用於分析人類白細胞抗原(hla)基因型的寡聚核苷酸組合物及其檢測方法
2023-06-22 12:31:31
專利名稱：用於分析人類白細胞抗原(hla)基因型的寡聚核苷酸組合物及其檢測方法
背景技術：
發明領域本發明涉及用於分析HLA基因型的寡聚核苷酸及其檢測方法。
所涉及技術的描述本發明涉及寡聚核苷酸晶片組合物及其製造方法，特別是涉及用於分析HLA基因型以研究移植所需組織相容性的寡聚核苷酸晶片組合物，及其製造方法和檢測方法。
主要組織相容性複合體(MHC)是由基因水平控制的複雜的抗原系統，其是與器官移植時的排斥反應(免疫應答)有關的基因群。其存在於所有動物中。人類MHC首次發現在識別白細胞表面抗原的抗白細胞因子中，因此被稱作人類白細胞抗原(HLA)，其位於6號染色體的短臂上。根據免疫學特徵、分子結構、基因位置和所分布細胞的類型，該HLA基因座被分成3類(HLA-I、II和III)。其中，HLA-I的HLA-A、-B、-Cw和HLA-II的HLA-DR的基因座被認為與組織的排斥反應的關係最為密切。
HLA的代表性特徵如下。首先，因為HLA基因有超過幾十個的等位基因，所以HLA基因在許多人類遺傳標記中表現出最高的遺傳多態性。第二是單元型水平的遺傳。因為HLA基因類別中的基因緊密地位於6號染色體上，所以它們通常是整體遺傳自親代。這些等位基因的特定組合被稱為單元型。第三是人類種族依賴的HLA遺傳多態性。與其它基因相比，HLA等位基因的分布根據每個種族而表現出很大差異。該特徵在HLA單元型中更為明顯。一些種族的HLA基因表現出強烈的連鎖不平衡，因此特定種群的HLA單元型就是某些人類種群的特徵。由於這種HLA的遺傳多態性，HLA基因的基因頻率和單元型頻率被用作研究人類種群基因背景差異的有效標記。第四，HLA基因的另一個重要作用與免疫應答有關。HLAI類和II類分子與細胞中的抗原結合，接著其出現在細胞表面，然後T細胞抗原受體識別該結合了HLA分子的抗原，這引起免疫應答。
如上所述，因為HLA基因的高度遺傳多態性和與免疫應答有關的特點，所以其被用於許多領域如器官移植、與疾病的相關性、輸血、法醫學應用例如親子鑑定和人類學研究。當今在腎和骨髓移植程序中HLA檢測是必須的。在移植前，對供體和受體進行ABO血型檢測和HLA-A、-B、-Cw和-DR型檢測並進行交叉配對試驗。在骨髓、腎等移植的情況下，如果供體和受體的HLA類型不同，則會有對於移植器官的排斥反應。通常骨髓移植需要供體和受體之間遺傳完全一致，因為它是免疫細胞的移植。因此，選擇與受體HLA型一致的供體是十分重要的。特別的是，因為在如急性或慢性白血病、免疫不全和再生障礙性貧血等的情況下進行骨髓移植時的HLA型應該完全一致，所以遺傳了相同HLA型的兄弟或姐妹是最有資格的。但是，如果沒有親屬，則要在沒有血緣關係的人中尋找有資格的供體。在這樣的情況下，必須對許多人進行分析以確定HLA基因型。
隨著分子生物學的發展，發現了控制HLA抗原的等位基因的鹼基序列，因此能夠以通過鹼基序列的差異來發現HLA多樣性的方式來分析HLA基因。特別是PCR技術的引入使HLA的DNA分型快速發展，並且幾乎所有的HLA多態性都在DNA水平上得到說明。使用PCR進行HLA等位基因的分類有如下優點例如不必要分離T淋巴細胞和B淋巴細胞的分離，因為所有有核細胞都可以作為樣品，而無論HLA分子在細胞表面的表達數量是多少，並且有可能利用不含有淋巴細胞的體液和組織進行基因型分析。DNA也是相對穩定的，因此它可以在冷藏條件下被儲存幾個月，在冷凍條件下幾乎永久保存。DNA分型技術的最重要的優點之一是，它能夠對大量HLA等位基因進行分類。
目前，有多種通常使用的HLA DNA分型方法。首先，PCR-SSP方法是進行合成每個等位基因鹼基序列的特異性引物的PCR。這需要大量的引物來區分幾十個等位基因。其分析快速並且是簡單的方法，但它需要細心專心、專業知識和長時間以合成引物，並且在分析大量樣品的時候會受到限制。其還有一個缺點即難以一次處理多個樣品因為等位基因越多就需要越大量的PCR-SSP。第二，通過PCR-RFLP區分HLA基因型的方法是一種用於分析等位基因對限制性酶反應類型的相對簡單的方法。該方法通過被多種限制性內切酶降解的一定長度的DNA片段區分等位基因的類型。雖然這種方法容易確定結果而且簡便，但它的缺點是例如在限制性內切酶的識別位點受到限制時，它就不能進行區分，並且由於需要使用聚丙烯醯胺凝膠因此其不能同時區分大量樣品或幾十個等位基因。因此，其對於分析只有幾個等位基因的基因型的情況是足夠的。第三，PCR-SSCP方法是加入變性劑如甲醯胺變性為單鏈DNA(ssDNA)後，將PCR產物在非變性聚丙烯醯胺凝膠上進行電泳。ssDNA根據鹼基序列在電泳中有特定的結構並因此有特定的遷移速率，因此各自表現出其它類型的條帶。利用這些性質分析HLA基因型的技術非常複雜並需要很高的技術。對結果進行分析時需要大量的經驗和知識。第四，基於序列的分型(Sequence Based Typing)是在對HLA基因分別進行PCR擴增後研究鹼基序列的方法。用於該方法的試劑盒的一個例子是ABI公司(美國)的HLA基於序列的分型(SBT)。然而該試劑盒非常昂貴並且該方法需要價格昂貴的設備。而且實驗程序也十分複雜。第五，PCR-SSOP方法是一種分析方法，其合成與表示遺傳多態性的區域的鹼基序列互補的探針，並分析探針和PCR擴增產物的雜交。因為容易發生與其它具有相似鹼基序列的等位基因的雜交，所以該方法需要大量探針和經驗、技術來建立適當的雜交溫度和反應條件。即使該方法能夠根據一種探針得到精確的結果，但由於使用濾紙，所以在固定大量探針方面是受到局限的，而且由於一份濾紙只能分析一種類型，所以需要大量時間和勞力來處理和分析很多樣品。可以得到的使用該方法的商品是INNOGENETICS公司(比利時)的INNO LiPA試劑盒和使用Line Probe分析方法(該方法是用分別用於HLA I類和II類的SSOP進行反向雜交)的DYNAL Biotech公司(美國)的Dynal RELITMSSO HLA分型試劑盒。
如上所述，雖然存在一些使用幾種分型方法來分析HLA基因的商品，但是這些方法的共同的缺點是，同時進行HLA-A、-B、-Cw和DR的分型時需要很多時間和勞力。特別是，分析大量樣品更加困難。
最近的DNA晶片技術(該技術可以將少量的DNA以高密度固定在如微小的玻片、矽等薄板上並能夠同時對大量樣品進行分析)開發了能夠用於分析基因表達、基因診斷、尋找基因突變、藥物檢測以及疾病診斷等的新型分析系統。本發明就是利用這種DNA晶片技術，在玻片上同時對HLA-A、-B、-Cw和-DR進行分析。即，將每個探針結合到醛基化玻片的5個區域上。將通過不對稱PCR方法擴增的HLA基因與結合在玻片上的探針雜交。通過對使用HLA基因分型程序對得到的探針進行分析可以鑑定HLA基因型。
