獲自埃及伊蚊的防禦素及其編碼基因和應用的製作方法

2023-06-22 10:18:41 2

獲自埃及伊蚊的防禦素及其編碼基因和應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種獲自埃及伊蚊的防禦素及其編碼基因和應用。本發明提供的蛋白，為如下（a）或（b）或（c）或（d）或（e）：（a）由序列表的序列1自N端第24至99位胺基酸殘基組成的蛋白質；（b）由序列表的序列1所示的胺基酸序列組成的蛋白質；（c）由序列表的序列4自N端第20至98位胺基酸殘基組成的蛋白質；（d）由序列表的序列4所示的胺基酸序列組成的蛋白質；（e）將（a）或（b）或（c）或（d）經過一個或幾個胺基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有抗菌肽功能的由其衍生的蛋白質。本發明進一步證實，AaDEF蛋白可以有效降低登革熱病毒的感染能力。本發明具有廣闊應用前景。
【專利說明】獲自埃及伊蚊的防禦轟及其編碼基因和應用

【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種獲自埃及伊蚊的防禦素及其編碼基因和應用。

【背景技術】
[0002] 防禦素（antimicrobial peptide)是一類大自然界廣泛存在的活性小膚，也稱為 宿主防禦膚化ost defense peptide)。生物體在受到刺激時就會誘導產生防禦素。防禦素 通常是由10-50多個胺基酸殘基組成的鹼性小分子多膚，含有4個或多於4個帶正電荷的 胺基酸幼日賴氨酸或精氨酸)，N端親水C端疏水，具有雙親的性質。防禦素水溶性好，大部分 防禦素具有熱穩定性(在l〇(TC加熱10-15min仍能保持其活性)。多數防禦素的等電點大於 7,表現出較強的陽離子特性，對較大的離子強度和較高或較低的抑值均具有較強的抗性， 此外部分防禦素具備抵抗膜蛋白酶或胃蛋白酶水解的能力。
[0003] 防禦素根據其來源分類，可W分成六大類：（0昆蟲防禦素；（2)哺乳動物防禦素；
[3] 兩棲動物防禦素；（4)魚類、軟體動物、甲殼類動物來源的防禦素；（5)植物防禦素；（6) 細菌防禦素。昆蟲的免疫系統缺乏獲得性免疫系統，只有天然免疫系統，防禦素是其天然免 疫系統的一個重要組成部分。昆蟲防禦素具有分子小，抗菌譜廣，來源豐富，且僅作用於原 核細胞及病變的真核細胞的特點，為替代抗生素提供了新的途徑。
[0004] 除此之外，人們還發現，某些防禦素對部分病毒、真菌、原蟲和癌細胞等有殺滅作 用，甚至能提高免疫力、加速傷口癒合過程，而且不破壞人體的正常細胞的特性。如能很好 地開發利用，有望給臨床醫學、臨床藥學、食品加工、動物和植物轉基因技術等領域帶來革 命性的進展，有著非常廣闊的開發利用前景。


