一種高催化效率鹼性澱粉酶突變體及其製備方法和應用的製作方法

2023-06-22 21:19:41

專利名稱：一種高催化效率鹼性澱粉酶突變體及其製備方法和應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種高催化效率澱粉酶突變體及其製備方法。
背景技術：
α-澱粉酶(EC3. 2. I. I)是一種降解澱粉的重要的工業用酶，主要應用在食品、紡織、醫藥、洗滌劑等領域。耐氧化性澱粉酶可用於紡織品退漿、洗滌劑添加劑以及以澱粉作粘結劑的粘度調節劑等。Horikoshi在1971年首先報導了產自嗜鹼菌Α-40-2的鹼性澱粉酶。2007年Saxena等人篩選到一株可以產鹼性澱粉酶的菌株。2010年Pancha等(Pancha I, Jain D, ShrivastavA, Mishra S，Shethia B, Mishra S，VP M, Jha B. Athermoactive[alpha]-amylase from a Bacillus sp. isolated fromCSMCRI salt farm.International Journal of Biological Macromolecules, 2010，47 (2) : 288-291.)篩選出一株產耐溫澱粉酶菌株。目前，國內的前處理酶製劑市場基本被丹麥諾維信公司和美國傑能科公司所壟斷。諾維信公司介紹了一種澱粉酶，有較寬的pH及溫度範圍。具有耐化學氧化性的澱粉酶主要應用於洗滌劑添加劑和紡織退漿一浴法等工業中。但耐氧化性澱粉酶的工業化生產並沒有報導。耐氧化性澱粉酶生產菌株的獲得主要通過篩選、誘變和酶分子改造獲得。篩選的盲目性較大，不容易獲得目的菌株。誘變包括自然突變和誘變，自然突變的機率相當小，誘變的工作量較大且不可控出現負突變的機率較大。酶分子改造目的性強，針對酶分子具體結構分析進行改造，達到耐氧化性的目的。

