氨醯基－tRNA合成酶的組合物及其用途的製作方法

2023-06-22 10:01:51 3

專利名稱：氨醯基－tRNA合成酶的組合物及其用途的製作方法
技術領域：
本發明屬於轉譯生物化學領域。本發明涉及用於生產氨醯基-tRNA合成酶的組合 物的方法和氨醯基-tRNA合成酶的組合物及其用途。本發明也涉及使用所述氨醯基-tRNA合成酶和相關組合物在細胞中生產蛋白質的方法。
背景技術：
從細菌到人類的每種已知生物體的遺傳密碼編碼相同的20種常見胺基酸。相同的20種天然胺基酸的不同組合形成蛋白質，所述蛋白質實際上執行從光合作用到信號轉導和免疫反應的生命的所有複雜過程。為了研究和修飾蛋白質結構和功能，科學家已嘗試操縱蛋白質的遺傳密碼和胺基酸序列。然而，仍難以除去由遺傳密碼施加的約束，其使蛋白質受限於20種遺傳編碼的標準構造單元(building block)(硒代半胱氨酸(參見(例如)A. Bock 等人，(1991) , Molecular Microbiology 5:515-20)和卩比咯賴氨酸(參見(例如)G. Srinivasan 等人，(2002). Science 296:1459-62)為少有的例外)。對於除去所述約束已經取得了一些進展，儘管所述進展是有限的並且合理地控制蛋白質結構和功能的能力仍處於其初期。舉例而言，化學工作者已開發出合成和操縱小分子結構的方法和策略(參見(例如)E. J. Corey和X. -M. Cheng, The Logic ofChemical Synthesis (ffiIey~Interscience. New York, 1995))。全合成(參見(例如)B. Merrifield, (1986), Science232:341-7 (1986))和半合成方法(參見(例如)D. Y. Jackson 等人，(1994) Science266:243-7 ；和 P. E. Dawson 和 S. B. Kent, (2000), Annual Review ofBiochemistry69:923-60),已使合成肽和小蛋白質成為可能,但是所述方法對超過10千道爾頓(kDa)的蛋白質來說，具有有限的實用性。雖然突變方法是有效的，但是其受限於有限數量的結構變化。在許多情況下，已經有可能在整個蛋白質中競爭性地併入常見胺基酸的封閉結構類似物。參見(例如)，R. Furter, (1998), Protein Science 7:419-26 ；K. Kirshenbaum 等人，(2002), ChemBioChem 3:235-7 :和 V. Doring 等人,(2001), Science292:501-4。化學肽連接和天然化學連接描述於美國專利第6，184，344號、美國專利公開案第 2004/0138412 號、美國專利公開案第 2003/0208046 號、WO 02/098902 和 WO 03/042235中，所述專利是以引用的方式併入本文中。Lu等人在Mol Cell. 2001年10月；8(4) :759-69中描述了一種方法，其中蛋白質與含有非天然胺基酸的合成肽化學連接(經表達蛋白質連接)。早期的工作證明大腸桿菌(E. coli)的轉譯機器將容納結構上與常見20種胺基酸相似的胺基酸。參見，Hortin, G.和 Boime, I. (1983)Methods Enzymol. 96:777-784。所述工作另外通過放寬內源性大腸桿菌合成酶的特異性，以便其活化非天然胺基酸以及其同源天然胺基酸而擴展。此外，展示了編輯域中的突變也可用以擴展內源性合成酶的底物範疇。參見，Doring，V.等人，(2001) Science 292:501-504。然而，所述策略都受限於重新編碼遺傳密碼而不是擴展遺傳密碼，並且導致常見20種胺基酸中之一者經非天然胺基酸不同程度地取代。新近，展示了非天然胺基酸可通過將經化學氨基醯化的正交琥珀抑制基因tRNA添加到活體外轉錄/轉譯反應中，而得以 在活體外部位特異性地併入蛋白質中。參見(例如)，Noren, C. J.等人，(1989) Science 244:182-188; Bain, J. D.等人，(1989) T. Am.Chem. Soc. 111: 8013-8014 Dougherty, D. A. (2000) Curr. Opin. Chem. Biol. 4, 645-652 Cornish, V. ff.等人，(1995) Angew. Chem. , Int. Ed. 34:621-633 T. A. Ellman 等人，(1992), Science255:197-200 ;和 D. Mendel 等人，(1995), Annual Review of Biophysicsand Biomolecular Structure 24:435-462。所述研究展不，核糖體和轉譯因子可與大量非天然胺基酸，甚至是具有異常結構的所述非天然胺基酸相容。不幸地，tRNA的化學氨基醯化是困難的，並且所述工藝的化學計量性質嚴重地限制可產生的蛋白質的量。已經將非天然胺基酸微量注射到細胞中。舉例而言，非天然胺基酸通過微量注射經化學錯誤醯化的嗜熱四膜蟲(Tetrahymena thermophila) tRNA (例如，M. E. Saks等人，(1996), An engineered Tetrahymena tRNA Gln for in vivo incorporationof unnatural amino acids into proteins by nonsense suppression,J.Biol.Chem. 271:23169-23175)和相關mRNA而引入爪蟾卵母細胞(Xenopus oocyte)中的菸鹼酸乙酸膽喊受體中(例如，M. W. Nowak 等人,(1998), In vivo incorporation of unnaturalamino acids into ion channels in Xenopus oocyte expression system. MethodEnzymoI. 293:504-529)。又參見，D.A. Dougherty(2000)，Unnatural amino acids asprobes of protein structure and function, Curr. Opin. Chem. Biol. 4:645-652 和M. ff. Nowak, P. C. Kearney, J. R. Sampson, M. E. Saks, C. G. Labarca, S. K. Silverman, ff.G. Zhong, J. Thorson, J. N. Abelson, N. Davidson, P. G. Schultz, D. A. Dougherty 和 H. A. Lester. Science. 268:439(1995) 0爪蟾卵母細胞與以下活體外製得的兩種RNA物質共同注射編碼在所關注的胺基酸位置處具有UAG終止密碼子的目標蛋白質的mRNA，和經所要的非天然胺基酸氨基醯化的琥珀抑制基因tRNA。然後，卵母細胞的轉譯機器在規定的位置上通過UAG將非天然胺基酸插入。不幸地，所述方法受限於在細胞中可微量注射的蛋白質，並且因為相關的tRNA經活體外化學醯化並且不能再醯化，所以蛋白質的產量極低。為了克服所述限制，將例如正交tRNA、正交氨醯基-tRNA合成酶及其對的新穎組分添加到原核生物大腸桿菌(Escherichia coli, E. coli)(參見(例如)L. Wang等人，(2001), Science 292:498-500)和真核生物釀酒酵母(Sacchromyces cerevisiae,
S.cerevisiae)(例如，J. Chin 等人,Science 301:964-7 (2003))的蛋白質生物合成機器中，其已使非遺傳編碼的胺基酸能活體內併入蛋白質中。使用所述方法，響應(例如)琥珀密碼子(TAG)已經將具有新穎化學、物理或生物性質，包括光親和標記和可光致異構胺基酸、光致交聯胺基酸(參見(例如)，Chin, J. ff.等人(2002) Proc. Natl. Acad. ScLU. S. A. 99:11020-11024 ；和 Chin, J. W.等人(2002) T. Am. Chem. Soc. 124:9026-9027)、酮胺基酸(參見(例如)，Wang, L.等人，(2003) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100:56-61 和Zhang, Z.等人，Biochem. 42(22) :6735-6746 (2003))、含有重原子的胺基酸和經糖基化的胺基酸的大量新穎胺基酸有效地且以高保真度併入大腸桿菌和酵母中的蛋白質中。參見(例如)，J. W. Chin 和 P. G. Schultz, (2002). ChemBioChem 3(11) :1135-1137 ;和 L. Wang 和P. G. Schultz, (2002) Chem. Comm. 1:1-11。已經報導了若干其他的正交對。從釀酒酵母tRNA和合成酶得到的穀氨醯胺醯基(參見(例如)，Liu，D.R.和 Schultz. P. G. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci.U. S. A. ,96:4780-4785)、天冬氨醯基(參見(例如)，Pastrnak, M.等人，(2000) Helv.Chim. Acta 83:2277-2286)和酪氨醯基(參見(例如)，Ohno, S.等人，(1998) T. Biochem.(Tokyo. Tpn. ) 124:1065-1068 和 Kowal, A. K.等人，(2001) Proc. Natl. Acad. Sci.U- S. A. 98:2268-2273)系統已經被描述用於將非天然胺基酸潛在地併入大腸桿菌中。從大腸桿菌穀氨醯胺醯基(參見(例如)，Kowal，A.K.等人，(2001)ProoNatLAcad Sci.U. S. A. 98:2268-2273)和酪氨醯基(參見(例如)，Edwards, H.和 Schi_el, P. (1990)Mol.Cell. Biol. 10:1633-1641)合成酶得到的系統已經被描述適用於釀酒酵母。大腸桿菌酪氨醯基系統已經用於將3-碘-L-酪氨酸活體內併入哺乳動物細胞中。參見，Sakamoto，K.等人，(2002)Nucleic Acids Res. 30:4692-4699。通常，所述系統利用琥珀終止密碼子。為進一步擴展遺傳密碼，需要開發生物合成機器的改善和/或其他組分，例如氨醯基-tRNA合成酶。如基於以下揭示案的評述將明顯可見，本發明滿足所述的和其他的需要。

發明內容
為了擴展遺傳密碼，本發明提供正交氨醯基-tRNA合成酶的組合物和生產正交氨醯基-tRNA合成酶的方法。本發明的氨醯基-tRNA合成酶用非天然編碼的胺基酸氨基醯化tRNA。這些轉譯組分可用來響應由tRNA識別出的選擇密碼子(selector codon)而將所選胺基酸併入生長多肽鏈中的特定位置中(在核酸轉譯期間))。在細胞中用所選胺基酸在規定位置生產蛋白質的方法也是本發明的特徵。舉例而言，方法包括在適當培養基中使細胞生長，其中所述細胞包含包括至少一個選擇密碼子並且編碼蛋白質的核酸；和提供所選胺基酸。細胞另外包含在細胞中起作用並且識別選擇密碼子的正交tRNA (0-tRNA);和用所選胺基酸優先氨基醯化0-tRNA的正交氨醯基-tRNA合成酶(0-RS)。通常，0-tRNA包含在同源合成酶的存在下抑制活性。由所述方法生產的蛋白質也是本發明的特徵。


圖I-展示具有TWC莖突變部位的J17 tRNA的四葉式交叉(cloverleaf)結構。圖2-展示使用J17或J17突變體(F12、F13、F14)和E9RS的人類生長激素的琥珀突變的抑制。各個樣品總細胞溶胞產物通過SDS PAGE來分析。圖3-展示在不同細胞系中，使用F13和E9 RS的人類生長激素的琥珀突變的抑制。具體實施例方式定義在詳細地描述本發明之前，應了解，本發明不受限於具體的生物系統，本發明當然可以變化。也應了解，本文中使用的術語僅是為了描述具體的實施例，並且不希望限制本發明的範疇，本發明的範疇將僅由附加權利要求書來限制。如本文中和附加權利要求書中所使用，除非上下文另外清楚地規定，否則單數形式「一」和「所述」包括複數個參考物。因此，舉例而言，提及「一種細胞」包括兩種或兩種以上細胞的組合併且包括所屬領域的技術人員已知的其等價物，等等。提及「細菌」包括細菌的混合物諸如此類。除非在本文中和以下說明書的剩餘部分中規定，否則本文中使用的所有技術和科學術語具有與本發明所屬領域的技術人員通常所了解的相同的含義。本文中提及的所有公開案和專利是以引用的方式併入本文中，以達到描述和揭示 (例如)公開案中描述的，可能與當前描述的發明聯繫使用的構築體和方法的目的。所提供的本文中討論的公開案僅為在本專利申請案的申請日之前的其揭示案。在此並非解釋為允許本發明者由於先前發明或由於任何其他原因而比所述揭示案提前得到授權。同源(Homologous):蛋白質和/或蛋白質序列，當其天然地或人工地從共同的原始蛋白質或蛋白質序列得到時，是「同源的」。同樣地，核酸和/或核酸序列，當其天然地或人工地從共同的原始核酸或核酸序列得到時，是同源的。舉例而言，任何天然存在的核酸可通過任何可用的突變方法修飾以包括一個或一個以上選擇密碼子。當被表達時，所述經突變的核酸編碼包含一種或一種以上所選胺基酸(例如非天然胺基酸)的多肽。當然，突變處理可另外改變一個或一個以上標準密碼子，進而也改變所得突變蛋白質中的一種或一種以上標準胺基酸。所述一種或一種以上標準胺基酸可以變成非天然胺基酸或天然胺基酸。同源性通常從兩種或兩種以上的核酸或蛋白質(或其序列)之間的序列相似性來推斷。適用於建立同源性的序列之間相似性的精確百分比隨所討論的核酸和蛋白質而變化，但僅僅25%的序列相似性通常用以建立同源性。例如30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99% 或 99% 以上的高水平的序列相似性也可用以建立同源性。用於確定序列相似性百分比的方法(例如，使用預設參數的BLASTP和BLASTN)描述於本文中並且通常可用。正交^如本文中所使用，術語「正交」指的是通過所關注的系統(例如轉譯系統，例如細胞)以降低的效率使用的分子(例如正交tRNA (0-tRNA)和/或正交氨醯基tRNA合成酶(0-RS))。正交指的是正交tRNA和/或正交RS在所關注的轉譯系統中不能起作用或效率降低，例如小於20%有效、小於10%有效、小於5%有效或例如小於1%有效。舉例而言，當與內源性tRNA通過內源性RS的氨基醯化相比較時，所關注的轉譯系統中的正交tRNA是通過所關注的轉譯系統的任何內源性RS以降低或甚至為零的效率氨基醯化。在另一實例中，當與內源性tRNA通過內源性RS的氨基醯化相比較時，正交RS以降低或甚至為零的效率氨基醯化所關注的轉譯系統中的任何內源性tRNA。可將與第一正交分子一同起作用的第二正交分子引入細胞中。舉例而言，正交tRNA/RS對包括所引入的互補組分，所述互補組分在細胞中以某一效率(例如，約50%效率、約60%效率、約70%效率、約75%效率、約80%效率、約85%效率、約90%效率、約95%效率或約99%或99%以上的效率)一同對對應的tRNA/RS內源性對的組分起作用。「正交性的改善」指的是與起始物質或天然存在的tRNA或RS相比較正交性增強。同源物術語「同源物」指的是一同起作用的組分，例如tRNA和氨醯基-tRNA合成酶。所述組分也可稱為互補組分。優先氨基醯化術語「優先氨基醯化」指的是與O-RS氨基醯化天然存在的tRNA或用以產生0-tRNA的起始物質的效率相比較，O-RS用例如非天然胺基酸的所選胺基酸氨基醯化0-tRNA的效率，例如約70%有效、約75%有效、約80%有效、約85%有效、約90%有效、約95%有效或約99%或99%以上有效。