發明內容
因此，為了克服上述問題，本發明的目的是提供一種包括用於分析HLA基因型的組合物的寡聚核苷酸組合物。
本發明的另一個目的是，提供一種使用該組合物的改良的HLA基因分型方法。
為了達到上述目的，本發明提供了一種具有多個用於分析HLA基因型的寡聚核苷酸探針的組合物，其中該組合物包括至少一個選自由以下探針組構成的組的探針組由至少兩個用於分析HLA-A基因型的探針所組成的探針組，其探針選自由SEQ ID NO1-41所組成的組；由至少兩個用於分析HLA-B基因型的探針所組成的探針組，其探針選自由SEQ ID NO42-89所表示的鹼基序列組成的組；由至少兩個用於分析HLA-Cw基因型的探針所組成的探針組，其探針選自由SEQ ID NO90-112表示的鹼基序列所組成的組；和由至少兩個用於分析HLA-DR基因型的探針所組成的探針組，其探針選自由SEQ ID NO113-140表示的鹼基序列所組成的組。
本發明還提供了一種測試用支持物，將具有多個用於分析HLA基因型的寡聚核苷酸探針的組合物固定在其上，其中該組合物包括至少一個選自由以下探針組構成的組的探針組由至少兩個用於分析HLA-A基因型的探針所組成的探針組，其探針選自由SEQ ID NO1-41所組成的組；由至少兩個用於分析HLA-B基因型的探針所組成的探針組，其探針選自由SEQ ID NO42-89所表示的鹼基序列組成的組；由至少兩個用於分析HLA-Cw基因型的探針所組成的探針組，其探針選自由SEQ ID NO90-112表示的鹼基序列所組成的組；和由至少兩個用於分析HLA-DR基因型的探針所組成的探針組，其探針選自由SEQ ID NO113-140表示的鹼基序列所組成的組。
優選的是，所述支持物為自由濾膜、條帶(strip)、微球、晶片、玻片、多孔板、膜以及光學纖維所組成的組。
本發明還包括至少一種選自由SEQ ID NO141-157表示的用於分析HLA基因型的鹼基序列所組成的組的引物，其中該引物用於檢測所述探針和靶基因之間的雜交反應。
在本發明的引物中，由SEQ ID NO142、144、146、148、150、152和154表示的反義引物的優選例子是與生物素結合或與若丹明(rhodamine)結合的。在所述引物中，結合生物素的反義引物與鏈黴抗生物素蛋白-花青苷相互作用。
另外，本發明的優選實施例是提供一種分析HLA基因型的方法，其包括以下步驟(a)從血液細胞和組織中分離HLADNA；(b)使用分離的DNA進行不對稱PCR；(c)將權利要求1或2的探針與不對稱PCR產物結合；(d)鑑定所述結合。
在本發明的所述鑑定步驟中，使用若丹明或鏈黴抗生物素蛋白-花青苷，其中鏈黴抗生物素蛋白-花青苷與生物素結合。利用微陣列掃描對結果進行鑑定和HLA基因分型程序對結果進行分析，因此HLA基因型可以很容易被鑑定。在本發明的一個優選實施例中，開發了HLA寡聚核苷酸晶片，其用於在使用最近開發的DNA微陣列技術的玻片上同時對HLA-A、-B、-Cw和-DR進行分析。也就是說製備了用於分析HLA基因型的與21類HLA-A特異反應的38個寡聚核苷酸，與36類HLA-B特異反應的46個寡聚核苷酸，與14類HLA-Cw特異反應的20個寡聚核苷酸，與16類HLA-DRB1/3/4/5特異反應的22個寡聚核苷酸和與8類HLA-DRB1的B1*3、*8、*11、*12、*13、*14、*15和*16特異反應的17個寡聚核苷酸。它們被結合在醛基化玻片的5個區域上。將通過不對稱PCR方法擴增的HLA基因與結合在玻片上的寡聚核苷酸探針進行雜交。利用螢光反應方法對反應後的探針進行分析，鑑定了HLA的87個基因型。
圖1是表示HLA寡聚核苷酸晶片整個玻片的圖。即具有如標示數字所示的5個槽，以在玻片上同時對HLA-A、-B、-Cw和-DR進行分析。如表所示，其中在總共155個探針中，將下列探針在玻片上設置兩次，其被分在每個組中38個區分HLA-A基因型的探針，2個用作其陽性對照的探針和1個用作其陰性對照的探針；46個區分HLA-B基因型的探針，1個用作其陽性對照的探針和1個用作其陰性對照的探針；20個區分HLA-Cw基因型的探針，2個用作其陽性對照的探針和1個用作其陰性對照的探針；22個區分HLA-DRB1/3/4/5基因型的探針，1個用作其陽性對照的探針和1個用作其陰性對照的探針；17個增強區分HLA-DRB1基因型能力的探針(其是必需的因為區分HLA-DRB1/3/4/5基因型的探針受到DRB3/4/5基因型的影響並且HLA-DRB1的分析變得部分不清楚)，1個用於陽性對照的探針和1個用於陰性對照的探針。通過將COVERWELL PERFUSION CHAMBER(SIGMA美國)附著到分散狀態的探針上以製造HLA寡聚核苷酸晶片，用來進行區分每個基因型的探針的混合反應。
圖2至6是表示HLA寡聚核苷酸晶片對於HLA-A*11/*31、B*27、Cw*06和DRB*01/*11/DRB3型的螢光反應結果。這些圖是將圖1所示的玻片的5個槽中所發生反應進行放大的圖像。
圖2a是表示HLA寡聚核苷酸晶片對於含有HLA-A*11和HLA-A*31型的樣品同時發生的螢光反應的結果。該圖表示在41個探針中的與A*11型相關的探針13、14、15、17、18、23、29、30和33以及與A*31相關的探針11、13、15、18、21、25、26、29、32、39和40(這些在表4中被稱為「活性HLA型」)上同時發生的陽性反應。探針01和41是陽性對照，其出現在所有反應中，探針06是陰性對照，其在任何反應中都不出現，這也能證明試驗的精確度。設置相同探針的兩個相同的點用以使反應更加精確和減少誤差。
圖2b表示固定在玻片上的探針的位置。
圖3a是表示HLA寡聚核苷酸晶片對於含有HLA-B*27型的樣品的螢光反應的結果。該圖表示發生48個探針中與B*27相關的探針09、12、21、30、31、32、36、37、42和47(其在表5中被稱為「活性HLA型」)上的陽性反應。探針01是陽性對照，其出現在所有反應中，探針06是陰性對照，其在任何反應中都不出現，這也能證明試驗的精確度。設置相同探針的兩個相同的點用以使反應更加精確和減少誤差。
圖3b表示設置在玻片上的探針的位置。
圖4a是表示HLA寡聚核苷酸晶片對於含有HLA-Cw*06型的樣品的螢光反應的結果。該圖表示發生在23個探針中與Cw*06相關的探針06、08、13和17上的陽性反應(其在表6中稱為「活性HLA型」)。探針01和23是陽性對照，其出現在所有反應中，探針04是陰性對照，其在任何反應中都不出現，這也能證明試驗的精確度。設置相同探針的兩個相同的點用以使反應更加精確和減少誤差。
圖4b表示設置在玻片上的探針的位置。
