人工誘導石斑魚雌核發育魚苗的方法

2023-06-22 09:45:16 1

人工誘導石斑魚雌核發育魚苗的方法
【專利摘要】本發明公開了一種人工誘導石斑魚雌核發育魚苗的方法，以遺傳滅活的異源精子為刺激源，刺激斜帶石斑魚成熟卵子，激活後使用冷水休克實現二倍化，製備過程中使用倍性分析技術對獲得的胚胎或幼苗進行檢測，實現質量控制。通過本發明的方法，能夠製備得到減數分裂抑制型的雌核發育石斑魚。
【專利說明】人工誘導石斑魚雌核發育魚苗的方法
【技術領域】
[0001]本發明屬於魚類遺傳育種領域，是一種海水魚類的培養方法及其應用，具體涉及使用異源精子誘導石斑魚產生雌核發育的培育和質量控制方法及應用。
【背景技術】
[0002]人工誘導魚類雌核發育技術是20世紀50年代在天然雌核發育魚類發現的基礎上發展起來的技術，該技術利用遺傳滅活的精子刺激卵子，並依賴雌配子發育成個體。由於雌核發育導致基因純合，在快速製備魚類純系等方面具有良好的應用價值。
[0003]淡水魚類的雌核發育開展的應用工作較多，而海水魚類國內外學者僅對大菱鮃、真鯛、大黃魚等十餘種魚類開展了雌核發育的應用，熱帶海水魚類在這方面的研究與應用很少。石斑魚(Epinephalus),屬於世界性名貴暖水性礁棲魚類,在我國南方形成了大規模的養殖產業。石斑魚養殖產業面臨著育苗成活率低、病害嚴重、個體大小參差不齊等亟待解決的問題，石斑魚優良品種的缺乏已經成為制約產業穩定持續發展的瓶頸因素。
[0004]選育出優良純系或品系是石斑魚良種培育的必由之路。作為一種先雌後雄的性反轉大型魚類，石斑魚性成熟時間長，個體發育為成熟雌性的時間長達3-5年，家系育種等手段耗時非常長，而I代雌核發育產生相當於7-8代自交選育的純合效果，能夠大大縮短品系選育的周期，因此採用雌核發育技術手段將顯著提高石斑魚良種培育效率。