因而，非天然胺基酸以高保真度，(例如)以對給定選擇密碼子來說大於約70%的效率、對給定選擇密碼子來說大於約75%的效率、對給定選擇密碼子來說大於約80%的效率、對給定選擇密碼子來說大於約85%的效率、對給定選擇密碼子來說大於約90%的效率、對給定選擇密碼子來說大於約95%的效率或對給定選擇密碼子來說大於約99%的效率，併入生長多肽鏈中。詵擇密碼子術語「選擇密碼子」指的是在轉譯過程中通過0-tRNA識別並且不通 過內源性tRNA識別的密碼子。0-tRNA反密碼子環識別mRNA上的選擇密碼子並且在多肽中的所述部位處併入其胺基酸，例如所選胺基酸，諸如非天然胺基酸。選擇密碼子可包括(但不限於)(例如)無義密碼子，諸如包括(但不限於)琥珀密碼子、赭石密碼子和蛋白石密碼子的終止密碼子；4或4個以上鹼基密碼子；稀有密碼子；由天然或非天然鹼基對得到的密碼子和/或類似物。對給定系統來說，選擇密碼子也可包括天然3鹼基密碼子之一，其中內源性系統不使用(或很少使用)所述天然3鹼基密碼子。舉例而言，內源性系統包括缺乏識別天然3鹼基密碼子的tRNA的系統和/或其中天然3鹼基密碼子為稀有密碼子的系統。抑制基因tRNA :抑制基因tRNA是在給定轉譯系統中，(例如)通過提供響應選擇密碼子而將胺基酸併入多肽鏈中的機制，來改變信使RNA (mRNA)的讀取的tRNA。舉例而言，抑制基因tRNA可讀遍包括(但不限於)終止密碼子、4鹼基密碼子或稀有密碼子的密碼子。抑制活件術語「抑制活件」指的是例如抑制基因tRNA的tRNA讀遍選擇密碼子的能力。活性可表示為當與對照物(例如缺乏同源物合成酶)相比時，所觀察到的活性的百分比。轉譯系統術語「轉譯系統」指的是將天然存在的胺基酸併入牛長多肽鏈(蛋白質)中所必需的組分。轉譯系統的組分可包括(例如)核糖體、tRNA、合成酶、mRNA,諸如此類。可將本發明的組分添加到活體外或活體內轉譯系統中。轉譯系統的實例包括(但不限於)非真核細胞，例如細菌(諸如大腸桿菌)；真核細胞，例如酵母細胞、哺乳動物細胞、植物細胞、藻類細胞、真菌細胞、昆蟲細胞；無細胞的轉譯系統，例如細胞溶胞產物；和/或類似物。轉譯系統可以是細胞的或無細胞的，並且可以是原核的或真核的。細胞轉譯系統包括(但不限於)全細胞製劑，諸如透性化細胞或細胞培養物，其中所要的核酸序列可轉錄成mRNA並且所述mRNA被轉譯。無細胞轉譯系統為市售的並且許多不同類型和系統是熟知的。無細胞系統的實例包括(但不限於)原核溶胞產物，諸如大腸桿菌溶胞產物；和真核溶胞產物，諸如小麥胚芽提取物、昆蟲細胞溶胞產物、兔網織紅細胞溶胞產物、兔卵母細胞溶胞產物和人類細胞溶胞產物。當所得蛋白質經糖基化、磷酸化或另外修飾時，真核提取物或溶胞產物可為優選的，因為許多所述修飾僅在真核系統中為可能的。一些所述提取物和溶胞產物為市售的(Promega;Madison, Wis. ; Stratagene ; La Jolla, Calif ；Amersham; Arlington Heights, 111. ;GIBCO/BRL;Grand Island, N. Y.)。諸如含有微粒體膜的犬胰腺提取物的膜狀提取物也可用，其適用於轉譯分泌蛋白。也可以使用重構轉譯系統。經純化的轉譯因子的混合物以及由諸如起始因子-I(IF-l)、IF-2、IF-3 (a或￠)、延伸因子T (EF-Tu)或末端因子的經純化的轉譯因子補充的溶胞產物的組合或溶胞產物也已經成功用以將mRNA轉譯成蛋白質。無細胞系統也可以是偶聯的轉錄/轉譯系統，其中將DNA引入系統中，轉錄成mRNA並且將mRNA如CurrentProtocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel 等編，Wiley Interscience, 1993)中所述來轉譯，該文獻在此特別以引用的方式併入。在真核轉錄系統中轉錄的RNA可以呈異核RNA ChnRNA)或5』 -末端帽(7-甲基鳥嘌呤核苷)和3』 -末端多聚A有尾成熟mRNA形式，其可為某些轉譯系統中的優點。舉例而言，加帽mRNA以高效率在網織紅細胞溶胞產物系統中被轉譯。所選胺基酸術語「所選胺基酸」指的是任何所要的天然存在的胺基酸或非天然胺基酸。如本文中所使用，術語「非天然胺基酸」或「非天然編碼的胺基酸」指的是任何胺基酸、經修飾的胺基酸和/或不為20種常見天然存在的胺基酸之一或硒代半胱氨酸或吡咯賴氨酸的胺基酸類似物。可以與術語「非天然編碼的胺基酸」和「非天然胺基酸」同義地使用的其他術語為「非天然的胺基酸」、「非天然存在的胺基酸」和其各種用連字號連接的和未用連字號連接的型式。術語「非天然編碼的胺基酸」也包括(但不限於)通過修飾(例如，後轉譯修飾)天然編碼的胺基酸(包括但不限於20種常見胺基酸或吡咯賴氨酸和硒代半胱氨酸)產生的胺基酸，但不為通過轉譯複合物而將其本身天然地併入生長多肽鏈的胺基酸。所述非天然存在的胺基酸的實例包括(但不限於)N-乙醯氨基葡萄糖基-L-絲氨酸、N-乙醯氨基葡萄糖基-L-蘇氨酸和0-磷酸化酪氨酸。由...得到如本文中所使用，術語「由…得到」指的是從規定分子或生物體分離的組分或使用來自規定分子或生物體信息製得的組分。IH性選擇或篩選標記物如本文中所使用，術語「 IH性選擇或篩選標記物」指的是當存在時(例如)經表達、經活化等等時使得具有正性選擇標記物的細胞從不具有正性選擇標記物的細胞鑑別出的標記物。負性選擇或篩選標記物如本文中所使用，術語「負性選擇或篩選標記物」指的是 當存在時(例如)經表達、經活化等等時容許鑑別出不具有所要性質的細胞(例如，當與具有所要性質的細胞相比時)的標記物。報告基因(Reporter):如本文中所使用，術語「報告基因」指的是可用以選擇所關注系統的目標組分的組分。舉例而言，報告基因可包括蛋白質，例如給與抗生素抗性或敏感性的酶(包括(但不限於)￠-內醯胺酶、氯黴素乙醯轉移酶(CAT)，諸如此類)、螢光篩選標記物(包括(但不限於)綠色螢光蛋白質(例如GFP )、YFP、EGFP、RFP )、發光標記物(包括(但不限於)螢火蟲螢光素酶蛋白質)、基於親和力的篩選標記物；或正性或負性可選擇標記物基因，諸如 lacZ、3 -gal/lacZ ( ^ -半乳糖苷酶)、ADH (醇脫氫酶)、his3、ura3、leu2、lys2 等等。真核牛物如本文中所使用，術語「真核牛物」指的是屬於真核種系發牛域(phylogenetic domain Eucarya)的生物體,諸如動物(包括(但不限於)哺乳動物、昆蟲、爬蟲、鳥等)，纖毛蟲，植物(包括(但不限於)單子葉植物、雙子葉植物、藻類等)，真菌，酵母，鞭毛蟲，微粒子蟲目，原生生物等。非真核牛物如本文中所使用，術語「非真核牛物」指的是非真核牛物體。舉例而言，非真核生物體可屬於真細菌類(Eubacteria)(包括(但不限於)大腸桿菌、嗜熱細菌(Thermus thermophilics)、嗜熱月旨肪芽抱桿菌(Bacillus stearothermophilus)、突光極毛桿菌(Pseudomonas fluorescens)、綠胺桿菌(Pseudomonas aeruginosa)、惡息極毛桿菌(Pseudomonas putida)等)種系發生域，或原生類(Archaea)(例如，詹氏甲燒球菌(Methanococcus jannaschii)、橫川病毒(Methanobacterium thermoautotrophicum)、諸如富饒鹽菌(Haloferax volcanii)和鹽桿菌種(Halobacterium species) NRC-I 的鹽桿菌屬(Halobacterium)、閃爍古生球菌(Archaeoglobus fulgidus)、火球菌(Pyrococcusfuriosus)、掘越氏熱球菌(Pyrococcus horikoshii)、嗜熱菌敏捷氣熱菌(Aeuropyrumpernix)等)種系發生域。 保守變體術語「保守變體」指的是例如保守變體0-tRNA或保守變體O-RS的轉譯組分，所述轉譯組分如例如0-tRNA或O-RS的組分(保守變體以其為基礎)一樣執行功能，但在序列中具有變化。舉例而言，儘管0-tRNA和保守變體0-tRNA不具有相同序列，但是O-RS將用例如非天然胺基酸的所選胺基酸氨基醯化互補的0-tRNA或保守變體0-tRNA。同樣地，儘管O-RS和保守變體O-RS不具有相同序列，但是tRNA將通過互補的O-RS或保守變體0-RS，經例如非天然胺基酸的所選胺基酸氨基醯化。只要保守變體與對應的0-tRNA或O-RS互補，保守變體就可在序列中具有(例如)I種變化、2種變化、3種變化、4種變化或5種或5種以上的變化。選擇或篩選劑如本文中所使用，術語「選擇或篩選劑」指的是當存在時，允許從群體中選擇/篩選某些組分的試劑。舉例而言，選擇或篩選劑包括(但不限於)(例如)營養素、抗生素、光的波長、抗體、經表達的多核苷酸等等。選擇劑可(例如)因濃度、強度等而變化。術語「未有效地識別出」指的是來自一種生物體的RS氨基醯化0-tRNA的例如小於約10%、小於約5%或小於約1%的效率。
具體實施例方式適於製造包括一種或一種以上例如非天然胺基酸的所選胺基酸的蛋白質的轉譯系統，描述於標題為 「METHODS AND COMPOSITION FOR THE PRODUCTION OF ORTHOGONALtRNA-AMINOACYL tRNA SYNTHETASE PAIRS」 的美國專利申請案 10/126，931 和標題為 「INVIVO INCORPORATION OF UNNATURAL AMINO ACIDS」 的美國專利申請案 10/126, 927 中。另夕卜，參見標題為「EXPANDING THE EUKARYOTIC GENETIC CODE^USSN 10/825,867。每一所述申請案都以引用的方式全部併入本文中。所述轉譯系統通常包含，包括正交tRNA( 0-tRNA)、正交氨醯基tRNA合成酶(O-RS)和例如非天然胺基酸的所選胺基酸的細胞，其中O-RS用所選胺基酸氨基醯化0-tRNA。本發明的正交對包含0-tRNA (例如抑制基因tRNA、移碼tRNA等等)和0-RS。0-tRNA識別第一選擇密碼子並且在同源合成酶的存在下響應選擇密碼子而具有抑制活性。細胞使用所述組分將所選胺基酸併入生長多肽鏈中。舉例而言，包含編碼所關注的多肽的多核苷酸的核酸也可存在，其中多核苷酸包含通過0-tRNA識別出的選擇密碼子。轉譯系統也可為活體外系統。本發明的RS分子適用於包括在轉譯中利用核糖體的系統中的任何轉譯系統。轉譯系統也可以是無細胞(活體外)轉譯系統。在可包括mRNA作為模板(活體外轉譯)或者DNA作為模板(經組合的活體外轉錄和轉譯)的所述系統中，活體外合成通過核糖體引導。已經對開發無細胞蛋白質表達系統進行了相當大的努力。參見(例如)，Kim, D.M.和 J. R. Swartz, Biotechnology and Bioengineering, 74:309-316 (2001)；Kim, D. M.和 J. R. Swartz, Biotechnology Letters, 22, 1537-1542, (2000) ；Kim, D.M.和 J. R. Swartz, Biotechnology Progress, 16, 385-390，(2000) ；Kim, D. M.和J. R. Swartz, Biotechnology and Bioengineering, 66, 180-188，(1999)；和 Patnaik, R.和 J. R. Swartz, Biotechniques 24，862-868，(1998);美國專利第 6，337，191 號；美國專利公開案第2002/0081660號；W000/55353 ；W0 90/05785，所述文獻是以引用的方式併入本文中。可以應用的另一種方法包括mRNA-肽融合技術。參見(例如)，R. Roberts和 J. Szostak, Proc. Natl Acad. Sci. (USA) 94:12297-12302 (1997) ；A. Frankel 等人，Chemistry & Biology 10:1043-1050(2003)。在所述方法中，與嘌呤黴素連接的mRNA模板在核糖體上被轉譯成肽。如果已經修飾一個或一個以上tRNA分子，那麼也可將非天然胺基酸併入肽中。在已經閱讀末尾mRNA密碼子後，嘌呤黴素俘獲肽的C-末端。如果在活體外檢定中發現所得mRNA-肽結合物具有所關注的性質，那麼其同一性可容易地從mRNA序列展現。這樣，所屬領域的技術人員可以篩選包含一種或一種以上非天然編碼的胺基酸的多肽 的庫，以鑑別具有所要性質的多肽。近期，已經報導用經純化的組分的活體外核糖體轉譯允許合成經非天然編碼的胺基酸取代的肽。參見(例如)A. Forster等人，Proc. Natl Acad.Sci. (USA) 100:6353(2003)。在某些實施例中，包含本發明的RS的大腸桿菌細胞包括所述轉譯系統。舉例而言，本發明的大腸桿菌細胞包括正交tRNA(0-tRNA)，其中0-tRNA包含在同源合成酶存在下響應選擇密碼子的抑制活性；正交氨醯基-tRNA合成酶(O-RS);所選胺基酸；和包含編碼所關注的多肽的多核苷酸的核酸，其中多核苷酸包含由0-tRNA識別的選擇密碼子。本發明也提供在容許併入一種以上所選胺基酸的細胞中的多個0-tRNA/0-RS對。在某些實施例中，細胞可另外包括其他不同的0-tRNA/0-RS對和第二所選胺基酸，其中0-tRNA識別第二選擇密碼子並且O-RS用第二所選胺基酸優先氨基醯化0-tRNA。舉例而言，細胞可另外包含(例如)由詹氏甲烷球菌的酪氨醯基tRNA合成酶得到的琥珀抑制基因tRNA-氨醯基tRNA合成酶對。0-tRNA和/或O-RS可為天然存在的或可通過來自各種生物體的天然存在的tRNA和/或RS的突變而得到，例如所述突變產生tRNA的庫和/或RS的庫。舉例而言，一種生產正交tRNA/氨醯基-tRNA合成酶對的策略涉及將來自(例如)不同於宿主細胞的來源或多個來源的異源性tRNA/合成酶對引進宿主細胞中。異源性合成酶候選者的性質包括,(例如)其不裝填任何宿主細胞tRNA，並且異源性tRNA候選者的性質包括，(例如)其不通過任何宿主細胞合成酶而氨基醯化。另外，異源性tRNA與所有宿主細胞合成酶正交。用於產生正交對的第二種策略涉及產生從其篩選和/或選擇0-tRNA或O-RS的突變體庫。所述策略也可組合。在各種實施例中，0-tRNA和O-RS是由至少一種生物體得到。在另一個實施例中，0-tRNA是由來自第一生物體的天然存在的或經突變的天然存在的tRNA得到，並且O-RS是由來自第二生物體的天然存在的或經突變的天然存在的RS得到。在一個實施例中，第一生物體和第二生物體是不同的。舉例而言，正交對可以包括由橫川病毒得到的tRNA合成酶和由古細菌tRNA (例如來自鹽桿菌種NRC-1)得到的tRNA。或者，第一生物體和第二生物體是相同的。為補充信息，參見本文中標題為「來源和宿主生物體」的部分。在本發明的某些實施例中，本發明的O-RS包含如SEQ ID NO: 4中所述的多核苷酸序列或其互補多核苷酸序列或其保守變化，或通過如SEQ ID N0:4中所述的多核苷酸序列或其互補多核苷酸序列或其保守變化來編碼。在某些實施例中，O-RS包含如SEQ ID NO:5中所述的胺基酸序列。又參見本文中標題為「核酸和多肽序列和變體」的部分。tRNA (0-tRNA)正交tRNA (0-tRNA)介導將所選胺基酸(例如)活體內或活體外併入蛋白質中，所述蛋白質通過包含由0-tRNA識別的選擇密碼子的多核苷酸來編碼。0-tRNA可以通過包括(但不限於)化學氨基醯化或酶促氨基醯化的任何方法或技術用所要胺基酸來氨基醯化。經氨基醯化的0-tRNA可以被直接地添加到轉譯系統中。0-tRNA可以通過本發明的RS用所選胺基酸活體外或活體內氨基醯化。另外，RS可為0-RS。0-tRNA可直接地或通過提供編碼 0-tRNA或其部分的多核苷酸而提供到轉譯系統(例如，活體外轉譯組分或細胞)中。舉例而言，0-tRNA或其部分通過如SEQ ID N0:USEQ ID NO: 2,SEQ ID NO: 3中所述的多核苷酸序列或其互補多核苷酸序列或其保守變化來編碼。