圖5a是表示HLA寡聚核苷酸晶片對於含有HLA-DRB1*01和HLA-DRB1*11型的樣品同時發生的螢光反應的結果。該圖表示同時發生在41個探針中與DRB1*01相關的探針07、10和與DRB1*11相關的探針04、10、13和與DRB1*11一起遺傳的DRB3相關的探針16、24上的陽性反應(其在表7中被稱為「活性HLA型」)。探針01是陽性對照，其出現在所有反應中，探針05是陰性對照，其在任何反應中都不出現，這也能證明試驗的精確度。設置相同探針的兩個的相同的點用以使反應更加精確和減少誤差。
圖5b表示設置在玻片上的探針的位置。
圖6a是表示HLA寡聚核苷酸晶片對於含有HLA-DRB1*01和HLA-DRB1*11型的樣品同時發生的螢光反應的結果。該圖表示同時發生在19個探針中的與選擇性擴增所得到的DRB*11相關的探針07、10、13上的陽性反應(其在表8中被稱為「活性HLA型」)。探針01是陽性對照，其出現在所有反應中，探針04是陰性對照，其在任何反應中都不出現，這也能證明試驗的精確度。設置相同探針的兩個相同的點用以使反應更加精確和減少誤差。
圖6b表示設置在玻片上的探針的位置。
螢光引物和探針用在PCR和雜交反應中。為了分析結果，以使用GenePiX4000 Scanner(Axon儀器公司，美國)的HLA分型程序對表現探針類型的螢光進行分析。
具體實施例方式
的詳細描述參考附圖根據示範性實施方式對本發明進行詳細描述，其僅作為說明的方法提供，因此並不限制本發明。
實施例1合成HLA引物及其鹼基序列表1中表示用於不對稱PCR的HLA PCR引物，其分析HLA-A、-B和Cw的外顯子2和3以及HLA-DRB1/3/4/5的外顯子2的共同反應位點，並分析僅擴增8種特定基因型的位點例如HLA-DBR1的外顯子2上的B1*3、*8、*11、*12、*13、*14、*15和*16。
雜交反應後，將若丹明連接在不對稱PCR中使用的反義引物的5′端用來鑑定螢光反應，或者在雜交反應後，連接生物素使其與鏈黴抗生物素蛋白-花青苷結合。該引物應發明人的要求由Metabion公司(德國)按照分子克隆(Molecular cloning)第三版(Sambrook和Rusell，Cold Spring HarborLaboratory Pess，New York，美國，2001)10.42中描述的合成寡聚核苷酸的方法合成的。
表1 用於分析HLA基因型的引物鹼基序列
實施例2HLA DNA的提取和不對稱PCR反應1)使用Gentra Systems公司的PUREGENETMDNA分離試劑盒分離HLA DNA。將300μl血液與900μl RBC裂解溶液混合。將混合物在室溫下反應1分鐘，並伴隨10次振動。然後，以13000rpm將混合物離心20秒。取20μl上清液。
2)將剩餘的上清液漩渦(vortex)10秒以重懸浮白細胞後，加入300μl細胞裂解溶液。然後用移液管將細胞裂解。
3)向細胞裂解溶液中加入100μl蛋白質沉澱溶液，將混合液漩渦20秒。然後以13000rpm將混合液離心1分鐘。
4)將含有DNA的上清液與100％的異丙醇混合。然後搖試管50次以混合，以13000rpm將試管液離心1分鐘。
5)除去上清液並用300μl 70％乙醇清洗沉澱。以13000rpm離心1分鐘。
6)除去上清液，使沉澱乾燥。然後用100μl水合DNA的溶液對沉澱進行懸浮。
7)使用GeneAmp PCR體系9600熱循環儀(Perkin Elmer CetusCompany，美國)進行如表2所示的不對稱PCR反應。
8)將5μl不對稱PCR產物和1μl凝膠上樣緩衝液(0.25％溴酚蘭，0.25％二甲苯胺FF和15％Ficol 1400)混合。然後在含有1μl/ml溴化乙啶(EtBr)的2％瓊脂糖凝膠上進行電泳。使用裝配紫外透射儀的圖像分析儀(VilberLourmat Company，France)對PCR帶進行鑑定。
表2 HLA不對稱PCR反應條件
實施例3合成用於製備HLA寡聚核苷酸晶片的探針及其鹼基序列將氨基鏈(Amino links)連接在所有探針的每個5′端用於醛基化玻片上的共價鍵。將10-20個寡聚(dT)連接到探針上使雜交容易進行。然後，將表3中所示的鹼基連到氨基鏈-寡聚(dT)10-20上。簡言之，具有「胺基酸鏈-寡聚(dT)10-20-探針鹼基序列」順序的引物已經按照發明人的要求由Metabion公司合成。通過分析如表3中所述21種類型的HLA-A、36種類型的HLA-B、14種類型的HLA-Cw和16種類型的HLA-D，確定所鑑定HLA基因型的鹼基序列。
在表4至7所示的鹼基序列中，中間的大寫字母表示的鹼基是最重要的鹼基序列。以所述鹼基為中心，合成了約13-30bp的探針，其確定了反映Tm和GC％的60～65℃。
表3 所分析的HLA基因型和種類
表4 用於確定HLA-A基因型的探針鹼基序列
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表5 用於測定HLA-B基因型的探針鹼基序列
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表6 用於確定HLA-Cw基因型的探針鹼基序列
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表7 用於確定HLA-DRB1/3/4/5基因型的探針鹼基序列
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表8 用於確定HLA-DRB1基因型的探針鹼基序列
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實施例4製備HLA寡聚核苷酸晶片1)在寡聚核苷酸晶片的製備中使用NuricellInc.(韓國)或CellInc.(美國)的醛基化玻片。將100pmole/μl的連接氨基的探針與等量的3X SSC混合。將所得到的探針固定在玻片上並在室溫下反應16小時。然後用0.2％的SDS清洗該玻片2次，每次5分鐘，接著用蒸餾水清洗2次，每次5分鐘。用加熱至95℃的蒸餾水清洗2分鐘後，用室溫的蒸餾水清洗5分鐘。
2)該玻片與硼氫化鈉(1.3g NaBH4，375ml PBS和125ml 100％EtOH)反應5分鐘後，用0.2％的SDS清洗三次，每次1分鐘，用蒸餾水清洗兩次，每次1分鐘，然後在室溫下乾燥。
3)通過將Coverwell Perfusion Chamber(SIGMA，美國)連接在玻片上分割出反應槽，用於HLA PCR的5種反應物各自反應。在使用前將製成的HLA寡聚核苷酸晶片於室溫下儲藏於暗處。