【發明內容】

[0005] 本發明的目的是提供一種獲自埃及伊蚊的防禦素及其編碼基因和應用。
[0006] 本發明提供了一種獲自埃及伊蚊的防禦素，將其命名為Aa呢F蛋白，為如下（a)或 (b)或（C)或（d)或（e) ; (a)由序列表的序列1自N端第24至99位胺基酸殘基組成的蛋 白質；（b)由序列表的序列1所示的胺基酸序列組成的蛋白質；（C)由序列表的序列4自N 端第20至98位胺基酸殘基組成的蛋白質；（d)由序列表的序列4所示的胺基酸序列組成 的蛋白質；（e)將（a)或（b)或（C)或（d)經過一個或幾個胺基酸殘基的取代和/或缺失和 /或添加且具有抗菌膚功能的由其衍生的蛋白質。
[0007] 編碼所述AaDEF蛋白的基因也屬於本發明的保護範圍。
[0008] 編碼所述AaDEF蛋白的基因可為如下（1)或（2)或（3)或（4)或（5)或（6)或（7) 或（8)所述的DNA分子；（1)序列表的序列2自5'末端第70至297位核巧酸所示的DNA 分子；（2)序列表的序列2所示的DNA分子；（3)序列表的序列3所示的DNA分子；（4)序 列表的序列5自5'末端第58至294位核巧酸所示的DNA分子；（5)序列表的序列5所示 的DNA分子；（6)序列表的序列6所示的DNA分子；（7)在嚴格條件下與（1)或（2)或（3) 或（4)或（5)或（6)限定的DNA序列雜交且編碼具有抗菌膚功能的蛋白的DNA分子；（8)與 (1)或（2)或（3)或（4)或（5)或（6)或（5)或（6)限定的DM序列至少具有90% W上同源 性且編碼具有抗菌膚功能的蛋白的DNA分子。上述嚴格條件可為在6 X SSC，0. 5%SDS的溶 液中，在65°C下雜交，然後用2XSSC、0. 1%SDS和1XSSC、0. 1%SDS各洗膜一次。
[0009] 含有編碼所述AaDEF蛋白的基因的表達盒、重組載體、轉基因細胞系或重組菌均 屬於本發明的保護範圍。
[0010] 具有所述AaDEF蛋白的融合蛋白（簡稱AaDEF融合蛋白）也屬於本發明的保護範 圍。
[OOU] 所述AaDEF融合蛋白可為如下（f)或（g)或（h)或（i)或（j) ;(f)由序列表的序 列9自N端第19至127位胺基酸殘基組成的蛋白質；（g)由序列表的序列9所示的胺基酸 序列組成的蛋白質；（h)由序列表的序列11自N端第19至130位胺基酸殘基組成的蛋白 質；（i)由序列表的序列11所示的胺基酸序列組成的蛋白質；（j)將（f)或（g)或化）或 (i)經過一個或幾個胺基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有抗菌膚功能的由其衍 生的蛋白質。
[0012] 編碼所述AaDEF融合蛋白的基因也屬於本發明的保護範圍。
[0013] 編碼所述AaDEF融合蛋白的基因可為如下（9)或（10)或（11)或（12)或（13)或
[14] 所述的DNA分子；（9)序列表的序列10自5'末端第55至381位核巧酸所示的DNA分 子；（10)序列表的序列10所示的DNA分子；（11)序列表的序列12自5'末端第55至390 位核巧酸所示的DNA分子；（12)序列表的序列12所示的DNA分子；（13)在嚴格條件下與 (9)或（10)或（11)或（12)限定的DNA序列雜交且編碼具有抗菌膚功能的蛋白的DNA分子； (14)與（9)或（10)或（11)或（12)限定的DNA序列至少具有90% W上同源性且編碼具有抗 菌膚功能的蛋白的DM分子。上述嚴格條件可為在6 X SSC，0. 5%SDS的溶液中，在65C下雜 交，然後用 2XSSC、0. 1%SDS 和 1XSSC、0. 1%SDS 各洗膜一次。
[0014] 含有編碼所述AaDEF融合蛋白的基因的表達盒、重組載體、轉基因細胞系或重組 菌均屬於本發明的保護範圍。
[0015] 本發明還保護一種抑制微生物增殖和/或複製和/或感染的產品，包括所述AaDEF 蛋白或所述AaDEF融合蛋白。所述微生物可為病毒，具體可為登革熱病毒，更具體可為登革 熱2型病毒，如New Guinea C株。
[0016] 本發明還保護所述AaDEF蛋白或所述AaDEF融合蛋白載製備試劑盒中的應用；所 述試劑盒的功能為抑制微生物增殖和/或複製和/或感染。所述微生物可為病毒，具體可 為登革熱病毒，更具體可為登革熱2型病毒，如New Guinea C株。
[0017] 本發明還保護所述AaDEF蛋白或所述AaDEF融合蛋白的應用；所述應用為抑制微 生物增殖和/或複製和/或感染。所述微生物可為病毒，具體可為登革熱病毒，更具體可為 登革熱2型病毒，如New Guinea C株。
[0018] 本發明在埃及伊蚊中鑑定兩種新的防禦素（AaDEFC蛋白和AaDE抑蛋白，因同源性 很高，統稱為AaDEF蛋白)，實驗結果顯示該兩種防禦素可W有效降低病原體增殖的能力。防 御素是生物體內可誘導的一類小分子，一般含有29?34個胺基酸殘基，其中6個保守的半 脫氨酸形成3個分子內二硫鍵。防禦素通過結合到病原微生物的膜上發揮作用，屬於抗菌 膚家族。本發明發現，AaDEFC蛋白和AaDEFD蛋白均被登革熱病毒感染誘導表達，在埃及伊 蚊體內沉默AaDEFC基因或AaDE抑基因可W顯著降低埃及伊蚊免疫系統對登革熱病毒感染 的阻抑作用，AaDEFC蛋白和AaDEFD蛋白可W有效降低登革熱病毒的感染能力。本發明具 有廣闊應用前景。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0019] 圖1為實施例1的結果。
[0020] 圖2為實施例2和實施例3的結果。
[0021] 圖3為實施例4和實施例5中的Westernblot圖譜。
[0022] 圖4為實施例4和實施例5中，Vero細胞中登革熱2型病毒的病毒量。

