使結紮的LAD再通，缺血心肌恢復血流，完成心肌缺血再灌注，再灌注成功，可見因缺血而變蒼白的心肌重新恢復至鮮紅色，維持再灌注24h。
[0032]2.6關胸:缺血再灌完成後，6-0縫線完全縫合胸腔開口(保證無縫隙、無錯位)關閉胸腔，5mL注射器接套管經切口插入胸腔，抽取ImL氣體，6-0縫線由內向外逐層縫合各層肌肉，後用5-0縫線將皮膚切口縫合完整。
[0033]2.7術後管理:術後密切關注小鼠狀態，有無呼吸異常等。待小鼠自然甦醒後將小鼠從呼吸機上取下並取下氣管插管，放入乾淨的飼養籠，填寫手術記錄卡片，放回IVC籠架飼養，密切關注小鼠術後狀態以及死亡情況並做好相應記錄。
[0034]【實施例2】2，3，δ-三苯基氯化四氮唑(2，3，5-Triphenyltetrazolium chloride,TTC)-伊文思藍(Evans blue)雙染色測心肌梗死面積
缺血再灌注24h後，80mg/kg戊巴比妥鈉溶液腹腔注射麻醉小鼠，剪開胸腔，分離出主動脈，連同主動脈一起切取心臟，心臟保存在4°C生理鹽水中，將23號針頭置入升主動脈根部，不穿過主動脈瓣，結紮固定。準備37°C 3-4 mL的TTC磷酸緩衝液(PH=7.4)從主動脈緩慢灌注心臟，當心肌變為磚紅色時停止注射。重新結紮LAD，然後通過主動脈均勻緩慢灌注約2mL 2.5%的伊文思藍，並使心肌缺血區域面朝上，防止流出的伊文思藍汙染心臟表面。待心臟變藍後停止灌注並用生理鹽水充分衝洗，清潔心臟表面並擠壓心臟以排除殘留於心腔中伊文思藍。充分吸乾心臟表面和心腔中的生理鹽水，保存於_20°C冰箱中。待心臟冷凍固定後，將心臟直於切片器中，從心尖開始連續切厚度為1_的切片，一共5片。
[0035]梗死面積測量:採用高解析度解剖顯微鏡對每片心肌組織兩面進行拍照。採用圖像分析軟體(IPP軟體)對切片分析，TTC染色後梗死區為白色，未梗死區為磚紅色，伊凡思藍染色後整片切片面積減去藍色區域為缺血危險區(AAR)。以缺血危險區(AAR) /左心室區域(LV)百分比表示AAR面積，梗死區/ AAR百分比表示梗死面積。
[0036]TTC是脂溶性光敏感複合物，它是呼吸鏈 中吡啶一核苷結構酶系統的質子受體，與正常組織中的脫氫酶反應而呈紅色，而缺血組織內脫氫酶活性下降，不能反應，故不會產生變化呈蒼白色。在體染色梗死區、缺血區和非缺血區的邊界較離體染色清晰，以心肌橫截面能清晰區分白色為梗死區，紅色為缺血區，藍色為非缺血區。[0037]小鼠TTC染色及梗死面積統計結果見圖1。經過I/R缺血60min再灌注24小時後，IRF9-K0小鼠梗死面積較野生型小鼠降低。
[0038]【實施例3】心肌缺血再灌注模型小鼠心功能檢測 I PV檢測血流動力學
1.1前期準備
(I)麻醉機準備:先連接氧氣瓶和麻醉機上的進氣接口，再擰開麻醉機上加藥口密封蓋，迅速加入異氟烷至安全刻度後擰緊密封蓋。擰開氧氣瓶上總閥門，調整流量控制閥的旋鈕，出氣壓力維持在0.2-0.3mPa。
[0039](2)待測小鼠準備:待檢測小鼠用異氟烷迅速麻醉後，左胸前區剃毛，將處理好的小鼠頭部伸入麻醉劑導管套頭內，以1.5-2.0%異氟烷維持小鼠穩定的麻醉狀態。
[0040]1.2 PV 檢測
碘酒及75%酒精消毒後，剪開小鼠頸部皮膚，依次分離肌肉和軟組織，並游離出右頸總動脈，於血管下穿過雙線並結紮遠心端，同時活結結紮近心端。用血管剪在遠心端剪一切口(1/3-1/2管徑)，於體視顯微鏡下將Millarl.4F超微導管迅速插入右頸總動脈，同時穿一縫線將導管和血管結紮。打開近心端活結，將導管沿右頸總動脈-升主動脈插入左心室內，連接Powerlab生物信號採集處理系統。觀察記錄儀上波形情況，調節導管的位置使波形圖清晰且穩定。監測小鼠心功能指標。測量小鼠收縮期末壓(End-systolic Pressure)、射血分數(Ejection Fraction)、左室內壓最大上升速率(dP/dt max)及左室內壓最小上升速率(dP/dt mi η)等指 標。
[0041]由Laplace定理可知:S=Pr/2h,P為心室內壓，r為心腔內徑，h為心壁厚度。在心臟壓力負荷過重的情況下，為適應心臟做功增加，室壁厚度增加，左室室壁應力增加，提高心臟收縮功能起到早期代償的機制；但持續的壓力超負荷，可促進心肌肥厚，導致心肌細胞的壞死及凋亡，心臟的收縮和/或舒張功能受到損害，最終發展為慢性心力衰竭甚或心源性猝死。本研究運用心臟血流動力學檢測評價心功能。
[0042]圖2是WT和IRF9-K0小鼠I/R模型後的血流動力學檢測結果。與WT SHAM組相t匕，WT小鼠I/R術後24h表現出心功能減弱。通過血流動力學指標的檢測，我們觀察到術後 24h WT 小鼠收縮期末壓(End-systolic Pressure)、射血分數(Ejection Fraction)、左室內壓最大上升速率(dP/dt max)及左室內壓最小上升速率(dP/dt min)均比其SHAM組降低，KO小鼠術後Ejection Fraction, dp/dt max和dp/dt min則比WT組要高,且差異有統計學意義。