實施例5與HLAPCR產物的雜交反應1)將結合了若丹明或生物素的HLAPCR產物與雜交溶液(3X SSC和0.3％SDS)以1∶9的比例混合。當使用生物素引起螢光反應時，加入1μl/ml鏈黴抗生物素蛋白-花青苷進行反應。
2)向玻片的帶蓋的反應室中滴加90μl雜交緩衝液。該玻片在62℃下反應1小時。
3)在室溫下用1X SSC清洗該玻片5分鐘，用0.1X SSC清洗2分鐘，然後在室溫下乾燥。
4)鑑定結果使用Scanner(GenePiX4000，Axon儀器公司，美國)分析螢光探針以對HLA基因型進行鑑定。用發明人開發的HLA基因分型程序對其進行分析。
在表4～7中所示的鹼基序列中，中間由大寫字母表示的鹼基是最重要的鹼基序列。以所述鹼基為中心，合成了約13～30bp的探針，其確定反映Tm和GC％的60-65℃。
結果如圖2至6中所示。圖中，在PCR和雜交反應中使用螢光引物和探針。使用GenePiX4000 Scanner(Axon儀器公司，美國)分析螢光探針，以對HLA基因型進行鑑定。使用由發明人開發的HLA基因分型程序對其進行分析。
HLA基因分型程序通過對位於本發明的HLA寡聚核苷酸晶片的每個室中的探針的結果進行分析，形成一個合適的標準化方法。該程序形成中間區域，它引入了能夠劃分陽性和陰性的界線值這一概念。我們基於所述界線值來判斷探針是陽性還是陰性。通過將探針的陽性或陰性與程序中編制的陽性和陰性類型的對照表比較，分析相應得HLA基因型，對HLA基因型進行鑑定。
工業上的應用本發明中，開發了一種寡聚核苷酸晶片，通過分析HLA基因用來診斷HLA-A、-B、Cw和DR基因型。使用該晶片的HLA基因分型，與通常使用的試劑盒相比，可以節約大量時間、材料成本和人工成本。即，本發明的HLADNA晶片僅通過一次實驗就可以表現出HLA-A、-B、Cw和DR基因型，並且因為可以緊密地固定探針所以對於大量HLA等位基因只需要1個玻片，而通常的檢測方法和試劑盒不能同時分析HLA-A、-B、Cw和DR基因型，因此實驗必須分別進行。另外，本發明的方法使用了螢光材料，因此不需要顏色產生的步驟。本發明的方法也不需要通常方法所必需的許多步驟如清洗、顏色反應等，因此本發明的方法可以節約大量時間來得到期望的結果。
序列表110博康有限公司吉諾切克有限公司120用於分析人類白細胞抗原(HLA)基因型的寡聚核苷酸組合物及其檢測方法130PCT04-032150KR10200400201551512004-03-24160157170KopatentIn 1.71210121119212DNA213人工序列220
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223用於分析HLA-A基因型(HLA-A 05)的探針4005attgggaccg ggagaca 17210621116212DNA213人工序列220
223用於分析HLA-A基因型(HLA-A 06)的探針4006tgcgctctgt gaccgc 16210721117212DNA213人工序列220
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223用於分析HLA-A基因型(HLA-A 08)的探針
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223用於分析HLA-A基因型(HLA-A 10)的探針40010ttgggacctg cagacacgg 192101121119212DNA213人工序列220
223用於分析HLA-A基因型(HLA-A 11)的探針40011gcaggagagg cctgagtat 192101221117212DNA213人工序列220
223用於分析HLA-A基因型(HLA-A 12)的探針40012ctgaccgaga gagcctg 17
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223用於分析HLA-A基因型(HLA-A 13)的探針40013cagattgacc gagtggacct g212101421121212DNA213人工序列220
223用於分析HLA-A基因型(HLA-A 14)的探針40014cagactgacc gagtggacct g212101521117212DNA213人工序列220
223用於分析HLA-A基因型(HLA-A 15)的探針40015ctgaccgagt ggacctg 172101621119212DNA213人工序列220
223用於分析HLA-A基因型(HLA-A 16)的探針40016actcgcagtt cgtgcagtt 192101721114212DNA213人工序列
220
223用於分析HLA-A基因型(HLA-A 17)的探針40017gagggccggt gcgt142101821116212DNA213人工序列220
223用於分析HLA-A基因型(HLA-A 18)的探針40018cgtggagtgg ctccgc 162101921118212DNA213人工序列220
223用於分析HLA-A基因型(HLA-A 19)的探針40019tacctggatg gcacgtgc 182102021119212DNA213人工序列220
223用於分析HLA-A基因型(HLA-A 20)的探針40020ccagatgatg tttggctgc 192102121116212DNA213人工序列220
223用於分析HLA-A基因型(HLA-A 21)的探針
40021tggagggcac gtgcgt 162102221116212DNA213人工序列220
223用於分析HLA-A基因型(HLA-A 22)的探針40022tggatggcac gtgcgt 162102321118212DNA213人工序列220
223用於分析HLA-A基因型(HLA-A 23)的探針40023ggagcagcag agagccta182102421122212DNA213人工序列220
223用於分析HLA-A基因型(HLA-A 24)的探針40024caccatccag aggatgtatg gc 222102521122212DNA213人工序列220
223用於分析HLA-A基因型(HLA-A 25)的探針40025caccatccag atgatgtatg gc 2221026
21118212DNA213人工序列220
223用於分析HLA-A基因型(HLA-A 26)的探針40026cagatcaccc agcgcaag182102721117212DNA213人工序列220