【具體實施方式】
[0023] W下的實施例便於更好地理解本發明，但並不限定本發明。下述實施例中的實驗 方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自 常規生化試劑商店購買得到的。W下實施例中的定量試驗，均設置H次重複實驗，結果取平 均值。
[0024] 埃及伊蚊（Aedes aegypti );參考文獻；Colpitts TM, Cox J, Vanlandin曲am DL,Feitosa FM,Cheng G, et al. (2011)Alterations in the Aedes aegypti Transcriptome during Infection with West Nile, Dengue and Yellow Fever Viruses. PLoS Pathog7 巧）：el002189. doi:10. 1371/journal. ppat. 1002189.。
[00巧]實施例中所用的登革熱2型病毒（dengue virus type-2, DENV-2)均為登革 熱 2 型病毒 New Guinea C 株；參考文獻；Chao Y C，Huang C S，Lee C N，et al.Hi曲er infection of dengue virus serotype2in human monocytes of patients with G6PD deficien巧[J]. PloS one,2008,3(2):el557.。
[0026] 質粒pMT/BiP/V5-HisA ;Invitrogen 公司，產品目錄號 V4130-20。S2 細胞(果禍 S2 細胞）invitation，產品目錄號R690-07。Vero細胞（非洲綠猴腎細胞）；ATC腳C化-81?。
[0027] MIDg。(50%mosquito Infectious dose)即半數蚊子感染劑量；MIDg。的數值含義為 通過胸腔注射病毒稀釋液300化使半數埃及伊蚊感染病毒的稀釋倍數；IMIDg。為將病毒原 液稀釋其MIDg。數值倍數後，胸腔注射300化可使半數埃及伊蚊感染。
[002引發明人從埃及伊蚊中發現兩種高同源性的多膚，屬於防禦素，分別命名為AaDEFC 蛋白和AaDE抑蛋白。AaDEFC蛋白如序列表的序列1所示（自N末端第1至23位胺基酸殘 基組成信號膚，第24至99位胺基酸殘基組成AaDEFC成熟膚)，其編碼基因命名為AaDEFC 基因，如序列表的序列3所示(其中開放閱讀框如序列表的序列2所示)。AaDEFD蛋白如序 列表的序列4所示（自N末端第1至19位胺基酸殘基組成信號膚，第20至98位胺基酸殘 基組成AaDE抑成熟膚)，其編碼基因命名為AaDE抑基因，如序列表的序列6所示(其中開放 閱讀框如序列表的序列5所示)。AaDEFC蛋白和AaDE抑蛋白具有抗菌膚的功能，可W抑制 登革熱病毒的增殖和/或複製和/感染。
[0029] 實施例1、DENV-2誘導埃及伊蚊體內AaDEFC基因和AaDE抑基因的表達
[0030] 1、分組處理
[0031] 實驗組（20隻）；給埃及伊蚊接種登革熱2型病毒(每隻埃及伊蚊通過胸腔注射劑 量為lOMIDs。的DENV-2,注射體積為300nL);
[0032] 對照組（22隻）；每隻埃及伊蚊通過胸腔注射30化L PBS緩衝液。
[0033] 2、完成步驟1的接種化後，提取埃及伊蚊的總RNA並反轉錄為cDNA，利用英光定 量PCR( SYBR Green )檢測埃及伊蚊體內AaDEFC基因和AaDE抑基因的表達情況(採用Act in 基因為內參)。
[0034] 用於鑑定AaDEFC基因的引物如下：
[00巧]上遊引物；5, -CTTTGTTTGATGAACTTCCGGAG-3,；
[0036] 下遊引物；5，-GAACCCACTCAGCAGATCGC-3，。
[0037] 用於鑑定AaDE抑基因的引物如下：
[0038] 上遊引物；5' -GGCGTTGGTGATAGTGCTTG-3' ；
[0039] 下遊引物；5，-CACACCTTCTTGGAGTTGCAG-3，。
[0040] 用於鑑定Actin基因的引物如下：
[0041] 上遊引物；5, -GAACACCCAGTCCTGCTGACA-3,；