O-RS可直接地(例如SEQ ID N0:5或SEQID NO: 17或其保守變化)或通過提供編碼O-RS或其部分的多核苷酸而提供到轉譯系統(例如，活體外轉譯組分或細胞)中。舉例而言，O-RS或其部分通過如SEQ ID N0:4中所述的多核苷酸序列、編碼胺基酸序列SEQ ID NO: 17的多核苷酸序列或其互補多核苷酸序列或其保守變化來編碼。本發明的0-tRNA包含在同源合成酶存在下響應選擇密碼子的抑制活性。抑制活性可通過所屬領域中已知的多種檢定中的任何一種來測定。舉例而言，可使用￠-半乳糖苷酶報告基因檢定。(例如)在IacZ的肽VVLQRRDWEN的Leu_25經例如TAG、TGA、AGGA等密碼子的選擇密碼子或酪氨酸、絲氨酸、白氨酸等的有義密碼子(作為對照)置換時，使用在啟動子控制下表達IacZ基因的質粒的衍生物。將經衍生的IacZ質粒連同包含本發明的0-tRNA的質粒一起引入來自適當生物體(例如,其中可使用正交組分的生物體)的細胞中。也可引入同源合成酶(作為多肽或者當被表達時編碼同源合成酶的多核苷酸)。使細胞在培養基中生長到所要密度，例如生長到0D_為約0. 5，並且(例如)使用BetaFluor ^ -半乳糖苷酶檢定試劑盒(Novagen)執行P _半乳糖苷酶檢定。抑制百分比是按樣本相對於例如從經衍生的IacZ構築體觀察到的值的可比較對照物的活性的百分比來計算，其中構築體在所要位置具有對應的有義密碼子而不是選擇密碼子。適用於本發明的0-tRNA的實例是揭示於美國專利申請案10/126，931、10/126，927和10/825，867中的0-tRNA分子的任何一種分子。在tRNA分子中，胸苷嘧啶(T)經尿嘧啶(U)置換。另外，可存在對鹼基的其他修飾。本發明也包括0-tRNA的保守變化。舉例而言，0-tRNA的保守變化包括如0-tRNA —樣起作用並且維持tRNA L-形結構，但不具有相同序列(並且不同於野生型tRNA分子)的分子。又參見本文中標題為「核酸和多肽序列和變體」的部分。包含0-tRNA的組合物可另外包括正交氨醯基-tRNA合成酶(0-RS)，其中O-RS用所選胺基酸(例如非天然胺基酸)優先氨基醯化0-tRNA。在某些實施例中，包括0-tRNA的組合物可另外包括轉譯系統(例如，活體外或活體內轉譯系統)。包含編碼所關注的多肽的多核苷酸的核酸也可存在於細胞或其他轉譯系統中，其中所述多核苷酸包含一個或一個以上由0-tRNA識別的選擇密碼子，或所述選擇密碼子的一個或一個以上的組合。又參見，本文中標題為「正交氨醯基-tRNA合成酶(0-RS)」的部分。生產例如0-tRNA的正交tRNA (0-tRNA)的方法也是本發明的特徵。通過所述方法生產的例如0-tRNA的tRNA也是本發明的特徵。生產正交tRNA的方法包括使tRNA的集合中的每一 tRNA的反密碼子環突變以容許識別選擇密碼子(例如，琥珀密碼子、蛋白石密碼子、4鹼基密碼子等)，進而提供多個可能的0-tRNA ;且分析多個可能的0-tRNA的成員的二級結構以鑑別二級結構中的非規範鹼基對；且視需要使非規範鹼基對突變(例如，使非規範鹼基對突變成規範鹼基對)。非規範鹼基對可位於二級結構的莖區。0-tRNA可以具有一種或一種以上特徵或活性的改善，諸如與例如多個tRNA序列的起始物質相比，所要生物體的正交性的改善，同時保持其對所要RS的親和力。或者，0-tRNA可以通過使已知tRNA突變來發展以調節其與一種或一種以上影 響轉譯或為轉譯機器的組分的分子的相互作用或對所述分子的結合親和力。所述組分包括(但不限於)延伸因子。細菌延伸因子EF-Tu在蛋白質合成的延伸步驟中起關鍵作用。在tRNA通過tRNA合成酶氨基醯化後，EF-Tu結合經氨基醯化的tRNA並且將其帶到核糖體的A部位。由於EF-Tu與經氨基醯化的tRNA之間的結合，經裝填的胺基酸與tRNA之間的酯鍵受自發水解作用的保護。Stortchevoi等人研究了在TWC莖中的大腸桿菌起始tRNA 61 U50:G64擺動鹼基對的突變體，因為發現所述鹼基對為阻斷延伸中的tRNA活性的第二負性決定子，估計可能由於EF-Tu. GTP與經氨基醯化的tRNA之間減弱的相互作用(JBC 2003 278(20) : 17672-17679)。同樣，LaRiviere 等人在 Science 2001 年 10 月 5日；294 (5540) :165-8中描述了胺基酸和tRNA體對與EF-Tu的總結合親和力的熱力學貢獻。他們指出，tRNA體和胺基酸的貢獻彼此獨立並且當tRNA經正確醯化時，其相互補充。對EF-Tu. GTP與經非天然胺基酸氨基醯化的tRNA之間相互作用的改變可以影響將tRNA加載到核糖體的A部位的效率。可能的突變部位也可以通過分析tRNA與諸如EF-Tu的轉譯機器的其他組分之間的複合體的晶體結構而發現。舉例而言，Nissen等人已指出，EF-Tu.GTP與酵母苯丙氨醯基-轉移RNA (Phe-tRNA)的TWC莖的磷酸酯骨架直接結合(Science1995 270(5241):1464-1472)。所述方法視需要包括分析tRNA和/或氨醯基-tRNA合成酶的序列同源性，以確定似乎對特定生物體來說為正交的0-tRNA、0-RS和/或其對的可能候選者。可使用所屬領域中已知的和本文中描述的電腦程式進行分析。在一個實例中，為選擇適用於原核生物體的可能的正交轉譯組分，選擇對原核生物體不顯示異常同源性的合成酶和/或tRNA。tRNA的集合也可通過一致的策略生產。舉例而言，tRNA的集合是通過比對多個tRNA序列；確定一致序列；和使用至少一部分、大部分或全部一致序列產生tRNA的庫而生產。舉例而言，一致序列可用例如GCG程序堆積(GCG program pileup)的電腦程式來編輯。視需要，將通過所述程序確定的簡併位置(degenerate position)變成在所述位置處最常見的鹼基。庫通過所屬領域中已知的技術使用一致序列合成。舉例而言，寡核苷酸的重疊延伸作用(其中tRNA基因的各部位可被合成為90% —致序列和10%其他3個鹼基的混合物的摻雜混合物)可用以提供基於一致序列的庫。也可使用其他混合物，例如75%—致序列和25%其他3個鹼基的混合物、80% —致序列和20%其他3個鹼基的混合物、95% —致序列和5%其他3個鹼基的混合物等。突變tRNA的庫可使用所屬領域中已知的各種突變技術產生。舉例而言,突變tRNA可通過部位特異性突變、隨機點突變、同源重組、DNA滑移或其他遞歸突變方法、嵌合建構或其任何組合產生。其他突變可在例如反密碼子環、接納^(acceptor stem)、D臂或環、可變環、TWC臂或環的tRNA的所要環或區域、tRNA分子的其他區域或其組合中的例如非保守位置或保守位置、隨機化位置或其組合的特定位置上引入。突變可以包括在莖區中的匹配鹼基對。通常，0-tRNA通過使第一物種的細胞群體經受負性選擇而獲得，其中細胞包含多個可能的0-tRNA的成員。負性選擇消除包含多個可能的0-tRNA的成員的細胞,所述0-tRNA通過對細胞來說為內源性的氨醯基-tRNA合成酶(RS)氨基醯化。所述負性選擇提供與第一物種的細胞正交的tRNA的集合。
在負性選擇的某些實施例中，將選擇密碼子引入多核苷酸中，所述多核苷酸編碼負性選擇標記物，例如給與抗生素抗性的酶，例如￠-內醯胺酶；給與可檢測產物的酶，例如3半乳糖苷酶；氯黴素乙醯轉移酶(CAT)，例如在非基本位置處的毒性產物，諸如barnase ;等。篩選/選擇可通過在選擇劑(例如,抗生素,諸如氨節青黴素(ampicillin))存在下，使細胞群體生長來進行。在一個實施例中，選擇劑的濃度是變化的。舉例而言，為測量抑制基因tRNA的活性，使用基於例如無義密碼子的選擇密碼子的活體內抑制，或引入編碼例如￠-內醯胺酶(bla)的基因的負性選擇標記物的多核苷酸中的移碼突變的選擇系統。舉例而言，建構在某個位置上具有(例如)TAG、AGGA和TGA的多核苷酸變體，例如bla變體。例如細菌的細胞經所述多核苷酸轉形。在不能通過內源性大腸桿菌合成酶有效地裝填的正交tRNA的情況下，例如氨苄青黴素抗性的抗生素抗性應約為或小於不經質粒轉形的細菌的抗生素抗性。如果tRNA是非正交的，或如果能夠裝填tRNA的異源性合成酶在系統中被共表達，那麼觀察到高水平的例如氨苄青黴素的抗生素的抗性。選擇在抗生素濃度約等於不經質粒轉形的細胞的LB瓊脂培養盤上不能生長的細胞，例如細菌。在毒性產物(例如核糖核酸酶barnase)的情況下，當多個可能的tRNA的成員通過例如大腸桿菌合成酶的內源性宿主氨基醯化(也就是說，其不與例如大腸桿菌合成酶的宿主正交)時，選擇密碼子被抑制並且所產生的毒性多核苷酸產物導致細胞死亡。懷有正交tRNA或無功能的tRNA的細胞存活。在一個實施例中，隨後使與所要生物體正交的tRNA的集合經受正性選擇，其中將選擇密碼子放置在(例如)通過諸如P-內醯胺酶基因的耐藥性基因編碼的正性選擇標記物中。正性選擇是在包含編碼或包含tRNA的集合的成員的多核苷酸、編碼正性選擇標記物的多核苷酸和編碼同源RS的多核苷酸的細胞上執行。所述多核苷酸在細胞中表達並且細胞在例如氨苄青黴素的選擇劑存在下生長。然後，就響應所述選擇密碼子tRNA通過共表達的同源合成酶氨基醯化的能力和插入胺基酸的能力來選擇tRNA。通常，與懷有無功能的tRNA或不能由所關注的合成酶有效識別出的tRNA的細胞相比，所述細胞展示抑制效率的增強。懷有無功能tRNA或通過所關注的合成酶不有效識別出的tRNA的細胞對抗生素敏感。因此，(i )不為內源性宿主(例如大腸桿菌)合成酶的底物；(ii )可通過所關注的合成酶氨基醯化jP(iii)在轉譯中起作用的tRNA在兩種選擇中存活。
上述方法中選擇(例如正性選擇、負性選擇或正性和負性選擇)的嚴格性視需要可以變化。舉例而言，因為barnase是極具毒性的蛋白質，所以負性選擇的嚴格性可通過將不同數量的選擇密碼子引入barnase基因中和/或通過使用誘導型啟動子而控制。在另一個實例中，選擇或篩選劑(例如氨苄青黴素)的濃度是變化的。在一個方面中，因為在早期循環期間，所要活性可為低的，所以嚴格性是變化的。因此，在早期循環中應用較低嚴格性的選擇準則並且在選擇的後期循環中應用更嚴格的準則。在某些實施例中，負性選擇、正性選擇或負性和正性選擇可重複多次。可使用多種不同的負性選擇標記物、正性選擇標記物或負性和正性選擇標記物。在某些實施例中，正性和負性選擇標記物可為相同的。其他類型的選擇/篩選可用於本發明以生產例如0-tRNA、O-RS和0-tRNA/O-RS對的正交轉譯組分。舉例而言，負性選擇標記物、正性選擇標記物或正性和負性選擇標記物可包括發螢光或在適合的反應物存在下催化發光反應的標記物。在另一個實 施例中，標記物的產物通過突光活化細胞揀選(FACS)或通過發光來檢測。視需要,標記物包括基於親和力的篩選標記物。參見，Francisco, J. A.等人，(1993)Production andfluorescence-activated cell sorting of Escherichia coli expressing a functionalantibody fragment on the external surface. Proc Natl Acad Sci U S A. 90:10444-8。生產重組正交tRNA的其他方法可見於(例如)標題為「Methods and Compositionsfor the Production of Orthogonal tRNA-Aminoacyl tRNA Synthetase Pairs，，的美國專利申請案 10/126，931 和標題為 「In vivo Incorporation of UnnaturalAmino Acids」 的美國專利申請案 10/126，127，和標題為 「EXPANDING THE EUKARYOTICGENETIC CODE」 的 USSN10/825, 867 中。又參見 Forster 等人，(2003)Programmingpeptidomimetic synthetases by translating genetic codes designed de novo PNAS100 (11):6353-6357 ；和 Feng 等人，(2003)，Expanding tRNA recognition of a tRNAsynthetase by a single amino acid chanRe, PNAS100(10):5676-5681。tRNA可以通過包括(但不限於)化學氨基醯化或酶促氨基醯化的任何方法或技術用所要胺基酸氨基醯化。氨基醯化可以通過氨醯基tRNA合成酶或通過包括(但不限於)核糖酶的其他酶促分子完成。術語「核糖酶」可與「催化性RNA」互換。Cech和同事(Cech，1987, Science, 236:1532-1539 ；McCorkle 等人，1987, Concepts Biochem. 64:221-226)證明可擔當催化劑(核糖酶)的天然存在的RNA的存在。然而，儘管已經展示所述天然RNA觸媒僅對用於裂解和剪接的核糖核酸底物起作用，但是核糖酶的人工進化的近期發展已經將催化作用的清單擴展到各種化學反應。研究已經鑑別可在其自身(2』)3』-末端上催化氨醯基-RNA鍵的RNA分子(Illangakekare等人，1995 Science 267:643-647)和可將氛基酸從一個RNA分子轉移到另一個 RNA 分子的 RNA 分子(Lohse 等人，1996, Nature381:442-444)。以引用的方式併入本文中的美國專利申請公開案2003/0228593，描述建構核糖酶的方法和其在用天然編碼的和非天然編碼的胺基酸氨基醯化tRNA中的用途。包括(但不限於)核糖酶的可氨基醯化tRNA的酶促分子的底物固定形式，可以使經氨基醯化的產物能夠有效親和力純化。適合底物的實例包括瓊脂糖、瓊脂糖凝膠和磁性珠粒。用於氨基醯化的核糖酶的底物固定形式的生產和用途描述於Chemistry and Biology 2003, 10:1077-1084和美國專利申請公開案2003/0228593中，其都以引用的方式併入本文中。