223用於分析HLA-A基因型(HLA-A27)的探針40027gagacggccc atgaggc172102821117212DNA213人工序列220
223用於分析HLA-A基因型(HLA-A 28)的探針40028gaggcggccc atgaggc 172102921120212DNA213人工序列220
223用於分析HLA-A基因型(HLA-A29)的探針ttacatcgcc ttgaacgagg 202103021120212DNA213人工序列220
223用於分析HLA-A基因型(HLA-A 30)的探針40030ttacatcgcc ctgaacgagg 202103121119212DNA213人工序列220
223用於分析HLA-A基因型(HLA-A 31)的探針40031gcgggtatga acagcacgc 192103221120212DNA213人工序列220
223用於分析HLA-A基因型(HLA-A 32)的探針40032ccatccagat gatgtatggc 202103321120212DNA213人工序列220
223用於分析HLA-A基因型(HLA-A 33)的探針40033ccatccagat aatgtatggc 202103421118212DNA213人工序列220
223用於分析HLA-A基因型(HLA-A 34)的探針40034agcagtggag agcctacc18
2103521122212DNA213人工序列220
223用於分析HLA-A基因型(HLA-A 35)的探針40035ctcagaccac caagcacaag tg 222103621123212DNA213人工序列220
223用於分析HLA-A基因型(HLA-A 36)的探針40036tcacaccgtc cagaggatgt atg 232103721123212DNA213人工序列220
223用於分析HLA-A基因型(HLA-A 37)的探針40037tcacaccctc cagaggatgt atg 232103821123212DNA213人工序列220
223用於分析HLA-A基因型(HLA-A 38)的探針40038tcacaccatc cagaggatgt atg 232103921115212DNA
213人工序列220
223用於分析HLA-A基因型(HLA-A 39)的探針40039gggtcggact ggcgc 152104021115212DNA213人工序列220
223用於分析HLA-A基因型(HLA-A 40)的探針40040gggt cggacg ggcgc 152104121118212DNA213人工序列220
223用於分析HLA-A基因型(HLA-A 41)的探針40041ctgcgctctt ggaccgcg182104221119212DNA213人工序列220
223用於分析HLA-B基因型(HLA-B 42)的探針40042gccctcccgt tgattggag 192104321119212DNA213人工序列220
223用於分析HLA-B基因型(HLA-B 02)的探針
40043gcagctgaga acctacctg 192104421120212DNA213人工序列220
223用於分析HLA-B基因型(HLA-B 03)的探針40044tatttcgaca ccgccatgtc 202104521117212DNA213人工序列220
223用於分析HLA-B基因型(HLA-B 04)的探針40045cacccagctc aagtggg 172104621118212DNA213人工序列220
223用於分析HLA-B基因型(HLA-B 05)的探針40046ggccggaata ttgggacc182104721119212DNA213人工序列220
223用於分析HLA-B基因型(HLA-B 06)的探針40047agacggcacg attgagaca 19
2104821114212DNA213人工序列220
223用於分析HLA-B基因型(HLA-B 07)的探針40048aggatggcgc cccg142104921117212DNA213人工序列220
223用於分析HLA-B基因型(HLA-B 08)的探針40049tagagcaaga ggggccg 172105021117212DNA213人工序列220
223用於分析HLA-B基因型(HLA-B 09)的探針40050atctgcaagg ccaaggc 172105121119212DNA213人工序列220
223用於分析HLA-B基因型(HLA-B 10)的探針40051gacttaccga gaggacctg 192105221120212DNA213人工序列
223用於分析HLA-B基因型(HLA-B11)的探針40052gtatttccac accgccatgt 202105321120212DNA213人工序列220
223用於分析HLA-B基因型(HLA-B 12)的探針40053ggtatttcca cacctccgtg 202105421114212DNA213人工序列220
223用於分析HLA-B基因型(HLA-B 13)的探針40054cgctggagcg cgcg142105521116212DNA213人工序列220
223用於分析HLA-B基因型(HLA-B 14)的探針40055caaggcccag gcacag 162105621117212DNA213人工序列220
223用於分析HLA-B基因型(HLA-B 15)的探針40056
cgggtatgac caggacg 172105721115212DNA213人工序列220
223用於分析HLA-B基因型(HLA-B 16)的探針40057gtggagtcgc tccgc 152105821119212DNA213人工序列220
223用於分析HLA-B基因型(HLA-B 17)的探針40058acagaagtac aagcgccag 192105921119212DNA213人工序列220
223用於分析HLA-B基因型(HLA-B 18)的探針40059tccagaggat gtttggctg 192106021118212DNA213人工序列220
223用於分析HLA-B基因型(HLA-B 19)的探針40060tctcccagcg caagttgg182106121121
212DNA213人工序列220
223用於分析HLA-B基因型(HLA-B 20)的探針40061acgacggcaa agattacatc g212106221118212DNA213人工序列220