【發明內容】

[0005]本發明要解決的問題是確定合適精子刺激源，並對人工誘導獲得的個體進行鑑定，實現批量高效製備雌核發育石斑魚純系群體。
`[0006]為解決上述技術問題，本發明提出的方案為一種人工培育石斑魚雌核發育魚苗的方法，該方法包括如下步驟:
[0007](I)雄魚的選擇和精子的採集:
[0008]選擇體格健壯體表無傷的鞍帶石斑魚雄性成魚為親本(5-7齡)，體重60_80kg /尾，置於海上網箱或陸地池塘進行培育，投餵冰鮮雜魚和魷魚進行培育；待海水平均溫度穩定在28-32°C時，根據斜帶石斑魚排卵規律，提前1-2日給鞍帶石斑魚雄魚注射HCG(200U /kg), 20-28小時後將雄魚置於封閉網箱中，採用麻醉劑將其麻醉後撈出水面置於帆布擔架內擠精，採集的鞍帶石斑魚鮮精，使用精子稀釋液按照1:8-10比例稀釋，0-4°C冷藏保存；
[0009](2)精子遺傳物質滅活
[0010]取稀釋過的鞍帶石斑魚精液平鋪在預冷的培養皿中，精子液面厚度控制在0.1-0.15_，置於紫外燈箱中照射，照射過程中遮蔽自然光並置於搖床中進行，保持不停的搖動以確保精子照射均勻，紫外光照射劑量為40-60mJ / cm2
[0011](3)人工授精的方法
[0012]鞍帶石斑魚紫外照射處理完成後，收集精子置於冰上避光保存；將待產斜帶石斑魚雌魚撈出，擦乾體表水分，將成熟卵子擠入乾燥刻度燒杯中；按照毫升處理精子授精40-60毫升卵子的比例進行精卵人工混合，混合45-90秒後加入潔淨自然海水完成人工授
不目；
[0013](4)冷休克誘導石斑魚卵子
[0014]提前準備預冷的海水及冰箱，人工授精後4-8分鐘，用小手操網將卵子撈出，按照每50ml卵子使用2000-4000ml預冷的2_6°C海水的比例立即轉入預冷的海水中，低溫休克處理時間為15-25分鐘，經孵化桶孵化得人工培育石斑魚育苗。
[0015]在本發明的一個優選實施方式中，所述的精子稀釋液配方為TS-2:蔗糖IlOmM,KHCO3 lOOmM，胎牛血清 10%，Tris 酸 IOmM0
[0016]在本發明的另一個優選實施方式中，所述的麻醉劑是丁香酚。
[0017]本發明以遺傳滅活的鞍帶石斑魚精子為刺激源，刺激斜帶石斑魚成熟卵子，激活後6min用4-6°C冷水休克處理20min，然後經孵化桶孵化，從而製備得到減數分裂抑制型的雌核發育石斑魚。
【具體實施方式】:
[0018]一、鞍帶石斑魚精子的遺傳失活及刺激斜帶石斑魚卵子雌核發育的方法
[0019]1.1雄魚的選擇和精子的採集:
[0020]選擇體格健壯體表無傷的鞍帶石斑魚雄性成魚為親本(5-7齡)，體重60_80kg /尾，置於海上網箱或陸地池`塘進行培育，投餵冰鮮雜魚和魷魚進行培育。待海水溫度穩定在30°C時(海南省6-10月)，根據斜帶石斑魚排卵規律，提前1-2日給鞍帶石斑魚雄魚注射HCG(200U / kg) ,24小時後將雄魚置於封閉網箱中，丁香酹麻醉劑將其麻醉後撈出水面置於帆布擔架內擠精。採集的鞍帶石斑魚鮮精，使用Ts-2精子稀釋液按照1:9比例稀釋，置於50mL管中4°C冷藏保存。
[0021]精子稀釋液Ts-2的配方為:蔗糖llOmM，KHCO3 lOOmM，胎牛血清10 %，Tris酸10mM。
[0022]1.2精子遺傳物質滅活
[0023]取稀釋過的鞍帶石斑魚精液平鋪在預冷的培養皿中，精子液面厚度控制在
0.1-0.15_，置於紫外燈箱中照射，照射過程中遮蔽自然光並置於搖床中進行，保持不停的搖動以確保精子照射均勻，紫外光照射劑量為52mJ / cm2。
[0024]1.3人工授精的方法
[0025]鞍帶石斑魚紫外照射處理完成後，收集精子置於冰上避光保存。將待產斜帶石斑魚雌魚撈出，擦乾體表水分，將成熟卵子擠入乾燥刻度燒杯中。按照2ml處理精子授精100ml卵子的比例進行精卵人工混合，混合I分鐘後加入潔淨自然海水完成人工授精，同時記錄授精時間。
[0026]二、減數分裂抑制型雌核發育卵子二倍化的誘導方法
[0027]包括:冷休克誘導石斑魚卵子二倍化起始時間的確定；冷休克溫度及持續處理時間的確定。
[0028]2.1冷休克誘導石斑魚卵子二倍化起始時間
[0029]提前準備預冷(4°C ±0.5°C )的海水及冰箱，採用紫外線處理的精子與卵子授精後即刻開始計時，人工授精後6分鐘，用小手操網將卵子從大桶中撈出，立即轉入預冷的海水中。
[0030]2.2冷休克溫度及持續處理時間
[0031]卵子的數量及冷休克所用的水體，按照每50ml卵子使用3000ml預冷的4°C海水的比例，冰箱中保持水體4°C進行低溫休克，低溫休克處理時間為20分鐘。
[0032]冷休克處理完成後將盛有卵子的燒杯從控溫冰箱中取出，置於25°C控溫水浴桶中水浴10分鐘，溫度平衡後轉入大孵化桶孵化。
[0033]三、對於所誘導胚胎及魚苗進行倍性鑑定
[0034]3.1三組數據對照實現質量控制
[0035]採用正常雜交組、精子照射未休克組及雌核發育組(即本發明實施例1)，來實現製備雌育幼苗的質量控制。使用倍性分析儀檢測三組樣本的倍性，三組數據對照即可判斷該批次誘導雌核發育幼苗的好壞，實現質量控制。
[0036]3.2倍性儀檢測方法
[0037]收集三個組發育超過16小時的胚胎，膠頭滴管吸取單個胚胎，置於玻片上分散細胞，DAPI染液染色，Partac倍性分析儀檢測，以正常雜交組為二倍體對照，各實驗組隨機檢測樣品20個，統計單倍體率及二倍體率(見表1)。
[0038]表1各組受精率、孵化率與倍性數據
[0039]`
【權利要求】
1.一種人工誘導石斑魚雌核發育魚苗的方法，該方法包括如下步驟: (1)雄魚的選擇和精子的採集: 選擇體格健壯體表無傷的鞍帶石斑魚雄性成魚為親本(5-7齡)，體重60-80kg /尾，置於海上網箱或陸地池塘進行培育，投餵冰鮮雜魚和魷魚進行培育；待海水溫度穩定在28-32°C時，根據斜帶石斑魚排卵規律，提前1-2日給鞍帶石斑魚雄魚注射HCG(200U / kg)，20-28小時後將雄魚置於封閉網箱中，採用麻醉劑將其麻醉後撈出水面置於帆布擔架內擠精，採集的鞍帶石斑魚鮮精，使用精子稀釋液按照1:8-10比例稀釋，0-4°C冷藏保存； (2)精子遺傳物質滅活 取稀釋過的鞍帶石斑魚精液平鋪在預冷的培養皿中，精子液面厚度控制在0.l-ο.15_，置於紫外燈箱中照射，照射過程中遮蔽自然光並置於搖床中進行，保持不停的搖動以確保精子照射均勻，紫外光照射劑量為40-60mJ / cm2; (3)人工授精的方法 鞍帶石斑魚紫外照射處理完成後，收集精子置於冰上避光保存；將待產斜帶石斑魚雌魚撈出，擦乾體表水分，將成熟卵子擠入乾燥刻度燒杯中；按照毫升處理精子授精40-60毫升卵子的比例進行精卵人工混合，混合45-90秒後加入潔淨自然海水完成人工授精； (4)冷休克誘導石斑魚卵子 提前準備預冷的海水及冰箱，人工授精後4-8分鐘，用小手操網將卵子撈出，按照每50ml卵子使用2000-4000ml預冷的2_6°C海水的比例立即轉入預冷的海水中，低溫休克處理時間為15-25分鐘，經孵化桶孵化得人工培育石斑魚育苗。
2.根據權利要求1所述的方法，所述的精子稀釋液配方為:鹿糖llOmM，KHCO3IOOmM,胎牛血清10%，Tris酸10mM。
3.根據權利要求1所述的方法，所述的麻醉劑是丁香酚。
【文檔編號】A01K61/00GK103493758SQ201310409252
【公開日】2014年1月8日 申請日期:2013年9月11日 優先權日:2013年9月11日
【發明者】駱劍, 陳國華, 吳廷昌, 黃飛, 佘長寧, 陳猛, 樊佳偉, 王珺 申請人:海南大學