化學氨基醯化方法包括(但不限於)由Hecht和同事(Hecht，S. M. Acc.Chem. Res. 1992，25，545 ;Heckler，T. G. ; Roesser, J. R. ; Xu，C. ; Chang, P. ; Hecht, S.M. Biochemistry 1988, 27，7254 ;Hecht，S. M. ; Alford, B. L. ; Kuroda, Y. ; Kitano, S.J. Biol. Chem. 1978，253，4517)和由 Schultz、Chamberlin、Dougherty 和其他人(Cornish, V. W. ;Mendel, D. ; Schultz, P. G. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1995，34，621 ；Robertson, S. A. ;Ellman, J. A. ; Schultz, P. G. J. Am. Chem. Soc. 1991，113，2722 ；Noren, C.J. ; Anthony-Cahi 11, S. J. ; Griff ith，M. C. ; Schultz, P. G. Science 1989，244，182 ;Bain，J.D. ; Glabe, C. G. ; Dixj T. A. ; Chamberlin, A. R. J. Am. Chem. Soc. 1989，111，8013 ;Bain，J.D 等人 Nature 1992，356，537 ；Gallivan, J. P. ; Lester, H. A. ;Dougherty, D. A. Chem.Biol. 1997，4，740 ;Turcatti 等人，J. Biol. Chem. 1996，271，19991 ；Nowak, M. W.等人，Science, 1995，268，439 ;Saks，M. E.等人 J. Biol. Chem. 1996，271，23169 ;Hohsaka，T.等人J. Am. Chem. Soc. 1999，121，34)所介紹的避免在氨基醯化中使用合成酶的方法。所述方法或其他化學氨基醯化方法可用以氨基醯化tRNA分子。使用經化學修飾的氨醯基-tRNA的生物合成方法已經用以將若干生物物理學探針活體外併入所合成的蛋白質中。參見以下公開案和其中引用的參考文獻Biamner，J.NewPhotolabeling and crosslinking methods,Annu. Rev Biochem,62:483-514(1993);和Krieg，U. C.，Walter, P.，Hohnson，A. E. Photocrosslinking of the signal sequence ofnascent preprolactin of the 54-kilodalton polypeptide of the signal recognitionparticle, Proc. Natl. Acad. Sci. 83 (22) : 8604-8608 (1986)。以前，已經展示，非天然胺基酸可通過將經化學氨基醯化的抑制基因tRNA添加到用含有所要琥珀無義突變的基因程式化的蛋白質合成反應中而在部位特異地活體外併入蛋白質中。使用所述方法，所屬領域的技術人員可用封閉結構的同源物取代大量常見的20種胺基酸，例如，氟苯丙氨酸取代苯丙氨酸，使用營養缺陷菌株取代具體的胺基酸。參見(例如)，Noren, C. J.，Anthony-Cahi 11，Griffith, M. C.，Schultz, P. G. A generalmethod for site-specific incorporation of unnatural amino acids into proteins，Science 244:182-188 (1989) ;M. W. Nowak 等人，Science 268:439-42 (1995) ;Bain，J.D.，Glabe，C. G.，Dixj T. A.，Chamberlin, A. R.，Diala，E. S. Biosynthetic site-specificIncorporation of a non-natural amino acid into a polypeptide，J. Am ChemSoc, 111:8013-8014(1989) ；N. Budisa 等人，FASEB J. 13:41-51 (1999) ;Ellman，J. A.，Mendel, D.，Anthony-Cahi 11, S.，Noren, C. J.，Schultz, P. G. Biosynthetic method forintroducing unnatural amino acids site-specifically into proteins. Methodsin Enz.，第 202 卷，301-336(1992)；和 Mendel，D.，Cornish，V. W.和 Schultz，P.G. Site-Directed Mutagenesis with an Expanded Genetic Code，Annu Rev Biophys.Biomol Struct. 24，435-62(1995)0舉例而言，製備識別終止密碼子UAG的抑制基因tRNA並且用非天然胺基酸將其化學氨基醯化。慣用的定位突變用以在蛋白質基因中的所關注的部位引入終止密石馬子 TAG0 參見(例如)，Sayers, J. R.，Schmidt, W. Eckstein, F. 5，-3，Exonucleases inphosphorothioate-based olignoucleotide-directed mutagensis，Nucleic AcidsRes. 16(3) :791-802(1988)。當經醯化的抑制基因tRNA和突變基因在活體外轉錄/轉譯系統中組合時，響應UAG密碼子將非天然胺基酸併入，得到在規定位置上含有那個胺基酸的蛋白質。使用[3H]_Phe的實驗和用a-羧酸的實驗證明，僅僅所要胺基酸在規定的位置上通過UAG密碼子併入，並且所述胺基酸未在蛋白質中的任何其他部位併入。參見(例如)，Noren 等人，同上；Kobayashi 等人，(2003) Nature Structural Biology 10 (6) : 425-432 ；和 Ellman,J.A.，Mendel, D.，Schultz, P. G. Site-specific incorporation of novelbackbone structures into proteins, Science 255 (5041):197-200(1992)。用於產生催化性RNA的方法可以涉及產生隨機化的核糖酶序列的分離池、對池執行定位進化、為所需氨基醯化活性而篩選池和選擇顯示所要氨基醯化活性的所述核糖酶的序列。核糖酶可包含有利於醯化活性的基元和/或區域，諸如GGU基元和U富集區域。舉例而言，已經報導U富集區域可促進胺基酸底物的識別，並且GGU-基元可與tRNA的3』末端形成鹼基對。在組合時，GGU和基元和U富集區域同時促進胺基酸和tRNA的同時識別，並且進而促進tRNA的3』末端的氨基醯化。、核糖酶可通過使用與tRNAAsnera結合的部分隨機化的r24mini進行活體外選擇，接著通過見於活性無性系中的一致序列的系統工程化而產生。通過所述方法獲得的示範性核糖酶被稱為「Fx3核糖酶」並且描述於美國公開申請案第2003/0228593號中，所述專利的內容是以引用的方式併入本文中，所述核糖酶擔當多用途催化劑用於合成經同源非天然胺基酸裝填的各種氨醯基-tRNA。底物上的固定可用以促成經氨基醯化的tRNA的有效親和力純化。適合的底物的實例包括(但不限於)瓊脂糖、瓊脂糖凝膠和磁性珠粒。核糖酶可通過利用RNA的化學結構固定於樹脂上，諸如RNA的核糖上的3』 -順式二醇可經高碘酸鹽氧化以產生對應的二醛以促進RNA在樹脂上的固定。可使用包括廉價醯肼樹脂的各種類型的樹脂，其中還原性胺化作用使樹脂與核糖酶之間的相互作用成為不可逆的鍵。氨醯基-tRNA的合成可通過所述管柱上氨基醯化技術而顯著地促進。Kouroukl i s等人Methods 2005; 36:239-4描述基於管柱的氨基醯化系統。經氨基醯化的tRNA的分離可以各種方式完成。一種適合的方法是，從具有諸如含有IOmM EDTA的乙酸鈉溶液的緩衝液、含有50mM N-(2-羥乙基)哌嗪-N』 -(3-丙烷磺酸)、pH 7. 0的12. 5mM KClUOmM EDTA的緩衝液或僅為經EDTA緩衝的水(pH 7. 0)的管柱洗提經氨基醯化的tRNA。可將經氨基醯化的tRNA添加到轉譯反應中，以便併入胺基酸，在通過轉譯反應製得的多肽中的特別位置上，tRNA被所述胺基酸氨基醯化。可以使用經氨基醯化的tRNA的轉譯系統的實例，包括(但不限於)細胞溶胞產物。細胞溶胞產物提供為從輸入mRNA活體外轉譯多肽所必需的反應組分。所述反應組分的實例包括(但不限於)核糖體蛋白、rRNA、胺基酸、tRNA、GTP、ATP、轉譯起始因子和延伸因子和與轉譯相關的其他因子。另外，轉譯系統可以是分批轉譯或隔開轉譯。分批轉譯系統在單一隔室中組合反應組分，而隔開轉譯系統使轉譯反應組分與可抑制轉譯效率的反應產物分離。所述轉譯系統是市售的。、另外，可以使用偶合轉錄/轉譯系統。偶合轉錄/轉譯系統允許將輸入的DNA轉錄成對應的mRNA,而mRNA又被反應組分轉譯。市售偶合轉錄/轉譯的實例是RapidTranslation System (RTS, Roche Inc.)。系統包括含有用於提供諸如核糖體的轉譯組分的大腸桿菌溶胞產物和轉譯因子的混合物。另外，包括RNA聚合酶用於將輸入DNA轉錄成適用於轉譯的mRNA模板。RTS可通過插入反應隔室(包括供應/消耗隔室和轉錄/轉譯隔室)之間的膜使反應組分隔開。tRNA的氨基醯化可以通過包括(但不限於)移轉酶、聚合酶、催化性抗體、多官能蛋白質，諸如此類的其他試劑執行。if奪氡醯某-tRNA合成酶(0-RS)本發明的O-RS優先地用所選胺基酸在活體外或活體內氨基醯化0-tRNA。本發明的O-RS可通過包括O-RS的多肽和/或通過編碼O-RS或其部分的多核苷酸而提供到轉譯系統(例如，活體外轉譯組分或細胞)中。舉例而言，O-RS或其部分通過如SEQ ID NO. :4中所述的多核苷酸序列或其互補多核苷酸序列或其保守變化編碼。本發明的O-RS可以氨基醯化大量不同的0-tRNA分子，包括(但不限於)本文中揭示的所述0-tRNA分子。用於鑑別供0-tRNA (例如0-tRNA)使用的正交氨醯基-tRNA合成酶(O-RS)(例如 O-RS)的方法也是本發明的特徵。舉例而言，方法包括使第一物種的細胞群體經受正性選擇，其中所述細胞各自包含I)多個氨醯基-tRNA合成酶(RS)的成員，其中多個RS包含突變體RS、由不同於第一物種的物種得到的RS或突變體RS和由不同於第一物種的物種得到的RS兩者；2)來自第二物種的正交tRNA (0-tRNA);和3)編碼正性選擇標記物並且包含至少一個選擇密碼子的多核苷酸。對於與缺乏多個RS的成員或具有降低量的多個RS的成員的細胞相比，展示抑制效率增強的所述細胞來選擇或篩選細胞。具有抑制效率增強的細胞包含氨基醯化0-tRNA的活性RS。將來自第一物種的第一組tRNA的通過活性RS氨基醯化(活體外或活體內)的水平，與來自第二物種的第二組tRNA的通過活性RS氨基醯化(活體外或活體內)的水平相比較。氨基醯化的水平可通過可檢測物質(例如，經標記的胺基酸或非天然胺基酸)測定。選擇與第一組tRNA相比，更有效地氨基醯化第二組tRNA的活性RS，進而提供供0-tRNA使用的正交氨醯基-tRNA合成酶。通過所述方法鑑別的例如O-RS的O-RS也是本發明的特徵。可使用大量檢定中的任何檢定來測定氨基醯化。所述檢定可在活體外或活體內執行。舉例而言，活體外氨基醯化檢定描述於(例如)Hoben, P.和Soil, D. (1985)MethodsEnzymoI. 113:55-59和美國專利申請公開案第2003/0228593號中。氨基醯化也可通過使用報告基因以及正交轉譯組分，並且檢測在細胞中表達包含至少一個編碼蛋白質的選擇密碼子的多核苷酸的報告基因而測定。又參見，標題為「IN VIVO INCORPORATION OF UNNATURALAMINO ACIDS」 的美國專利申請案 10/126,927 和標題為 「EXPANDING THE EUKARYOTICGENETIC CODE」 的 USSN 10/825,867。經鑑別的O-RS可另外經操縱以改變合成酶的底物特異性以便僅所要非天然胺基酸，而不是常見20種胺基酸的任何胺基酸被裝填到0-tRNA中。產生對非天然胺基酸具有底物特異性的正交氨醯基tRNA合成酶的方法包括，使合成酶(例如)在合成酶中的活性部位、在合成酶中的編輯機制部位、在通過組合合成酶的不同域的不同部位等處突變，和應用選擇處理。使用基於正性選擇接著負性選擇的組合的策略。在正性選擇中，在正性標記物的非基本位置引入的選擇密碼子的抑制作用使細胞在正性選擇壓力下存活。在天然胺基酸和非天然胺基酸存在下，存活者因此編碼用天然胺基酸或非天然胺基酸裝填正交抑制基因tRNA的活性合成酶。在負性選擇中，在負性標記物的非基本位置引入的選擇密碼子的抑制作用除去具有天然胺基酸特異性的合成酶。負性和正性選擇的存活者編碼僅用非天然胺基酸氨基醯化(裝填)正交抑制基因tRNA的合成酶。所述合成酶可隨後經受例如DNA滑移或其他遞歸突變方法的其他突變。突變體O-RS的庫可使用所屬領域中已知的各種突變技術產生。舉例而言，突變體RS可通過部位特異性突變、隨機點突變、同源重組、DNA滑移或其他遞歸突變方法、嵌合建構或其任何組合產生。舉例而言，突變體RS的庫可由兩個或兩個以上的其他(例如更小、較少變化)的「子庫」產生。RS的嵌合庫也包括在本發明中。應注意，來自各種生物體(例如，諸如真細菌或太古細菌的微生物)的tRNA合成酶的庫，諸如包含天然多樣性的庫(參見(例如),Short等人的美國專利第6，238, 884號；Schallenberger等人的美國專利第5，756, 316號；Petersen等人的美國專利第5，783，431號！Thompson等人的美國專利第5，824，485號； Short等人的美國專利第5，958，672號)視需要經建構且對於正交對篩選。一旦合成酶經受正性和負性選擇/篩選策略，所述合成酶就可隨後經受進一步突變。舉例而言，可分離編碼O-RS的核酸；可由所述核酸產生一組編碼經突變的0-RS(例如，通過隨機突變、部位特異性突變、重組或其任何組合)的多核苷酸；並且，可重複所述單獨步驟或所述步驟的組合直到獲得用非天然胺基酸優先氨基醯化0-tRNA的經突變的0-RS。在本發明的一個方面中，將所述步驟執行多次，例如至少2次。其他水平的選擇/篩選嚴格性也可用於本發明的方法中，以生產0-tRNA、O-RS或其對。選擇或篩選嚴格性可在用以生產O-RS的方法的一個或兩個步驟中變化。其可包括(例如)改變所使用的選擇/篩選劑的量等。也可執行正性和/或負性選擇的其他循環。選擇或篩選也可包含一次或多次包括(例如)胺基酸通透性的改變、轉譯效率的改變、轉譯保真度的改變等的正性或負性選擇或篩選。通常，所述一種或一種以上改變是基於其中使用正交tRNA-tRNA合成酶對來生產蛋白質的生物體中的一個或一個以上基因的突變。其他類型的選擇可用於本發明中，以用於(例如)O-RS、0-tRNA和0_tRNA/0_RS對。正性選擇標記物可為包括(但不限於)為生長提供營養補充的產物的各種分子中的任何分子，並且選擇是在缺乏營養補充的培養基上執行。編碼正性選擇標記物的多核苷酸的實例包括(但不限於)(例如)基於補充細胞的營養缺陷胺基酸的報告基因、his3基因(例如，其中通過提供3-氨基三唑(3-AT)所檢測，his3基因編碼咪唑磷酸甘油脫水酶)、ura3基因、leu2基因、lys2基因、IacZ基因、adh基因等。參見(例如)，G. M. Kishore和 D. M. Shah, (1988), Amino acid biosynthesis inhibitors as herbicides, AnnualReview of Biochemistry 57:627-663。在一個實施例中，IacZ生產是通過鄰硝基苯基-0-D-吡喃半乳糖苷(ONPG)水解作用檢測。參見(例如)，I.G. Serebriiskii和 E.A.Golemis, (2000), Uses of IacZ to study gene function: evaluation ofbeta-galactosidase assays employed in the yeast two-hybrid system, AnalyticalBiochemistry 285:1-15。其他正性選擇標記物包括(例如)螢光素酶、綠色螢光蛋白質(GFP)、YFP、EGFP, RFP、抗生素抗性基因的產物(例如，氯黴素乙醯轉移酶(CAT))、轉錄調節劑蛋白質(例如GAL4)等。視需要，編碼正性選擇標記物的多核苷酸包含選擇密碼子。編碼正性選擇標記物的多核苷酸可操作性地與反應元素連接。也可存在編碼調節從反應元素的轉錄並且包含至少一個選擇密碼子的轉錄調節劑蛋白質的其他多核苷酸。通過經非天然胺基酸氨基醯化的0-tRNA將非天然胺基酸併入轉錄調節劑蛋白質中，產生編碼正性選擇標記物的多核苷酸(例如報告基因)的轉錄。視需要，選擇密碼子位於或大體上靠近編碼轉錄調節劑蛋白質的DNA結合域的多核苷酸的一部分。編碼負性選擇標記物的多核苷酸也可操作性地與反應元素連接，從所述反應元素的轉錄是通過轉錄調節劑蛋白質介導。參見(例如)，A. J. DeMaggio等人，(2000), The yeastsplit-hybrid system, Method Enzymol. 