[0043]【實施例4】小鼠心肌細胞凋亡情況測定檢測
1.取材
(I)前期工作:預先準備裝有20mL的10%甲醛的尿杯，並貼好標籤(小鼠編號、組別、手術類型及取材日期)。將倒滿10%KC1溶液的培養皿置於取材處。打開分析天平，調零備用，再稱重處死小鼠。
[0044](2)取材:眼科彎鑷夾住心耳下方的血管蒂，剪下心臟，迅速置於10%KC1溶液中。待心臟停跳在舒張期後，置於滅菌紗布上，輕輕擠壓心腔內液體，蘸幹表面液體後，稱重並記錄，將心臟放入相應的尿杯中，固定48h後用於病理學檢測。
[0045]2.病理學檢測2.1製備石臘標本切片
製備石蠟標本切片，主要操作程序包括修剪心臟一包埋框處理一流水衝洗一脫水一透明一浸蠟一包埋一切片一攤片一晾乾或烘烤後備用。
[0046]2.2 TUNEL 染色
用 TUNEL 試劑盒染色檢測凋亡。(TUNEL 試劑盒:ApopTag? Plus In Situ ApoptosisFluorescein Detection Kit (S7111, Chemicon)):
1)將石蠟切片置於烤箱中，60°C烤片30分鐘；
2)二甲苯，5分鐘X3次；
3)100%乙醇，5分鐘X 2次；95%乙醇，5分鐘；70%乙醇，5分鐘；
4)ddH20漂洗，5分鐘X2次；
5)蛋白酶K37°C孵育15分鐘；
6)PBS 漂洗 5minX2 次；
7)直接滴加EquilibrationBuffer於組織上(13 μ L/cm2),室溫孵育至少IOs ；
8)棄去Equilibration Buffer,滴加 TdT Enzyme 工作液(77ulReaction Buffer+33ulTdT Enzyme)於 組織上(11 μ 1/cm2),於溼盒於 37°C孵育 Ih ；
9)將切片置於盛有Stop/Wash Buffer 工作液(lml Stop/Wash Buffer+34ml ddH20)的染色缸中振蕩15s後室溫孵育IOmin (等待過程中，將適當量的Ant1-DigoxigeninConjugate吸出，至於EP管中，避光放置在室溫下，使其平衡至室溫)；
10)PBS 漂洗 IminX3 次；
11)輕輕甩去組織多餘殘留的液體，將組織周圍液體吸3滴加Ant1-DigoxigeninFluorescein 工作液(53%Blocking Solution+47%Anti_Digoxigenin Conjugate))於組織上(13 μ L/cm2),於溼盒中室溫避光孵育30min ；
12)PBS漂洗2minX4次(每次換新的PBS)；
13)SlowFadeGold antifade reagent with DAPI (Invitrogen ,S36939)封片；突光鏡下觀察，拍照。若需保存，於暗溼盒中4°C保存。
[0047]心肌組織由心肌細胞和間質組織組成，心臟是一終末分化器官，心肌細胞失去增殖能力，各種生理或病理性刺激引起的心肌細胞反應，只能是單個細胞的體積增大而不能
在數量上增殖。
[0048]心肌組織細胞凋亡情況測定結果見圖3所示，我們檢測了 IRF9-K0小鼠和野生型小鼠術後24小時心肌細胞凋亡情況。TUNEL細胞凋亡檢測顯示，IRF9-K0小鼠肝細胞凋亡明顯比野生型小鼠降低，這提示IRF9與心肌細胞缺血/再灌注時死亡相關。這些結果表明，抑制IRF9表達可以改善心肌組織缺血/再灌注損傷，且可能與心肌細胞凋亡密切相關。
[0049]我們的研究成果表明，IRF9基因敲除小鼠在結紮心臟左冠狀動脈前降支(LAD)造成心肌缺血/再灌注損傷中，我們發現IRF9基因敲除後，小鼠心臟梗死面積明顯減少，心功能明顯好轉。證明IRF9基因在冠狀動脈粥樣硬化性心臟病模型中有著重要的惡化作用。
[0050]上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式並不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發明的保護範圍之內。
【權利要求】
1.一種IRF9作為藥物靶標在篩選治療腦卒中疾病藥物中的應用。
2.—種IRF9的抑制劑在製備治療腦卒中疾病藥物中的應用。
3.一種治療腦卒中疾病的藥物，其特徵在於:包含IRF9。
4.根據權利要求2所述的應用或權利要求3所述的藥物，其特徵在於:所述的IRF9的抑制劑為IRF9基因的siRNA、IRF9基因的RNA幹 擾載體或IRF9的抗體中的一種。
【文檔編號】C12Q1/68GK103784972SQ201410031556
【公開日】2014年5月14日 申請日期:2014年1月23日 優先權日:2014年1月23日
【發明者】李紅良, 張曉東, 蔣丁勝, 張豔, 萬埝, 劉小熊 申請人:武漢大學