223用於分析HLA-B基因型(HLA-B 21)的探針40062cgggagacac agatctcc182106321115212DNA213人工序列220
223用於分析HLA-B基因型(HLA-B 22)的探針40063gacc tggggc ccgac 152106421117212DNA213人工序列220
223用於分析HLA-B基因型(HLA-B 23)的探針40064gttcgtgcgg ttcgaca 172106521123212DNA213人工序列220
223用於分析HLA-B基因型(HLA-B 24)的探針
40065cacatcatcc aggtgatgta tgg 232106621116212DNA213人工序列220
223用於分析HLA-B基因型(HLA-B 25)的探針40066agcgaggacg ggtctc 162106721118212DNA213人工序列220
223用於分析HLA-B基因型(HLA-B 26)的探針40067ctacaccgct atgtcccg182106821118212DNA213人工序列220
223用於分析HLA-B基因型(HLA-B 27)的探針40068ggaaggacaa gctggagc182106921114212DNA213人工序列220
223用於分析HLA-B基因型(HLA-B 28)的探針40069tggacggcac ccag14
2107021116212DNA213人工序列220
223用於分析HLA-B基因型(HLA-B 29)的探針40070ctacaccgcc gtgtcc 162107121119212DNA213人工序列220
223用於分析HLA-B基因型(HLA-B 30)的探針40071gcttcatcac cgtgggcta 192107221116212DNA213人工序列220
223用於分析HLA-B基因型(HLA-B 31)的探針40072ggacctggc tcctgg 162107321117212DNA213人工序列220
223用於分析HLA-B基因型(HLA-B 32)的探針40073cgcgctccgc tactaca 172107421115212DNA213人工序列
220
223用於分析HLA-B基因型(HLA-B 33)的探針40074ggagggcacg tgcgt 152107521118212DNA213人工序列220
223用於分析HLA-B基因型(HLA-B 34)的探針40075cgagagaacc tgcggatc182107621121212DNA213人工序列220
223用於分析HLA-B基因型(HLA-B 35)的探針40076caccctccag tggatgtatc c212107721123212DNA213人工序列220
223用於分析HLA-B基因型(HLA-B 36)的探針40077accctccaga atatgtatgg ctg 232107821118212DNA213人工序列220
223用於分析HLA-B基因型(HLA-B 37)的探針
40078agtccgagag aggagccg182107921119212DNA213人工序列220
223用於分析HLA-B基因型(HLA-B 38)的探針40079agaggatgtc tggctgcga 192108021122212DNA213人工序列220
223用於分析HLA-B基因型(HLA-B 39)的探針40080tatttctaca cctccgtgtc cc 222108121118212DNA213人工序列220
223用於分析HLA-B基因型(HLA-B 40)的探針40081ggagcaggac agagccta182108221118212DNA213人工序列220
223用於分析HLA-B基因型(HLA-B 41)的探針40082ggagcagcgg agagccta1821083
21121212DNA213人工序列220
223用於分析HLA-B基因型(HLA-B 42)的探針40083cgtgtggcgg agcagctgag a212108421118212DNA213人工序列220
223用於分析HLA-B基因型(HLA-B 43)的探針40084ggagcagtgg agagccta182108521120212DNA213人工序列220
223用於分析HLA-B基因型(HLA-B 44)的探針40085gacgccacga gtccgaggat 202108621117212DNA213人工序列220
223用於分析HLA-B基因型(HLA-B 45)的探針40086tccgcagaca cctggag 172108721118212DNA213人工序列220
223用於分析HLA-B基因型(HLA-B 46)的探針40087cggaacatga aggcctcc182108821118212DNA213人工序列220
223用於分析HLA-B基因型(HLA-B 47)的探針40088gggtaccacc aggacgcc182108921116212DNA213人工序列220
223用於分析HLA-B基因型(HLA-B 48)的探針40089gaggacggag ccccgg 162109021t23212DNA213人工序列220
223用於分析HLA-Cw基因型(HLA-Cw 01)的探針40090cggagtattg ggaccgggag aca 23210 9121128212DNA213人工序列220
223用於分析HLA-Cw基因型(HLA-Cw 02)的探針40091catgaagtat ttcttcacat ccgtgtcc 28
2109221123212DNA213人工序列220
223用於分析HLA-Cw基因型(HLA-Cw 03)的探針40092gaggtatttc tccacatccg tgt 232109321119212DNA213人工序列220
223用於分析HLA-Cw基因型(HLA-Cw 04)的探針40093agacggcacg attgagaca 192109421118212DNA213人工序列220
223用於分析HLA-Cw基因型(HLA-Cw 05)的探針40094tccgtgtcct ggcccggc182109521120212DNA213人工序列220
223用於分析HLA-Cw基因型(HLA-Cw 06)的探針40095cgcttcatct cagtgggcta 202109621119212DNA
213人工序列220
223用於分析HLA-Cw基因型(HLA-Cw 07)的探針40096agttcgtgca gttcgacag 192109721119212DNA213人工序列220