328:128-137 ;H.M. Shih等人，(1996), A positivegenetic selection for disrupting protein-protein interactions: identificationof CREB mutations that prevent association with the coactivator CBP,Proc. Natl.Acad. Sci. U. S. A. 93:13896-13901 ；M. Vidal 等人，(1996)，Genetic characterizationof a mammalian protein-protein interaction domain by using a yeast reversetwo-hybrid system, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 93:10321-10326 ；和 M. Vidal 等人，(1996), Reverse two-hybrid and one-hybrid systems to detect dissociationof protein-protein and DNA-protein interactions (Proc.Natl. Acad. Sci.U. S. A. 93:10315-10320)。通過經天然胺基酸氨基醯化的0-tRNA將天然胺基酸併入轉錄調 節劑蛋白質中，產生負性選擇標記物的轉錄。視需要，負性選擇標記物包含選擇密碼子。本發明的正性選擇標記物和/或負性選擇標記物可包含至少兩個選擇密碼子，其各自或兩者可包含至少兩個不同的選擇密碼子或至少兩個相同的選擇密碼子。轉錄調節劑蛋白質是(直接地或間接地)與核酸序列(例如反應元件)結合的分子，並且調節操作性地與反應元素連接的序列的轉錄。轉錄調節劑蛋白質可為轉錄活化劑蛋白質(例如，GAL4、核激素受體、API、CREB, LEF/tcf家族成員、SMAD、VP16、SPl等)，轉錄阻遏物蛋白質(例如，核激素受體、Groucho/tle家族、中鋸齒家族(Engrailed €&111；[17)等),或視環境而定具有兩種活性的蛋白質(例如，LEF/tcf、同盒蛋白質(homobox protein)等)。反應元素通常是由轉錄調節劑蛋白質識別的核酸序列或起與轉錄調節劑蛋白質一致的作用的其他試劑。轉錄調節劑蛋白質的另一個實例是轉錄活化劑蛋白質，GAL4。參見(例如)，A. Laughon 等人，(1984), Identification of two proteins encoded by theSaccharomyces cerevisiae GAL4 gene, Molecular&Cellular Biology 4:268—275;A. Laughon 和 R. F. Gesteland, (1984), Primary structure of the Saccharomycescerevisiae GAL4 gene, Molecular& Cellular Biology 4:260-267 ；L.Keegan 等人，(1986), Separation of DNA binding from the transcription-activating functionof a eukaryotic regulatory protein, Science 231:699-704;和M. Ptashne, (1988), Howeukaryotic transcriptional activators work, Nature 335:683-689。所述 881 胺基酸蛋白質的N-末端147胺基酸形成特異性結合DNA序列的DNA結合域(DBD)。參見(例如)，M. Carey 等人，(1989), An amino-terminal fragment of GAL4 binds DNA as a dimer, J.Mol. Biol. 209:423-432 ;和 E. Giniger 等人，(1985)，Specif ic DNAbinding of GAL4, apositive regulatory protein of yeast, Cell 40:767-774。DBD 是通過插入蛋白質序列與當與DNA結合時可活化轉錄的C-末端113胺基酸活化域(AD)連接。參見(例如)，J. Ma 和 M. Ptashne，(1987)，Deletion analysis of GAL4 defines two transcriptionalactivating segments,CelI 48:847-853;和 J. Ma 和 M.Ptashne，(1987)，Thecarboxy-terminal 30 amino acids of GAL4 are recognized by GAL80, CelI50:137-142。通過將琥珀密碼子朝向(例如)含有GAL4的N-末端DBD和其C-末端AD的單一多肽的N-末端DBD放置，通過O-tRNA/O-RS對的琥珀抑制作用可與通過GAL4的轉錄活化聯繫。經GAL4活化的報告基因可用以執行使用基因的正性和負性選擇。用於負性選擇的培養基可包含通過負性選擇標記物轉化為可檢測物質的選擇或篩選劑。在本發明的一個方面中，可檢測物質是毒性物質。編碼負性選擇標記物的多核苷酸可為(例如)ura3基因。舉例而言，URA3報告基因可在含有GAL4 DNA結合部位的啟動子控制下放置。當負性選擇標記物(例如)通過編碼具有選擇密碼子的GAL4的多核苷酸的轉譯而生產時，GAL4活化URA3的轉錄。負性選擇是在包含5-氟乳清酸(5-F0A)的培養基上完成，所述5-氟乳清酸通過ura3基因的基因產物轉化為可檢測物質(例如殺死細胞的毒性物質)。參見(例如)，J. D. Boeke 等人，(1984), A positive selection for mutantslacking orotidine-S' -phosphate decarboxylase activity in yeast:5-fluorooroticacid resistance, Molecular & General Genetics 197:345-346) ；M. Vidal 等人，(1996), Genetic characterization of a mammalian protein-protein interactiondomain by using a yeast reverse two-hybrid system.,Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 93:10321-10326 ；和 M. Vidal 等人，(1996), Reverse two-hybrid andone-hybrid systems to detect dissociation of protein-protein and DNA-proteininteractions. , Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 93:10315-10320。與正性選擇標記物一樣，負性選擇標記物也可為各種分子中的任何分子。正性選擇標記物和/或負性選擇標記物可以是發螢光或在適合的反應物存在下催化發光反應的多肽。舉例而言，負性選擇標記物包括(但不限於)(例如)螢光素酶、綠色螢光蛋白質(GFP)、YFP、EGFP, RFP、抗生素抗性基因的產物(例如，氯黴素乙醯轉移酶(CAT))、IacZ基因的產物、轉錄調節劑蛋白質等。正性選擇標記物和/或負性選擇標記物可以通過螢光活化細胞揀選(FACS)或通過發光來檢測。正性選擇標記物和/或負性選擇標記物可以包含基於親和力的篩選標記物。相同多核苷酸可編碼正性選擇標記物和負性選擇標記物。舉例而言，正性選擇步驟、負性選擇步驟或正性和負性選擇步驟可包括使用報告基因，其中報告基因是通過螢光活化細胞揀選(FACS)檢測。舉例而言，正性選擇可先用例如氯黴素乙醯轉移酶(CAT)基因的正性選擇標記物進行，其中CAT基因包含在CAT基因中的例如琥珀終止密碼子的選擇密碼子，接著進行負性選擇篩選，其是基於在例如I7RNA聚合酶基因的負性標記物中的位置上不能抑制(例如)兩個或兩個以上的選擇密碼子來進行。正性選擇標記物和負性選擇標記物可在例如質粒的相同載體上見到。負性標記物的表達驅動例如綠色螢光蛋白質(GFP)的報告基因的表達。選擇和篩選的嚴格性可以變化，例如，使報告基因發螢光所需要的光的強度可以變化。正性選擇可用報告基因作為正性選擇標記物來進行，所述報告基因是通過FACS篩選，接著進行負性選擇篩選，其是基於在例如barnase基因的負性標記物中的位置上不能抑制(例如)兩個或兩個以上的選擇密碼子來進行。視需要，報告基因展示在細胞表面上，例如卩遼菌體展示(phage display)等等上。例如基於OmpA的細胞-表面展示系統的細胞-表面展示依靠例如與大腸桿菌細胞表面上的外膜孔蛋白OmpA融合的脊髓灰白質病毒C3肽的具體抗原決定基的表達。僅當蛋白質信息中的選擇密碼子在轉譯期間被抑制時，抗原決定基才展示在細胞表面上。然後，所展示的肽含有由庫中的突變體氨醯基-tRNA合成酶之一識別出的胺基酸，並且含有對應合成酶基因的細胞可用抵抗含有特定非天然胺基酸的肽而產生的抗體來分離。基於OmpA的細胞-表面展示系統是由Georgiou等人開發且優化以作為噬菌體展示的替換物° 參見，Francisco, J. A. , Campbell, R. , Iverson, B. L.和 Georgoiu, G. Productionand fluorescence-activated cell sorting of Escherichia coli expressing afunctional antibody fragment on the external surface. Proc. Natl. Acad. Sci. USA90:10444-8(1993)。本發明的其他實施例包括活體外進行一個 或一個以上選擇步驟。例如合成酶和/或tRNA的所選組分可隨後被引入細胞中以用於活體內併入非天然胺基酸。生產O-RS和改變合成酶的底物特異性的其他細節可見於標題為「Methodsand Compositions for the Production of Orthogonal tRNA-Aminoacyl tRNASynthetase Pairs」 的美國專利申請案 10/126,931 和標題為 「EXPANDING THEEUKARYOTIC GENETIC CODE」的USSN 10/825，867，其是以引用的方式併入本文中。生產 O-RS 的其他細節可見於 Hamano-Takaku 等人，(2000)A mutant Escherichia coliTyrosyl-tRNA Synthetase Utilizes the Unnatural Amino Acid AzatyrosineMore Efficiently than Tyrosine, Journal of Biological Chemistry,275(51):40324-40328 ；Kiga 等人，(2002)，An engineered Escherichia colityrosyl-tRNA synthetase for site-specific incorporation of an unnaturalamino acid into proteins in eukaryotic translation and its applicationin a wheat germ cell-free system, PNAS99(15):9715-9723 ;和 Francklyn 等人，(2002), Aminoacyl-tRNA synthetases: Versatile players in the changing theateroftranslation;RNA, 8:1363-1372，各參考文獻是以引用的方式併入本文中。來源和宿主牛物體本發明的轉譯組分通常由非真核生物體得到。舉例而言，正交0-tRNA可由例如古細菌，諸如詹氏甲烷球菌、橫川病毒、諸如富饒鹽菌和鹽桿菌種NRC-I的鹽桿菌屬、閃爍古生球菌、火球菌、掘越氏熱球菌、嗜熱菌敏捷氣熱菌等等；或真細菌，諸如大腸桿菌、嗜熱細菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌等等的非真核生物體得到，而正交O-RS可由例如橫川病毒、諸如富饒鹽菌和鹽桿菌種NRC-I的鹽桿菌屬、閃爍古生球菌、火球菌、掘越氏熱球菌、嗜熱菌敏捷氣熱菌等等；或真細菌，諸如大腸桿菌、嗜熱細菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌等等的非真核生物體得到。在一個實施例中，也可使用包括(但不限於)植物、藻類、原生生物、真菌、酵母、動物(例如哺乳動物、昆蟲、節肢動物等)等等的真核來源。0-tRNA/0-RS對的個別組分可由相同生物體或不同生物體得到。在一個實施例中，0-tRNA/0-RS對是來自相同的生物體。或者，0-tRNA/0-RS對的0-tRNA和O-RS是來自不同的生物體。舉例而言,0-tRNA可由(例如)鹽桿菌種NRC-I得到，並且O-RS可由(例如)嗜熱自養甲烷桿菌得到。0-tRNA,O-RS或0-tRNA/0-RS對可經活體內或活體外選擇或篩選和/或用於例如非真核細胞(諸如大腸桿菌細胞)或真核細胞的細胞中以生產具有所選胺基酸(例如非天然胺基酸)的多肽。非真核細胞可來自各種來源，諸如原生種系發生域，包括(但不限於)詹氏甲烷球菌、橫川病毒、諸如富饒鹽菌和鹽桿菌種NRC-I的鹽桿菌屬、閃爍古生球菌、火球菌、掘越氏熱球菌、嗜熱菌敏捷氣熱菌等等，或可屬於真細菌種系發生域，包括(但不限於)大腸桿菌、嗜熱細菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、螢光極毛桿菌、綠膿桿菌、惡息極毛桿菌等等。真核細胞可來自各種來源，包括(但不限於)植物(例如，諸如單子葉植物或雙子葉植物的複雜植物)、藻類、原生生物、真菌、酵母(包括(但不限於)釀酒酵母);動物(包括(但不限於)哺乳動物、昆蟲、節肢動物等)等等。具有本發明的轉譯組分的細胞的組合物也是本發明的特徵。對在一種物種中篩選用於另一種物種的0-tRNA和/或O-RS來說，又參見，標題為「Expandingthe Eukaryotic Genetic Code」 的 USSN 10/825,867。為在宿主細胞中表達具有所選胺基酸的所關注的多肽，所屬領域的技術人員可以將編碼所關注的多肽的多核苷酸亞克隆到表達載體中，該表達載體含有指導轉錄的啟動子、轉錄/轉譯終止子和(如果對於編碼蛋白質的核酸來說)用於轉譯起始的核糖體結合部位的。適合的細菌啟動子在所屬領域中為熟知的並且描述於(例如)Samtoook等人和Ausubel等人中。用於表達所關注的多肽的細菌表達系統可在包括(但不限於)大腸桿菌、芽胞桿菌種、螢光極毛桿菌、綠膿桿菌、惡息極毛桿菌和沙門氏菌(沙門氏菌屬)中得到(Palva等人，Gene 22:229-235(1983) ;Mosbach 等人，Nature 302:543-545(1983))。用於所述表達系統的試劑盒是市售的。用於哺乳動物細胞、酵母和昆蟲細胞的真核表達系統在所屬領域中是熟知的並且也是市售的。本發明的tRNA和/或RS和/或所關注的多肽可以應用於和/或表達於包括(例如)酵母、昆蟲細胞、哺乳動物細胞和細菌的許多適合的表達系統中。示範性表達系統的描述提供於下文。酵母如本文所使用，術語「酵母」包括能夠表達所關注的多肽的各種酵母中的任何酵母。所述酵母包括(但不限於)產子囊孢子酵母(內孢黴目(Endomycetales))、擔子菌有抱子酵母(basidiosporogenous yeast)和屬於半知菌(芽生菌(Blastomycetes))群組的酵母。