發明內容
本發明提供了一種高催化效率澱粉酶突變體，是澱粉酶的N端區域與短肽通過PT-Iinker連接得到的突變體。所述短肽胺基酸序列如SEQ ID NO. I所示。所述澱粉酶胺基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。所述PT-linker 序列如 SEQ ID NO. 3 所不。本發明還是提供一種製備所述澱粉酶突變的方法，其技術方案如下I)據短肽序列，採用化學全合成的方法全合成後克隆到質粒pET_22b(+)中，構建重組質粒 pET-22b (+) -P ；2)根據嗜鹼芽孢桿菌(Bacillus alcalophilus)的澱粉酶序列,採用化學全合成的方法全合成；3)針對已分析序列設計引物，將全合成的澱粉酶序列克隆到重組質粒pET-22b (+) -P中，構建含有短肽和澱粉酶片段的重組質粒pAAQ-P，將短肽融合到鹼性澱粉酶的N-端，獲得含有突變澱粉酶序列與短肽序列融合狀態的重組載體；4)將突變後重組載體轉化大腸桿菌BL21，誘導表達，獲得突變株。5)測定突變株表達澱粉酶的催化效率。本發明提供的澱粉酶突變體催化效率高，在此改造條件下，嗜鹼芽孢桿菌澱粉酶比酶活比對照(突變前)例的比酶活提高4. I倍；催化效率比對照(突變前)例的催化效率提高3. 5倍。相對於採用篩菌或誘變等手段，縮短了酶學性質改造時間。將該高催化效率澱粉酶突變體應用於紡織退漿、洗滌劑添加等領域，可以在高效降解澱粉，具有廣闊的應用前
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圖I :pAAQ_P的質粒圖譜。圖2 :澱粉酶3D空間結構。
具體實施例方式實施例I :澱粉酶高催化效率提高突變分析與方法通過對澱粉酶3D空間結構(圖2)進行分析，確定區域A (催化區域)、區域B、區域C。同時，對催化區域(催化區域)進行分析發現3個活性位點(Asp238，Glu268, Asp330)。根據澱粉酶的胺基酸序列及結構相關性，選用短肽與鹼性澱粉酶序列進行融合表達，提高其催化效率。據短肽序列，採用化學全合成的方法全合成後克隆到質粒pET_22b(+)中，構建重組質粒pET-22b(+)-P。進而根據嗜鹼芽孢桿菌(Bacillus alcalophilus)的澱粉酶序列，採用化學全合成的方法全合成。針對已分析序列設計引物，將全合成的澱粉酶序列克隆到重組質粒pET-22b (+) -P中，構建含有短肽和澱粉酶片段的重組質粒pAAQ-P，將短肽融合到鹼性澱粉酶的N-端，獲得含有突變澱粉酶序列與短肽序列融合狀態的重組載體。突變後重組載體轉化大腸桿菌BL21，誘導表達，獲得突變株。將重組質粒轉化大腸桿菌宿主BL21，進行誘導表達，獲得耐氧化性突變後的重組澱粉酶。實施例2 :融合前後澱粉酶比酶活力測定DNS法測定鹼性澱粉酶酶活I) DNS試劑的配置稱取2. 5g3, 5_ 二硝基水楊酸溶於少量水中，加入O. 5g苯酚，再溶解O. 075g亞硫酸鈉、2. 5g氫氧化鈉、50g酒石酸鉀鈉，將其轉入500mL容量瓶中搖勻定容，儲存於棕色瓶放置在4° C冰箱中待用。2)麥芽糖標準曲線的製作配製O. 2g/L-l. Og/L不同濃度的麥芽糖溶液。取ImL不同濃度的麥芽糖與同體積的DNS溶液混合，放入沸水浴中，水浴lOmin。用冷水冷卻，定容至10mL，A54tl測定吸光值。以麥芽糖的濃度為橫坐標，以吸光值為縱坐標，製作標準曲線。3)將2mLl%的可溶性澱粉加入到試管中，加入ImL的緩衝液，混勻，55° C預熱5min,加入O. 4mL稀釋好的酶液,反應5min。取ImL反應液與同體積的DNS試劑混勻,沸水浴煮沸lOmin，用冷水冷卻，定容至10mL，混勻後，以沒有加酶液但加入當量的去離子水的反應體系作為對照，測定A540吸光值。澱粉酶比酶活力測定將鹼性澱粉酶純化後，利用Bradford方法測定純化後融合前後澱粉酶的蛋白濃度。將測定蛋白濃度的澱粉酶，利用3)方法測定酶活力。利用酶活力單位與澱粉酶蛋白濃度相比較，獲得澱粉酶的比酶活。融合後，嗜鹼芽孢桿菌澱粉酶比酶活比對照(突變前)例的比酶活提高4. I倍。該澱粉酶催化效率獲得極大提高，在可以更高效降解澱粉。
酶活力單位定義在ρΗΙΟ. O,溫度55° C，在Imin降解可溶性澱粉產生I μ g還原物質(以麥芽糖計算)所需要的酶量，為I個酶活單位(U)。實施例3 :融合前後澱粉酶催化效率測定將融合短肽後的重組澱粉酶純化後，採用ρΗΙΟ. O甘氨酸-氫氧化鈉緩衝液，將緩衝液與可溶性澱粉混勻，採用3)的方法測定澱粉酶酶活力。將鹼性澱粉酶純化後，利用Bradford方法測定純化後融合前後澱粉酶的蛋白濃度。利用Eadie-hofstee曲線方法,確定鹼性澱粉酶的最大反應速率Vmax。將於酶對應的蛋白濃度進行相比，獲得澱粉酶的催化效率常數(kMt)。短肽融合後，催化效率比對照(突變前)例的催化效率(k Mt)提高3. 5倍。該澱粉酶催化效率獲得極大提聞，在可以聞效降解澱粉。
權利要求
1.一種高催化效率鹼性澱粉酶突變體，其特徵在於，是澱粉酶的N端區域與短肽通過PT-Iinker連接得到的突變體。
2.權利要求I所述突變體，其特徵在於，所述短肽胺基酸序列如SEQID NO. I所示。
3.權利要求I所述突變體，其特徵在於，所述澱粉酶胺基酸序列如SEQID NO. 2所示。
4.一種高催化效率鹼性澱粉酶突變體，其特徵在於，胺基酸序列如SEQ ID NO. 2所示的澱粉酶N端區域與胺基酸序列如SEQ ID NO. I所示的短肽通過PT-Iinker連接得到的突變體。
5.權利要求1-4任一所述突變體，其特徵在於，所述PT-Iinker序列如SEQID NO. 3所
6.一種製備權利要求I所述澱粉酶突變的方法，其特徵在於，步驟如下 1)據短肽序列，採用化學全合成的方法全合成後克隆到質粒pET-22b(+)中，構建重組質粒 pET-22b (+) -P ； 2)根據嗜鹼芽孢桿菌的澱粉酶序列，採用化學全合成的方法全合成； 3)針對已分析序列設計引物，將全合成的澱粉酶序列克隆到重組質粒pET-22b(+)-P中，構建含有短肽和澱粉酶片段的重組質粒pAAQ-P，將短肽融合到鹼性澱粉酶的N-端，獲得含有突變澱粉酶序列與短肽序列融合狀態的重組載體； 4)將突變後重組載體轉化大腸桿菌BL21，誘導表達，獲得突變株。
7.權利要求4所述製備方法，其特徵在於，所述短肽胺基酸序列如SEQID NO. I所示。權利要求4所述製備方法，其特徵在於，所述澱粉酶胺基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
全文摘要
本發明公開了一種高催化效率鹼性澱粉酶突變體及其製備方法和應用，屬於遺傳工程領域。本發明以嗜鹼芽孢桿菌(Bacillus alcalophilus)JN21(CCTCC NO:M2011231)澱粉酶為母本，採用分子生物學技術對嗜鹼芽孢桿菌澱粉酶序列進行短肽融合表達。在此改造條件下，嗜鹼芽孢桿菌澱粉酶比酶活比對照(突變前)例的比酶活提高4.1倍；催化效率比對照(突變前)例的催化效率提高3.5倍。利用此策略可以大大提高澱粉酶的催化效率，為其在紡織退漿、洗滌劑添加劑等工業生產領域提供了基礎。此策略對澱粉酶及其它酶的催化效率提高具有重要的指導意義。
文檔編號C12R1/07GK102965360SQ20121053326
公開日2013年3月13日 申請日期2012年12月12日 優先權日2012年12月12日
發明者陳堅, 堵國成, 劉龍, 李江華, 楊海泉 申請人:江南大學