223用於分析HLA-Cw基因型(HLA-Cw 08)的探針40097tgaacctgcg gaaactgcg 192109821119212DNA213人工序列220
223用於分析HLA-Cw基因型(HLA-Cw 09)的探針40098gggccaggtt ctcacacca 192109921115212DNA213人工序列220
223用於分析HLA-Cw基因型(HLA-Cw 10)的探針40099cgcgggcatg accag 1521010021117212DNA213人工序列220
223用於分析HLA-Cw基因型(HLA-Cw 11)的探針
400100cgccctgaat gaggacc 1721010121118212DNA213人工序列220
223用於分析HLA-Cw基因型(HLA-Cw 12)的探針400101gcggacaagg cggctcag1821010221116212DNA213人工序列220
223用於分析HLA-Cw基因型(HLA-Cw 13)的探針400102ggagcagtgg agagcc 1621010321115212DNA213人工序列220
223用於分析HLA-Cw基因型(HLA-Cw 14)的探針400103gagggcgagt gcgtg 1521010421116212DNA213人工序列220
223用於分析HLA-Cw基因型(HLA-Cw 15)的探針400104gctccgcgga tacctg 16
21010521122212DNA213人工序列220
223用於分析HLA-Cw基因型(HLA-Cw16)的探針400105gatacctgaa gaatgggaag ga 2221010621120212DNA213人工序列220
223用於分析HLA-Cw基因型(HLA-Cw 17)的探針400106aggtatttcg acaccgccgt 2021010721118212DNA213人工序列220
223用於分析HLA-Cw基因型(HLA-Cw 18)的探針400107cggcccgtac ggcggagc1821010821121212DNA213人工序列220
223用於分析HLA-Cw基因型(HLA-Cw 19)的探針400108agacacagaa ctacaagcgc c2121010921119212DNA213人工序列
220
223用於分析HLA-Cw基因型(HLA-Cw 20)的探針400109cagaggatgt ttggctgcg 1921011021121212DNA213人工序列220
223用於分析HLA-Cw基因型(HLA-Cw 21)的探針400110gtctcacatc ctccagagga t2121011121118212DNA213人工序列220
223用於分析HLA-Cw基因型(HLA-Cw 22)的探針400111tggaccgcgg cggacacg 1821011221121212DNA213人工序列220
223用於分析HLA-Cw基因型(HLA-Cw 23)的探針400112caaggattac atcgccctga a 2121011321119212DNA213人工序列220
223用於分析HLA-DR基因型(HLA-DRN 01)的探針400113
gacagcgacg tgggggagt 1921011421116212DNA213人工序列220
223用於分析HLA-DR基因型(HLA-DRN 02)的探針400114ctggagcagg cgcggg 1621011521119212DNA213人工序列220
223HLA-DRN 03探針400115cggtatctgc acagaggca 1921011621119212DNA213人工序列220
223HLA-DRN 04探針400116ggcctgatga ggagtactg 1921011721117212DNA213人工序列220
223HLA-DRN 05探針400117acagcgacca gggggag 1721011821121
212DNA213人工序列220
223HLA-DRN 06探針400118caggataagt atgagtgtca t2121011921129212DNA213人工序列220
223HLA-DRN 07探針400119gttgctggaa agatgcatct ataaccaag2921012021121212DNA213人工序列220
223HLA-DRN 08探針400120ggaaagacgc gtccataacc a2121012121119212DNA213人工序列220
223HLA-DRN 09探針400121aggaggagct cctgcgctt 1921012221123212DNA213人工序列220
223HLA-DRN 10探針
400122tataaccaag aggagtacgt gcg 2321012321121212DNA213人工序列220
223HLA-DRN 11探針400123ggagcgagtg tggaacctga t2121012421119212DNA213人工序列220
223HLA-DRN 12探針400124tttcttcaac gggacggag 1921012521123212DNA213人工序列220
223HLA-DRN 13探針400125tggagtactc tacgkstgag tgt 2321012621116212DNA213人工序列220
223HLA-DRN 14探針400126ggaagacgag cgggcc 16
21012721117212DNA213人工序列220
223HLA-DRN 15探針400127cctgctgcgg agcactg 1721012821121212DNA213人工序列220
223HLA-DRN 16探針400128ggtggacaat tactgcagac a2121012921123212DNA213人工序列220
223HLA-DRN 17探針400129tggagcaggt taaacatgag tgt 2321013021115212DNA213人工序列220
223HLA-DRN 18探針400130ggccgggtgg acaac 1521013121119212DNA213人工序列
220
223HLA-DRN 19探針400131ccgaggtgga cacctattg 1921013221119212DNA213人工序列220
223HLA-DRN 20探針400132aaccaggagg agaacgtgc 1921013321121212DNA213人工序列220