產子囊孢子酵母分成2個科，即蝕精黴科(Spermophthoraceae)和酵母科(Saccharomycetaceae)。後者包含 4 個亞科，即裂殖酵母亞科(Schizosaccharomycoideae)(例如，裂殖酵母屬(genus Schizosaccharomyces))> 拿遜酵母亞科(Nadsonioideae)、Lipomycoideae 和 Saccharomycoideae (例如畢赤氏酵母屬(genera Pichia)、克盧費氏酵母屬(Kluyveromyces)和酵母菌屬(Saccharomyces))。擔子菌有孢子酵母包括擔子菌白冬抱酵母屬(genera Leucosporidium)、紅冬抱酵母屬(Rhodosporidium)、鎖擲酵母屬(Sporidiobolus)、線黑粉菌屬(Filobasidium)和香灰擬鎖擔菌屬(Filobasidiella)。屬於半知菌(芽生菌)群組的酵母分成2個科，即擲孢酵母科(Sporobolomycetaceae)(例如，擲孢酵母屬(genera Sporobolomyces)和布勒彈孢酵母屬(Bullera))和隱球酵母科(Cryptococcaceae)(例如念珠菌屬(genus Candida))。供本發明使用的尤其受關注的是以下物種中的物種畢赤氏酵母屬、克盧費氏酵母屬、酵母菌屬、裂殖酵母屬、漢遜酵母屬(Hansenula)、球擬酵母屬(Torulopsis)和念珠菌屬，包括(但不限於)巴斯德畢赤酵母(P. pastoris)、P. guiIlerimondii、釀酒酵母、嘉士伯酵母(S. carlsbergensis)、糖化酵母(S. diastaticus)、道格拉斯酵母(S. douglasii)、科魯維爾酵母(S. kluyveri)、諾本斯酵母(S. norbensis)、卵形酵母(S. oviformis)、乳酸克魯維酵母(K. lactis)、乳糖酶酵母(K. fragilis)、白色念珠菌(C. albicans)、麥芽糖假 絲酵母(C. maltosa)和漢森酵母(H. polymorpha)。酵母通常可從包括(但不限於)以下來源的各種來源購得Yeast Genetic Stock Center、Department of Biophysics andMedical Physics,University of California (Berkeley, CA)和 American Type CultureCollection (iiATCCO (Manassas, VA)0術語「酵母宿主」或「酵母宿主細胞」包括可用作或已經用作用於重組載體或其他轉移DNA的接受者的酵母。術語包括已經接受重組載體或其他轉移DNA的原始酵母宿主細胞的子代。應了解，由於意外的或有意的突變，單一親代細胞的子代可以不必在形態學或補充於原始母體的染色體組或總DNA方面完全相同。足夠相似於有待通過諸如編碼所關注的多肽的核苷酸序列存在的相關性質表徵的母體的親代細胞的子代包括在所述定義所指的子代中。已經開發包括染色體外複製子或合併載體的表達和轉形載體，用於轉形到許多酵母宿主中。舉例而言，已經開發用於釀酒酵母的 表達載體(Sikorski等人，GENETICS(1989) 122:19 ；Ito 等人，J. Bacteeiol. (1983) 153:163 ；Hinnen 等人，Peoc. Natl.Acad. Sci. USA(1978)75:1929);用於白色念珠菌的表達載體(Kurtz 等人，MOL. CELL.BIOL. (1986)6:142);用於麥芽糖假絲酵母的表達載體(Kunze等人，J-Basic Miceobiol.(1985)25:141);用於漢森酵母的表達載體(Gleeson 等人，J. Gen. Miceobiol. (1986) 132:3459 ；Roggenkamp 等人，MOL. GENETICS AND GENOMICS (1986) 202:302);用於乳糖酶酵母的表達載體(Das等人，J. BACTERI0L. (1984) 158:1165);用於乳酸克魯維酵母的表達載體(DeLouvencourt 等人，J. BACTERI0L· (1983) 154:737 ；Van den Berg 等人，BIOTECHNOLOGY (NY)(1990)8:135);用於 P. guillerimondii 的表達載體(Kunze 等人，J. BASIC MICROBIOL.(1985)25:141);用於巴斯德畢赤酵母的表達載體(美國專利第5，324, 639 ;4，929，555 ；和 4，837，148 號；Cregg 等人，MOL. CELL. BIOL. (1985)5:3376);用於粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)的表達載體(Beach 等人，NATURE (1982) 300:706);和用於解脂耶羅威亞酵母(Y. Iipolytica);構巢麴黴(A. nidulans)的表達載體(Ballance等人，Biochem. Biophys. Res. Commun. (1983) 112:284-89 ；TiIburn 等人，Gene(1983) 26:205-221 ;和 Yelton等人，Proc- Natl. Acad. Sci. USA(1984) 81:1470-74);用於黑黴菌(A. niger)的表達載體(Kelly和 Hynes, EMBO J. (1985)4:475-479);用於裡氏木黴(Τ· reesia)的表達載體(EP 0244234)；和用於諸如脈孢菌屬(Neurospora)、青黴屬(Penicillium)、彎頸黴屬(Tolypocladium)的絲狀真菌的表達載體(WO 91/00357)，各個參考文獻是以引用的方式併入本文中。酵母載體的控制序列為所屬領域的技術人員所知並且包括(但不限於)來自諸如以下基因的基因的啟動子區域醇脫氫酶(ADH) (EP 0284044);烯醇酶；葡糖激酶；葡糖-6-磷酸異構酶；甘油醛-3-磷酸-脫氫酶(GAP或GAPDH);己糖激酶；磷酸果糖激酶；3-磷酸甘油酸變位酶；和丙酮酸激酶(PyK) (EP 0329203)。編碼酸性磷酸酶的酵母PH05基因也可以提供有效的啟動子序列(Miyanohara等人，PR0C. NATL. ACAD. SCI.USA (1983) 80:1)。供酵母宿主使用的其他適合的啟動子序列可以包括3-磷酸甘油酸激酶(Hitzeman等人，J.BI0L.CHEM. (1980) 255:12073);和其他糖解酶，諸如丙酮酸脫羧酶、磷酸丙糖異構酶和磷酸葡糖異構酶(Holland等人，Biochemistry (1978) 17:4900;Hess等人，J. AdvEnzyme Reg. (1969) 7:149)的啟動子。具有通過生長條件來控制的轉錄的額外優點的誘導型酵母啟動子，可以包括醇脫氫酶2 ;異細胞色素C ;酸性磷酸酶；金屬硫蛋白；甘油醛-3-磷酸脫氫酶；與氮代謝相關的降解酶；和擔負麥芽糖和半乳糖應用的酶的啟動子區域。適用於酵母表達的適合的載體和啟動子另外描述於EP 0073657中。酵母強化子也可以與酵母啟動子一起使用。另外，合成啟動子也可以起酵母啟動子的作用。舉例而言，酵母啟動子的上遊活化序列(UAS)可以與另一酵母啟動子的轉錄活化區域接合，產生合成雜交啟動子。所述雜交啟動子的實例包括與GAP轉錄活化區域連接的ADH調節序列。參見美國專利第4，880，734和4，876，197號，其是以引用的方式併入本文中。雜交啟動子的其他實例所包括的啟動子由與諸如GAP或PyK的糖解酶基因的轉錄活化區域組合的ADH2、GAL4、GALlO或PH05基因的調節序列組成。參見EP 0164556。此外，酵母啟動子可以包括具有結合酵母RNA聚合酶並且引發轉錄的能力的非酵母源的天然存在的啟動子。可以包含部分酵母表達載體的其他控制元件包括(例如)來自GAPDH或烯醇酶基因的終止子(Holland等人，J.BI0L.CHEM. (1981)256:1385)。另外，來自2 μ質粒源的複製源適用於酵母。適用於酵母的適合的選擇基因是存在於酵母質粒中的trpl基因。參見， Tschumper 等人，GENE (1980) 10:157 ；Kingsman 等人，GENE (1979) 7:141。trpl 基因提供 為沒有能力在色氨酸中生長的酵母突變菌株的選擇標記物。同樣地，缺Leu2的酵母菌株(ATCC20，622或38，626)是通過帶有Leu2基因的已知質粒補充。將外原性DNA引入酵母宿主中的方法為所屬領域的技術人員所知，並且通常包括(但不限於)用鹼性陽離子處理的球形體或完整酵母宿主細胞的轉形。舉例而言，酵母的轉形可根據 Hsiao 等人，PR0C.NATL.ACAD. SCI.USA(1979)76:3829 和 Van Solingen 等人，J.BACT. (1977) 130:946中所述的方法進行。然而，諸如通過核注射、電穿孔或原生質體融合的用於將DNA引入細胞中的其他方法，也可以如SAMBR00K等人，MOLE⑶LAR CLONING:ALAB. MANUAL(2001)中的一般描述使用。然後，可以使用為所屬領域的技術人員所知的標準技術培養酵母宿主細胞。用於在酵母宿主細胞中表達異源蛋白質的其他方法為所屬領域的技術人員所知。通常參見，美國專利公開案第20020055169號、美國專利第6, 361,969 ;6，312，923 ；6，183，985 ;6，083，723 ;6，017，731 ;5，674，706 ;5，629，203 ;5，602，034 ；和 5，089，398號；美國再審專利第RE37, 343和RE35, 749號；PCT公開專利申請案WO 99/078621 ；W098/37208 ;和 WO 98/26080 ;歐洲專利申請案 EP 0946736 ；EP 0732403 ；EP 0480480 ；W090/10277 ；EP 0340986 ；EP 0329203 ；EP 0324274 ;和 EP 0164556，所述專利是以引用的方式併入本文中。又參見 Gellissen 等人，ANTONIE VAN LEEUWENHOEK(1992)62 (1-2) :79-93 ；Romanos 等人，YEAST(1992)8 (6):423-488 ;Goeddel, METHODS IN ENZYM0L0GY(1990) 185:3-7，各個參考文獻是以引用的方式併入本文中。酵母宿主菌株在擴增階段期間，使用為所屬領域的技術人員所知的標準進料分批發酵方法，在發酵罐中生長。發酵方法可以由於具體的酵母宿主的碳利用路徑或表達控制的模式的差異而修改。舉例而言，酵母菌屬酵母宿主的發酵可需要單一葡萄糖進料、複合氮源(例如酪蛋白水解物)和多次維生素增補。相反，甲基營養型酵母巴斯德畢赤酵母可需要甘油、甲醇和痕量礦物質進料，但僅需要簡單的銨(氮)鹽以達到最佳生長和表達。參見(例如)，以引用的方式併入本文中的美國專利第5，324，639號；Elliott等人，J. PROTEINCHEM. (1990)9:95 ;和 Fieschko 等人，BIOTECH. BI0ENG. (1987)29:1113。然而，所述發酵方法可以具有某些獨立於所用酵母宿主菌株的共同特徵。舉例而言，通常為碳的生長限制營養物可在擴增階段期間被添加到發酵罐中以容許最大生長。另夕卜，發酵方法通常使用經設計以含有足夠量的碳、氮、基本鹽、磷和其他微量養分(維生素、痕量礦物質和鹽等)的發酵培養基。適於供畢赤氏酵母屬使用的發酵培養基的實例描述於美國專利第5，324，639和5，231，178號中，所述專利是以弓I用的方式併入本文中。經杆狀病毒感染的昆蟲細胞術語「昆蟲宿主」或「昆蟲宿主細胞」指的是可用作或已經用作用於重組載體或其他轉移DNA的接受者的昆蟲。術語包括已經被轉染的原始昆蟲宿主細胞的子代。應了解，由於意外的或有意的突變，單一親代細胞的子代可以不必在形態學或補充到原始母體的染色體組或總DNA方面完全相同。足夠相似於有待通過諸如編碼所關注的多肽的核苷酸序列存在的相關性質表徵的母體的親代細胞的子代包括在所述定義所指的子代中。用於表達所關注的多肽的適合昆蟲細胞的選擇為所屬領域的技術人員所知。若干昆蟲物種充分描述於所屬領域中並且是市售的，包括埃及伊蚊(Aedes aegypti)、家蠶(Bombyx mori)、果妮(Drosophila melanogaster)、草地夜蛾(Spodoptera frugiperda) 和粉紋夜蛾(Trichoplusia ni)。在選擇用於表達的昆蟲宿主時,適合的宿主可以包括展示具有(尤其)良好分泌能力、低蛋白質分解活性和總堅固性的所述宿主。昆蟲通常可從包括(但不限於)以下來源的各種來源購得Insect Genetic Stock Center、Departmentof Biophysics and Medical Physics, University of California (Berkeley;CA);和American Type Culture Collection (「ATCC，，)(Manassas, VA)。通常，經杆狀病毒感染的昆蟲表達系統的組分包括轉移載體，通常為細菌質粒，其含有杆狀病毒基因組的片段和用於插入待表達的異源基因的適當的限制性部位；具有與轉移載體中的杆狀病毒特異性片段同源的序列的野生型杆狀病毒(其允許異源基因在杆狀病毒基因組中的同源重組);和適當的昆蟲宿主細胞和生長培養基。用於構建載體、轉染細胞、挑選溶菌斑、使細胞在培養物中生長諸如此類的物質、方法和技術在所屬領域中為已知的並且描述所述技術的手冊是可用的。將異源基因插入轉移載體中後，載體和野生型病毒基因組被轉染到載體和病毒基因組在其中重組的昆蟲宿主細胞中。表達經包裝的重組病毒並且鑑別和純化重組溶菌斑。用於杆狀病毒/昆蟲細胞表達系統的物質和方法，是以來自(例如)InvitrogenCorp. (Carlsbad, CA)的試劑盒形式市售。所述技術通常為所屬領域的技術人員所知並且全部描述於以引用的方式併入本文的SUMMERS和SMITH, TEXAS AGRI⑶LTURALEXPERIMENT STATION BULLETIN 第 1555 號(1987)中。又參見，Richardson, 39METH0DS INMOLECULAR BIOLOGY:BACUL0VIRUS EXPRESSION PROTOCOLS (1995) ;AUSUBEL 等人，CURRENTPROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY 16.9-16. 11(1994) ;KING 和 POSSEE, THE BACULOVIRUSSYSTEM:A LABORATORY GUIDE(1992)；和 O』REILLY 等人，BACULOVIRUS EXPRESSIONVECTORS:ALAB0RAT0RY MANUAL(1992)。實際上，使用杆狀病毒/昆蟲細胞表達系統的各種異源蛋白質的生產為所屬領域的技術人員所知。參見(例如)，美國專利第6，368, 825 ;6，342,216 ;6，338, 846 ;6，261,805 ；6，245，528 ;6，225，060 ;6，183，987 ;6，168，932 ;6，126，944 ;6，096，304 ;6，013，433 ；5，965，393 ;5，939，285 ;5，891，676 ;5，871，986 ;5，861，279 ;5，858，368 ;5，843，733 ；5，762，939 ;5，753，220 ;5，605，827 ;5，583，023 ;5，571，709 ;5，516，657 ;5，290，686 號；WO 02/06305 ；W0 01/90390 ；W0 01/27301 ；W0 01/05956 ；W0 00/55345 ；W0 00/20032 ；WO 99/51721 ；W0 99/45130 ；W0 99/31257 ；W0 99/10515 ；W0 99/09193 ；W0 97/26332 ；WO 96/29400 ；W0 96/25496 ；W0 96/06161 ；W0 95/20672 ；W0 93/03173 ；W0 92/16619 ；WO 92/02628 ；W0 92/01801 ；W0 90/14428 ；W0 90/10078 ；W0 90/02566 ；W0 90/02186 ；W090/01556 ；W0 89/01038 ；W0 89/01037 ；W0 88/07082號，所述專利以引用的方式併入本文中。適用於杆狀病毒/昆蟲細胞表達系統的載體在所屬領域中為已知的並且包括(例如)由杆狀病毒苜猜丫紋夜蛾(Autographacalifornica)核型多角體病毒(AcNPV)得到的昆蟲表達和轉移載體，其為輔助病毒(helper)獨立性、病毒表達載體。由所述系統得到的病毒表達載體通常使用強病毒性多角體蛋白基因啟動子來驅動異源基因的表達。通常參見，O』Reilly 等人，BACULOVIRUS EXPRESSION VECTORS:A LABORATORYMANUAL(1992)。在將外來基因插入杆狀病毒基因組中之前，通常將包含啟動子、引子(如果需要)、所關注的編碼序列和轉錄終止序列的上述組分裝配成中間錯位構築體(轉移載體)。常將中間錯位構築體維持在諸如能夠穩定維持在諸如細菌的宿主中的其他染色體元件(例如質 粒)的複製子中。複製子將會具有複製系統，因此容許其被維持在用於克隆和擴增的適合的宿主中。更明確地說，質粒可以含有多角體蛋白多聚腺苷酸化信號(Mi 11 er, Ann. Rev.Microbiol. (1988)42:177)和原核抗氨節青黴素(amp)基因和用於在大腸桿菌中選擇和繁殖的複製源。用於將外來基因引入AcNPV中的一種常用轉移載體是pAc373。也已經設計了為所屬領域的技術人員所知的許多其他載體，包括(例如)pVL985，其將多角體蛋白起始密碼子從ATG改變成ATT，並且在ATT下遊的32個鹼基對處引入BamHI克隆部位。參見，Luckow和 Summers, Virology 170:31(1989)。其他市售載體包括(例如)PBlueBac4. 5/V5_His ；pBlueBacHis2 ；pMelBac ；pBlueBac4. 5 (Invitrogen Corp. , Carlsbad, CA)。在插入異源基因後，將轉移載體和野生型杆狀病毒基因組共轉染到昆蟲細胞宿主中。用於將異源DNA引入杆狀病毒病毒中的所要部位中的方法在所屬領域中為已知的。參見，Summers 和 Smith, Texas Ageicultueal Expeeiment Station BulletinJ^J 1555 可(1987) ；Smith ^人，MOL. CELL. B10L. (1983)3:2156 ; Luckow 和 Summers, Virology (1989) 170:31 舉例而言，插入可為通過同源複式轉線軌道重組，插入到諸如多角體蛋白基因的基因中；插入也可為插入到被工程化成所要杆狀病毒基因的限制性內切酶部位中。參見，Miller等人，Bioessays (1989) 11(4):91。轉染可以通過電穿孔完成。參見Trotter And Wood, 39Methods inMolecular Biology(1995) ；Mann 和 King, J. Gen. Virol. (1989)70:3501。或者，月旨質體可用以轉染具有重組表達載體和杆狀病毒的昆蟲細胞。參見(例如)，Liebman等人，Biotechniques(1999)26(1) :36 ；Graves 等人，BIOCHEMISTRY(1998) 37:6050 ；Nomura等人，J. B10L. CHEM. (1998) 273 (22) : 13570 ；SCHMIDT 等人，PROTEIN EXPRESSION ANDPURIFICATION(1998) 12:323 ；Siffert 等人，NATURE GENETICS (1998) 18:45 ;TILKINS 等人，CELL BIOLOGY:A LABORATORY HANDBOOK 145-154(1998) ;CAI 等人，PROTEIN EXPRESSIONANDPURIFICATION (1997) 10:263 ;D0LPHIN 等人，NATURE GENETICS (1997) 17:491 ；Kost 等人，GENE (1997) 190:139 JAK0BSS0N 等人，J. BIOL. CHEM. (1996)271:22203 ；Rowles 等人，J. BIOL. CHEM. (1996) 271 (37) :22376 ；Reverey 等人，J. BIOL. CHEM.(1996) 271 (39) : 23607-10 !Stanley 等人，J. BIOL. CHEM. (1995) 270:4121 ；Sisk 等人，J. Virol. (1994) 68 (2) : 766 ；和 Peng 等人，BIOTECHNIQUES (1993) 14 (2) : 274。市售脂質體包括(例如)Cellfectin 和Lipofectin (Invitrogen, Corp. , Carlsbad, CA)。另夕卜，可以使用磷酸鈣轉染。參見，TROTTER AND WOOD, 39 METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY(1995)；Kitts, NAR(1990) 18(19) :5667 ;和，Mann 和 King, J. GEN. VIROL. (1989)70:3501。杆狀病毒表達載體通常含有杆狀病毒啟動子。杆狀病毒啟動子是任何能夠結合杆狀病毒RNA聚合酶並且弓I發將編碼序列(例如結構基因)下遊(3』)轉錄成mRNA的DNA序列。啟動子將具有通常位於最接近於編碼序列的5』末端的轉錄起始區域。所述轉錄起始區域通常包括RNA聚合酶結合部位和轉錄起始部位。杆狀病毒啟動子也可以具有稱為強化子的第二域，如果存在，那麼其通常遠離結構基因。此外，表達可為調節性或為構成性的。在感染循環的後期充分轉錄的結構基因提供尤其有效的啟動子序列。實例包括
由編碼病毒多面體蛋白質的基因(Friesen等人，The Regulation of Baculovirus GeneExpression, THE MOLECULAR BIOLOGY OF BACULOVIRUSES(1986) ；EP 0127839 和 0155476)和編碼plO蛋白質的基因(Vlak等人，J. Gen. Virol. (1988)69:765)得到的序列。將新形成的杆狀病毒表達載體包裝到感染重組杆狀病毒中並且隨後，可以通過為所屬領域的技術人員所知的技術純化已生長的溶菌斑。參見，Miller等人，Bioessays(1989)11(4):91 ;SUMMERS和SMITH, TEXAS AGRICULTURAL EXPERIMENT STATIONBULLETIN第1555 號(1987)。已經開發用於感染到若干昆蟲細胞中的重組杆狀病毒表達載體。舉例而言，已經開發尤其用於埃及伊蚊(ATCC第CCL-125號)、家蠶(ATCC第CRL-8910號)、果蠅(ATCC第1963號)、草地夜蛾和粉蚊夜蛾的重組杆狀病毒。參見，Wright, NATURE (1986)321:718 ；Carbonell 等人，J. VIROL. (1985)56:153 ;Smith 等人，MOL. CELL. BIOL. (1983)3:2156。通常參見，Fraser等人，InVitkqCELL. DEV. BIOL. (1989)25:225。更明確地說，用於杆狀病毒表達載體系統的細胞系通常包括(但不限於)Sf9 (草地夜蛾)(ATCC第CRL-1711號)、Sf21 (草地夜蛾)(Invitrogen Corp. , Cat.第 11497-013 號(Carlsbad, CA))、Tri-368 (粉蚊夜蛾)和 High-Five BTI-TN-5B1-4 (粉蚊夜蛾)。用於在杆狀病毒/表達中直接表達和融合表達異源多肽的細胞和培養基是市售的，並且細胞培養技術通常為所屬領域的技術人員所知。大腸桿菌、假單胞菌種和其他原核牛物細菌表汰技術為所屬領域的技術人員所知。多種載體可得到用於細菌宿主中。載體可以是單拷貝或低或高多拷貝載體。載體可以用於克隆和/或表達。鑑於關於載體、許多載體的工業效用和甚至描述載體和其限制圖和特徵的手冊的豐富的文獻，在此不需要廣泛討論。如所熟知的，載體通常涉及允許選擇的標記物，所述標記物可以提供細胞毒性劑抗性、原營養或免疫性。常常，存在提供不同特徵的多個標記物。細菌啟動子是任何能夠結合細菌RNA聚合酶和引發將編碼序列(例如結構基因)下遊(3』)轉錄成mRNA的DNA序列。啟動子將具有通常位於最接近於編碼序列的5』末端的轉錄起始區域。所述轉錄起始區域通常包括RNA聚合酶結合部位和轉錄起始部位。細菌的啟動子也可以具有稱為操縱子的第二域，其可以重疊RNA合成開始處的鄰近RNA聚合酶結合部位。操縱子容許負性調節(誘導型)轉錄，因為基因阻遏蛋白可以結合操縱子並且進而抑制特定基因的轉錄。構成性表達可以在不存在諸如操縱子的負性調節元件時發生。另外，正性調節可以通過基因活化子蛋白結合序列達成，如果存在，那麼其通常最接近於RNA聚合酶結合序列(5』)。基因活化子蛋白質的實例是代謝活化蛋白(CAP)，其幫助引發Iac操縱子在大腸桿菌中的轉錄[Raibaud等人，ANNU. REV. GENET. (1984) 18:173]。經調節的表達因此可以是正性的或負性的，進而增強或者減少轉錄。編碼代謝路徑酶的序列提供尤其有效的啟動子序列。實例包括由諸如半乳糖、乳糖(lac) [Chang等人，Nature (1977) 198:1056]和麥芽糖的糖代謝酶得到的啟動子序列。其他實例包括由諸如色氨酸(trp)的生物合成酶得到的啟動子序列[Goeddel等人，Nuc. Acids Res. (1980) 8:4057 ;Yelverton 等人，Nucl. Acids Res. (1981) 9:731 ;美國專利第4，738,921號；歐洲專利公開案第036776和121775號，其是以引用的方式併入本文中]。β -半乳糖苷酶(bla)啟動子系統[Weissmann (1981) 「The cloning of interferonand other mistakes.，，In Interferon 3 (I. Gresser 編)]、卩遼菌體 λ PL[Shimatake 等人，Nature (1981) 292:128]和T5 [美國專利第4，689，406號]啟動子系統也提供有效的啟動子·序列。諸如Τ7啟動子的強啟動子可用以誘導高水平的所關注的多肽。所述載體的實例為所屬領域的技術人員所知並且包括來自Novagen的ρΕΤ29系列和描述於以引用的方式併入本文中的W099/05297中的pPOP載體。所述表達系統在宿主中產生高水平的多肽，而不會危害宿主細胞生存性或生長參數。PET19 (Novagen)是在所屬領域中已知的另一種載體。另外，非天然存在的合成啟動子也起細菌啟動子的作用。舉例而言，一個細菌啟動子或噬菌體啟動子的轉錄活化序列可以與另一個細菌啟動子或噬菌體啟動子的操縱子序列接合，產生合成雜交啟動子[美國專利第4，551，433號，所述專利是以引用的方式併入本文中]。舉例而言，tac啟動子是通過Iac阻遏物調節的由trp啟動子和Iac操縱子序列組成的雜交 trp-lac 啟動子[Amann 等人，GENE (1983) 25:167; de Boer 等人，Peoc. Natl. Acad.Sci. (1983)80:21]。此外，細菌啟動子可包括具有結合細菌RNA聚合酶並且引發轉錄的能力的非細菌性源的天然存在的啟動子。非細菌性源的天然存在的啟動子也可與相容的RNA聚合酶偶合以產生一些基因在原核生物中的高水平表達。細菌磷酸酶(bacteriophase)T7 RNA聚合酶/啟動子系統是經偶合的啟動子系統的實例[Studier等人，J. Mol. Biol.(1986) 189:113 ;Tabor 等人，Proc Natl. Acad. Sci. (1985)82:1074]。另外，雜交啟動子也可由噬菌體啟動子和大腸桿菌操縱子區域組成(歐洲專利公開案第267851號)。除功能啟動子序列之外，有效的核糖體結合部位也適用於外來基因在原核生物中的表達。在大腸桿菌中，核糖體結合部位稱為Shine-Dalgarno (SD)序列並且包括起始密碼子(ATG)和定位於起始密碼子的3-11個核苷酸上遊的長度為3-9個核苷酸的序列[Shine等人，Nature (1975) 254:34]。認為SD序列通過SD序列與大腸桿菌16SrRNA的3』末端之間的鹼基的配對,而促進mRNA與核糖體的結合[Steitz等人「Geneticsignals and nucleotide sequences in messenger RNA，，，In Biological Regulationand Development: Gene Expression (Ed. R. F. Goldberger, 1979)]。用弱核糖體結合部位表達真核基因和原核基因[Sambrook 等人 「Expression of cloned genes in Escherichiacoli，，，Molecular Cloning:A Laboratory Manual, 1989]。術語「細菌宿主」或「細菌宿主細胞」指的是可用作或已經用作用於重組載體或其他轉移DNA的接受者的細菌。術語包括已經轉染的原始細菌宿主細胞的子代。應了解，由於意外的或有意的突變，單一親代細胞的子代可以不必在形態學或補充於原始母體的染色體組或總DNA方面完全相同。足夠相似於有待通過諸如編碼hGH的核苷酸序列存在的相關性質表徵的母體的親代細胞的子代包括在所述定義所指的子代中。用於表達多肽的適合寄主細菌的選擇為所屬領域的技術人員所知。在選擇用於表達的細菌宿主時，適合的宿主可以包括展示具有(尤其)良好內含體形成能力、低蛋白質分解活性和總堅固性的所述宿主。細菌宿主通常可從包括(但不限於)以下來源的各種來源購得Bacterial Genetic Stock Center、Department of Biophysics and MedicalPhysics, University of California (Berkeley, CA)； 和 American Type CultureCollection (「ATCC」)(Manassas，VA)。工業發酵/醫藥發酵通常使用由K菌株(例如W3110)得到的細菌或由B菌株(例如BL21)得到的細菌。所述菌株是尤其有效的，因為其生長參數是十分熟知的和穩固的。另外，所述菌株是非病原性的，其在商業上對安全性和環境原因為重要的。適合的大腸桿菌宿主的其他實例包括(但不限於)BL21、DH10B或其衍生物的菌株。在本發明的方法的另一個實施例中，大腸桿菌宿主是包括(但不限於)OMP-和LON-的蛋白酶負菌株。宿主細胞菌株可以是包括(但不限於)螢光極毛桿菌、綠膿桿菌和惡息極毛桿菌的假單胞桿菌種。已知命名為菌株MB 101的螢光極毛桿菌生物變種I適用於重組生產並且可用於治療性蛋白質生產工藝。假單胞菌表達系統的實例包括可以宿主菌株(可在WorldWide Web, dow. com 上購得的 Midland, MI)購自 Dow Chemical Company 的系統。以引用的方式併入本文中的美國專利第4，755，465和4，859，600號，描述假單胞菌株作為用於hGH生產的宿主細胞的用途。一旦重組宿主細胞菌株已經建立(也就是說，表達構築體已經被引入宿主細胞中並且具有正確表達構築體的宿主細胞被分離)，就在適於生產所關注的多肽的條件下培養重組宿主細胞菌株。