223HLA-DRN 21探針400133gcagcctaag agggagtgtc a2121013421125212DNA213人工序列220
223HLA-DRN 22探針400134tcctggaaag actcttctat aacca2521013521115212DNA213人工序列220
223HLA-DRN 23探針
400135cgggccctgg tggac 1521013621125212DNA213人工序列220
223HLA-DRN 24探針400136gacagatact tccataacca ggagg2521013721121212DNA213人工序列220
223HLA-DRS 08探針400137cataaccagg aggagttcgt g2121013821119212DNA213人工序列220
223HLA-DRS 12探針400138cagaaggacc tcctggagc 1921013921116212DNA213人工序列220
223HLA-DRS 13探針400139cctggaagac aggcgc 16210140
21121212DNA213人工序列220
223HLA-DRS 15探針400140cagaaggaca tcctggaaga c2121014121125212DNA213人工序列220
223HLA-A外顯子2正義引物400141aaaccgcctc tgyggggaga agcaa2521014221123212DNA213人工序列220
223HLA-A外顯子2反義引物400142gatctcggac ccggagactg tgg 2321014321121212DNA213人工序列220
223HLA-A外顯子3正義引物400143tcsgggccag gttctcacac c2121014421125212DNA213人工序列220
223HLA-A外顯子3反義引物400144gtgttggtcc caattgtctc ccctc2521014521120212DNA213人工序列220
223HLA-B外顯子2正義引物400145gctcccactc catgaggtat 2021014621121212DNA213人工序列220
223HLA-B外顯子2反義引物400146taracgcgcc tgggsctctc g2121014721122212DNA213人工序列220
223HLA-B外顯子3正義引物400147tacccggttt cattttcagt tg 2221014821124212DNA213人工序列220
223HLA-B外顯子3反義引物400148attctccatt caasggaggg cgac 24
21014921121212DNA213人工序列220
223HLA-Cw外顯子2正義引物400149ctcccactcc atgargtatt t2121015021121212DNA213人工序列220
223HLA-Cw外顯子2反義引物400150taaaggygac tggggctctc t2121015121124212DNA213人工序列220
223HLA-Cw外顯子3正義引物400151tttacccggt ttcattttca gttt 2421015221123212DNA213人工序列220
223HLA-Cw外顯子3反義引物400152gctgatccca ttttcctccc ctc 2321015321120212DNA
213人工序列220
223HLA-DRB 1/3/4/5外顯子2正義引物400153tccccacagc acgtttcttg 2021015421120212DNA213人工序列220
223HLA-DRB1/3/4/5外顯子2反義引物400154ccgctgcact gtgaagctct 2021015521120212DNA213人工序列220
223HLA-DRB1外顯子2正義-1引物400155tcctgtggca gcctaagagg 2021015621127212DNA213人工序列220
223HLA-DRB1外顯子2正義-2引物400156agcacgtttc ttggagtact ctacgtc 2721015721126212DNA213人工序列220
223HLA-DRB1外顯子2正義-3引物
400157gcacgtttct tggagtactc tacggg 2權利要求
1.一種含有多個用於分析HLA基因型的寡聚核苷酸探針的組合物，其特徵為，所述組合物包括至少一個選自由以下探針組構成的組的探針組由至少兩個用於分析HLA-A基因型的探針所組成的探針組，其探針選自由SEQID NO1-41所組成的組；由至少兩個用於分析HLA-B基因型的探針組成的探針組，其探針選自由SEQ ID NO42-89表示的鹼基序列組成的組；由至少兩個用於分析HLA-Cw基因型的探針組成的探針組，其探針選自由SEQ IDNO90-112表示的鹼基序列組成的組；和由至少兩個用於分析HLA-DR基因型的探針組成的探針組，其探針選自SEQ ID NO113-140表示的鹼基序列組成的組。
2.一種測試用支持物，其包括根據權利要求1所述的探針組合物和支持物，其特徵為，所述探針組合物被固定在所述支持物上。
3.根據權利要求2所述的支持物，其中，所述支持物選自由濾膜、條帶、微球、晶片、玻片、多孔板、膜、光學纖維組成的組。
4.至少一個選自由SEQ ID NO141-157表示的用於分析HLA基因型的鹼基序列組成的組的引物，其中所述引物用於檢測根據權利要求1或2所述的探針和靶基因之間的雜交反應。
5.根據權利要求4所述的引物，其中，選自由SEQ ID NO142、144、146、148、150、152和154表示的鹼基序列組成的組的反義引物與生物素結合或與若丹明結合。
6.根據權利要求5所述的引物，其中，結合生物素的反義引物與鏈黴抗生物素蛋白-花青苷相互作用。
7.一種分析HLA基因型的方法，其包括以下步驟(a)從血液、細胞和組織中製備HLA DNA；(b)使用製備的DNA進行不對稱PCR；(c)將根據權利要求1或2所述的探針與不對稱PCR產物結合；(d)鑑定所得到的結合；(e)通過使用HLA分型程序分析被鑑定的結合。
全文摘要
本發明涉及用於分析HLA基因型的寡聚核苷酸組合物及其檢測方法。
文檔編號C12Q1/68GK1954084SQ200480042529
公開日2007年4月25日 申請日期2004年6月23日 優先權日2004年3月24日
發明者樸榮石, 黃丞鏞, 金銀夏, 金容賢, 姜鎮錫, 尹賢圭, 樸銀, 吳文珠, 李炅律 申請人:博康有限公司, 吉諾切克有限公司