如所屬領域的技術人員顯而易見的，培養重組宿主細胞菌株的方法將視所利用的表達構築體的性質和宿主細胞的同一性而定。通常使用所屬領域中熟知的方法培養重組宿主菌株。重組宿主細胞通常是在含有碳、氮和無機鹽的可吸收源，和(視需要)含有維生素、胺基酸、生長因子和其他為所屬領域的技術人員所知的蛋白質培養補充物的液 體培養基中培養。用於培養宿主細胞的液體培養基可以視需要含有防止不良微生物生長的抗生素或抗真菌劑和/或包括(但不限於)選擇含有表達載體的宿主細胞的抗生素的化合物。重組宿主細胞可以分批或以連續形式培養，同時細胞收集(在所關注的多肽細胞內積聚的情況下)或培養物上清液的收集以分批或以連續形式進行。為在原核宿主細胞中進行生產，分批培養和細胞收集為優選的。詵擇密碼子本發明的選擇密碼子擴展蛋白質生物合成器的遺傳密碼子框架。舉例而言，選擇密碼子包括(例如)獨特的3鹼基密碼子，無義密碼子，諸如包括(但不限於)琥珀密碼子(UAG)、赭石密碼子或蛋白石密碼子(UGA)的終止密碼子，非天然密碼子，4鹼基(或4個以上)密碼子，稀有密碼子等等。大量選擇密碼子(例如一個或一個以上、兩個或兩個以上、3個或3個以上的選擇密碼子)可被引入所要基因或多核苷酸中。在一個實施例中，方法涉及選擇密碼子的用途，該選擇密碼子為用於活體內併入例如非天然胺基酸的所選胺基酸的終止密碼子。舉例而言，生產識別終止密碼子的O-tRNA並且通過O-RS用所選胺基酸氨基醯化。所述Ο-tRNA不能通過天然存在的宿主的氨醯基-tRNA合成酶識別出。慣用定位突變可用以在所關注的多肽中的所關注部位引入終止密碼子。參見(例如)，Sayers, J. R.等人(1988)，5』_3』Exonucleases inphosphorothioate-based oligonucleotide-airected mutagenesis Nucleic AcidsResl6:791-802。當0-RS、0_tRNA和編碼所關注的多肽的核酸(例如)活體內組合吋，響應終止密碼子併入所選胺基酸以得到在規定位置上含有例如非天然胺基酸的所選胺基酸的多肽。在本發明的一個實施例中，用作選擇密碼子的終止密碼子是琥珀密碼子UAG和/或蛋白石密碼子UGA。舉例而言，就識別琥珀密碼子的Ο-tRNA的實例來說，參見SEQ ID NO. :6，並且就識別蛋白石密碼子的Ο-tRNA的實例來說，參見SEQ ID NO. :7。UAG和UGA都用作選擇密碼子的遺傳密碼可編碼22種胺基酸，同時保持為最豐富終止信號的赭石無義密碼子UAA。能在活體內併入例如非天然胺基酸的所選胺基酸而不會顯著幹擾宿主細胞。舉例而言，在諸如大腸桿菌的非真核細胞中，因為UAG密碼子的抑制效率視例如琥珀抑制基因tRNA的Ο-tRNA與釋放因子I (RFl)(其結合於UAG密碼子並且引發生長肽從核糖體的釋 放)之間的競爭而定，所以抑制效率可通過(例如)增加例如抑制基因tRNA的Ο-tRNA的表達水平或使用缺乏RFl的菌株來調節。在真核細胞中，因為UAG密碼子的抑制效率視例如琥珀抑制基因tRNA的Ο-tRNA與真核釋放因子(例如eRF)(其結合於終止密碼子並且引發生長肽從核糖體的釋放)之間的競爭而定，所以抑制效率可通過(例如)増加例如抑制基因tRNA的Ο-tRNA的表達水平來調節。非天然胺基酸也能由稀有密碼子編碼。舉例而言，當活體外蛋白質合成反應中的精氨酸濃度降低吋，已經證明稀有的精氨酸密碼子，即AGG對通過由丙氨酸醯化的合成tRNA插入Ala來說為有效的。參見(例如)，Ma等人，Biochemistry. 32:7939(1993)。在所述情況下，合成tRNA與作為次要物種存在於大腸桿菌中的天然存在的tRNAArg競爭。ー些生物體不使用所有的三聯體密碼子。藤黃微球菌(Micrococcus Iuteus)中的未指定的密碼子AGA已經被應用於在活體外轉錄/轉譯提取物中插入胺基酸。參見(例如)，Kowal和Oliver. Nucl. Acid. Res. . 25:4685(1997)。可產生本發明的組分以在活體內使用所述稀有密碼子。選擇密碼子也包含(例如)4個或4個以上鹼基密碼子的擴展密碼子，諸如4個、5個、6個或6個以上鹼基密碼子。4鹼基密碼子的實例包括(但不限於)AGGA, CUAG, UAGA,CCCU，諸如此類。5鹼基密碼子的實例包括(但不限於)AGGAC,CCCCU、CCCUC、CUAGA, CUACU、UAGGC，諸如此類。特徵可包括基於移碼抑制使用擴展密碼子。4個或4個以上鹼基密碼子可將(例如)ー種或多種包括(但不限幹)非天然胺基酸的所選胺基酸插入相同蛋白質中。舉例而言，在具有反密碼子環，例如具有CU(X)nXXXAA序列(其中n=l)的例如特殊移碼抑制基因tRNA的經突變O-tRNA的存在下，4個或4個以上鹼基密碼子讀取為單ー胺基酸。舉例而言，就識別出4鹼基密碼子的O-tRNA來說，參見來自PCT/US0422061的SEQ IDNO. :6、SEQ ID NO. :12。在其他實施例中，反密碼子環可解碼(例如)至少4-鹼基密碼子、至少5-鹼基密碼子或至少6-鹼基密碼子或至少6個以上鹼基密碼子。因為存在256種可能的4-鹼基密碼子，所以可使用4個或4個以上鹼基密碼子在相同細胞中編碼多個非天然胺基酸。參見，Anderson 等人，(2002)Exploring the Limits of Codon and AnticodonSize, Chemistry and Biology,9:237-244 :Magliery, (2001)Expanding the GeneticCode:Selection of Efficient Suppressors of Four-base Codons and Identiiicationof^Shifty^Four-base Codons with a Library Approach in Escherichia coli. I. MoI.Biol.307:755-769o舉例而言，使用活體外生物合成方法，4-鹼基密碼子已經被用以將非天然胺基酸併入蛋白質中。參見(例如)，Ma等人，(1993) Biochemistry. 32:7939 :和Hohsaka等人,
(1999)T.Arn. Chem. Soc. 121:34。CGGG和AGGU用以同時將2-萘基丙氨酸和賴氨酸的NBD衍生物與兩種經化學醯化的移碼抑制基因tRNA—起活體外併入抗生蛋白鏈菌素中。參見(例如),Hohsaka 等人，(1999) T. Am. Chem. Soc, 121:12194。在活體內研究中，Moore 等人調查了具有NCUA反密碼子的tRNALeu衍生物抑制UAGN密碼子(N可為U、A、G或C)的能力，並且發現四聯體UAGA可通過具有UCUA反密碼子的tRNALeu，以13到26%的效率解碼，同時在O或-1框中少量解碼。參見，Moore等人，(2000) T. Mol. Biol. , 298:195。在一個實施例中， 基於稀有密碼子或無義密碼子的擴展密碼子可用於本發明中，所述擴展密碼子可降低在其他不需要的部位上的錯義讀取和移碼抑制。對給定系統來說，選擇密碼子也可包括天然3鹼基密碼子之一，其中內源性系統不使用(或很少使用)天然鹼基密碼子。舉例而言，所述系統包括缺乏識別出天然3鹼基密碼子的tRNA的系統，和/或其中3鹼基密碼子是稀有密碼子的系統。選擇密碼子視需要包括非天然鹼基對。所述非天然鹼基對進ー步擴展現存的遺傳字母表。ー個額外的鹼基對使三聯體密碼子的數目從64増加到125。第三鹼基對的性質包括穩定的和選擇性的鹼基配對、以高保真度通過聚合酶有效地酶促併入DNA中，和在初生非天然鹼基對的合成後有效的連續的引物延伸。可適宜於方法和組合物的非天然鹼基對的描述包括(例如)Hirao 等人，(2002) An unnatural base pair for incorporating aminoacid analogues into protein. Nature BiotechnoloRY, 20:177182。又參見，Wu，Y.等人，
(2002)T. Am. Chem. Soc. 124:14626-14630。其他相關公開案列於下文。對活體內使用來說，非天然核苷可滲透膜並且經磷酸化以形成對應的三磷酸鹽。另外，増加的遺傳信息是穩定的並且不會被細胞酶破壞。Benner和其他人的早先努力利用不同於典型的Watson-Crick對中的所述型式的氫鍵型式，其中最值得注意的實例是 iso_C: iso_G 對。參見(例如)，Switzer 等人，(1989) .1. Am. Chem. Soc, 111:8322 和Piccirilli 等人，(1990)Nature. 343:33;KooI，(2000)Curr. Opin. Chem. Biol.，4:602。所述鹼基一般說來在某種程度上與天然鹼基錯配並且不能酶促地複製。Kool和同事證明，鹼基之間的疏水性包裝相互作用能置換氫鍵以驅動鹼基對的形成。參見，Kool, (2000)Curr.Opin. Chem. Biol.，4:602 ;和 Guckian 和 Kool, (1998) AnRew. Chem. Int. Ed. EnRl. , 36, 2825。在致カ於開發滿足所有上述要求的非天然鹼基對的過程中，Schultz、Romesberg和同事系統地合成和研究了一系列非天然疏水性鹼基。發現PICS:PICS自身對比天然鹼基對更穩定，並且可有效地通過大腸桿菌DNA聚合酶I的克林諾片段(Klenow fragment, KF))併入DNA 中。參見(例如)，McMinn 等人，(1999).1. Am. Chem. Soc, 121:11585-6 和 ORawa 等人,
(2000)T. Am. Chem. Soc. 122:3274。3MN:3MN自身對能通過KF，以足夠用於生物功能的效率和選擇性來合成。參見(例如)，Ogawa等人，(2000) T. Am. Chem. Soc. 122:8803。然而，兩個鹼基擔當進ー步複製的鏈終止劑。最近，已經開發可用以複製Pics自身對的突變DNA聚合酶。另外，可複製7AI自身對。參見(例如)，Tae等人，(2001) T. Am. Chem. Soc. 123:7439。也已經開發了新穎的金屬鹼基對，即Dipic:Py，其在結合銅(II)後形成穩定的對。參見，Meggers等人，(2000) T. Am. Chem. Soc. 122:10714。因為擴展密碼子和非天然密碼子本質上與天然密碼子正交，所以本發明的方法可以利用所述性質來產生其正交的tRNA。轉譯旁路系統也可用以將例如非天然胺基酸的所選胺基酸併入所要多肽中。在轉譯旁路系統中，大的序列被插入基因中但不轉譯成蛋白質。序列含有充當誘導核糖體跳過序列並且在插入物的下遊恢復轉譯的結構。
所選胺基酸和非天然胺基酸如本文中所使用，所選胺基酸指的是任何所要求的天然存在的胺基酸或非天然胺基酸。天然存在的胺基酸包括20種經遺傳編碼的α-胺基酸中的任何一種丙氨酸、精氨酸、天門冬醯胺、天門冬氨酸、半胱氨酸、穀氨醯胺、穀氨酸、甘氨酸、組氨酸、異白氨酸、白氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸、纈氨酸。在ー個實施例中，所選胺基酸是以高保真度，以對給定選擇密碼子來說大於約70%的效率、以對給定選擇密碼子來說大於約75%的效率、以對給定選擇密碼子來說大於約80%的效率、以對給定選擇密碼子來說大於約85%的效率、以對給定選擇密碼子來說大於約90%的效率、以對給定選擇密碼子來說大於約95%的效率，或以對給定選擇密碼子來說大於約99%或99%以上的效率，併入生長多肽鏈中。如本文中所使用，非天然胺基酸指的是任何胺基酸、經修飾的胺基酸或不同於硒代半胱氨酸和/或吡咯賴氨酸和以下20種經遺傳編碼的α -胺基酸的胺基酸類似物丙氨酸、精氨酸、天門冬醯胺、天門冬氨酸、半胱氨酸、穀氨醯胺、穀氨酸、甘氨酸、組氨酸、異白氨酸、白氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸、纈氨酸。α-胺基酸的通用結構由式I說明
I
R
H2NCc^H
O非天然胺基酸通常為具有式I的任何結構，其中R基團是不同於20種天然胺基酸中所用取代基的的任何取代基。就20種天然胺基酸的結構來說，參見(例如)L. Stryer的Biochemistry,第三版· 1988，Freeman and Company, New York。注意，本發明的非天然胺基酸可為不同於上述20種α-胺基酸的天然存在的化合物。因為本發明的非天然胺基酸通常僅在側鏈的結構上不同於天然胺基酸，所以非天然胺基酸以與醯胺鍵在天然存在的蛋白質中形成的相同方式，與包括(但不限於)天然或非天然的其他胺基酸形成醯胺鍵。然而，非天然胺基酸具有使其區別於天然胺基酸的側鏈基團。舉例而言，式I中的R可以包含烷基_、芳基_、醯基_、酮基_、疊氮基_、羥基_、肼、氰基-、南基-、醯肼、烯基、炔基、醚、硫醇、硒基_、磺醯基_、硼酸基_、酉朋酸基、磷酸基、膦醯基、膦、雜環基、烯酮、亞胺、醛、酷、硫代酸、羥胺、胺，諸如此類或其任何組合。其他非天然存在的胺基酸包括(但不限幹)包含可光活化的交聯劑的胺基酸、經自旋標記的胺基酸、發螢光的胺基酸、結合金屬的胺基酸、含金屬的胺基酸、放射性胺基酸、具有新穎的官能團的胺基酸、共價地或非共價地與其他分子相互作用的胺基酸、光致籠罩和/或光致異構化的胺基酸、包含生物素或生物素類似物的胺基酸、諸如經糖取代的絲氨酸的經糖基化的胺基酸、經其他碳水化合物修飾的胺基酸、含酮的胺基酸、包含聚こニ醇或聚醚的胺基酸、經重原子取代的胺基酸、可化學裂解和/或可光致裂解的胺基酸、當與天然胺基酸比較時具有伸長側鏈的胺基酸，所述伸長側鏈包括(但不限幹)聚醚或(包括(但不限幹))大於約5個或大於約10個碳的長鏈烴、經碳連接的含糖胺基酸、氧化還原活性的胺基酸、含氨基硫代酸的胺基酸和包含ー個或ー個以上毒性部分的胺基酸。又參見，美國專利申請公開案2003/0082575和2003/0108885，其是以引用的方式併入本文中。非天然胺基酸可以具有用以(例如)將蛋白質連接到固體支撐物的可光活化的交聯劑。非天然胺基酸可以具有與胺基酸側鏈連接的糖類部分。除含有新穎側鏈的非天然胺基酸之外，(例如)由式II和III的結構所說明，非天
然胺基酸視需要也包含經修飾的骨架結構
權利要求
1.一種細胞，其包含轉譯系統，其中所述轉譯系統包含具有選自由以下序列組成的群組的核酸序列的氨醯基tRNA合成酶(RS):SEQ ID N0:4、編碼SEQ ID N0:5的胺基酸序列的多核苷酸序列、編碼SEQ ID NO: 17的胺基酸序列的多核苷酸序列、其互補多核苷酸序列和其保守變化；所述細胞另包含一 tRNA，所述tRNA是由選自於SEQ IDNO USEQ ID NO 2以及SEQ ID NO :3所組成的群組中的聚核苷酸序列編碼；所述細胞另包含一聚核苷酸，用以編碼一所關注的多肽，其中編碼所關注多肽的聚核苷酸包含通過所述tRNA識別的選擇密碼子，且其中所述tRNA是通過所述RS而被氨基醯化。
2.根據權利要求I所述的細胞，其中所述細胞是真核細胞。
3.根據權利要求2所述的細胞，其中所述真核細胞是酵母細胞。
4.根據權利要求2所述的細胞，其中所述真核細胞是真菌細胞。
5.根據權利要求2所述的細胞，其中所述真核細胞是哺乳動物細胞。
6.根據權利要求2所述的細胞，其中所述真核細胞是昆蟲細胞。
7.根據權利要求2所述的細胞，其中所述真核細胞是植物細胞。
8.根據權利要求I所述的細胞，其中所述細胞是細菌細胞。
9.根據權利要求8所述的細胞，其中所述非真核細胞是大腸桿菌(E.coli)細胞。
全文摘要
本發明提供生產包括正交tRNA、正交氨醯基-tRNA合成酶和tRNA/合成酶的正交對的蛋白質生物合成器的組分的組合物和方法。本發明也提供用於鑑別所述正交對的方法以及使用所述正交對來生產蛋白質的方法。
文檔編號C12N1/19GK102719366SQ20121022024
公開日2012年10月10日 申請日期2005年12月1日 優先權日2004年12月22日
發明者丘霍松, 安德魯·鮑賽爾 申請人:Ambrx公司