[0042] 下遊引物；5，-TGCGTCATCTTCTCACGGTTAG-3，。
[0043] 結果見圖1 (A為AaDEFC基因的相對表達量，B為AaDE抑基因的相對表達量)。結 果表明，注射登革熱病毒後，埃及伊蚊體內AaDEFC基因和AaDE抑基因的表達明顯上升。
[0044] 實施例2、抑制AaDEFC基因表達的物質在促進登革熱病毒複製中的應用
[0045] 一、製備 dsRNA
[0046] 1、設計用於製備抑制AaDEFC基因表達的dsRNA的編碼DM的引物如下：
[0047] AaD邸C-F ; 5' - |TAATACGACTCACTATAGGG| GCACGTACGATCGCCTGTC-3';
[0048] AaD邸C-R; 5，- |taatacgactcactataggg| CGAGAAACTCAAAATAAACCGATAC-3，。
[0049] 上述引物中，方框標註的區域為T7啟動子序列。
[0050] 2、提取埃及伊蚊的總RNA並反轉錄為cDNA，W cDNA為模板，用AaDEFC-F和 AaDEFC-R組成的引物對進行PCR擴增，得到PCR擴增產物。
[0051] 3、取步驟2得到的PCR擴增產物，採用Ambion MEGAscriptT7Hi曲Yield Transcription Kit (產品目錄號為AM1334)並按試劑盒說明書進行體外轉錄，由於 AaDEFC-F和AaDEFC-R都具有T7啟動子，體外轉錄形成兩條反向互補的單鏈RNA分子，該兩 條反向互補的單鏈RNA分子自發形成序列表的序列7所示的雙鏈RNA分子（dsRNA-1)。 [005引 4、設計用於製備抑制GFP基因表達的dsRNA的編碼DNA的引物如下：
[00巧]GFP-F: 5，- |TAATACGACTCACTATAG6G) GTGAGCAAGGGCGAGGAG-3，；
[0054] GFP-R: 5 > - jrAATACGACTCACTATAGGG) CATGATATAGACGTTGTGGCTGTT-3 > ;
[00巧]上述引物中，方框標註的區域為T7啟動子序列。
[0056] 5、合成序列表的序列13所示的雙鏈DNA分子，W合成的雙鏈DNA分子為模板，用 GFP-F和GFP-R組成的引物對進行PCR擴增，得到PCR擴增產物。
[0057] 6、取步驟5得到的PCR擴增產物，採用Ambion MEGAscriptT7Hi曲Yield Transcription Kit (產品目錄號為AM1334)並按試劑盒說明書進行體外轉錄，由於GFP-F 和GFP-R都具有T7啟動子，體外轉錄形成兩條反向互補的單鏈RNA分子，該兩條反向互補 的單鏈RNA分子自發形成雙鏈RNA分子（dsRNA-2 )。
[005引二、抑制AaDEFC基因表達的物質在促進登革熱病毒複製中的應用
[0059] 1、將埃及伊蚊分成兩組，分別進行如下處理：
[0060] 實驗組；每隻埃及伊蚊通過胸腔注射2微克dsRNA-1 ;
[0061] 對照組；每隻埃及伊蚊通過胸腔注射2微克dsRNA-2 ;
[0062] 2、完成步驟1的注射3天後，給埃及伊蚊接種登革熱2型病毒(每隻埃及伊蚊通過 胸腔注射劑量為lOMIDg。的DENV-2,注射體積為30化L)。
[006引 3、完成步驟2的接種6天後，提取埃及伊蚊的總RNA並反轉錄為cDNA，利用化qman RT-QPCR檢測埃及伊蚊體內的登革熱2型病毒量(採用Actin基因為內參)。
[0064] 用於檢測登革熱2型病毒的引物對如下：
[00巧]上遊引物；5, -CATTCCAAGTGAGAATCTCTTTGTCA-3,；
[0066] 下遊引物；5，-CAGATCTCTGATGAATAACCAACG-3，。
[0067] 用於檢測登革熱2型病毒的探針如下：
[0068] 5, -FAM-ATGCTGAAACGCGAGAGAAACCGC-TRAMA-3，。
[0069] 用於檢測Actin基因的引物對如下：
[0070] 上遊引物；5, -GAACACCCAGTCCTGCTGACA-3,；
[0071] 下遊引物；5, -TGCGTCATCTTCTCACGGTTAG-3,。
[0072] 用於檢測Actin基因的探針如下：
[0073] 5, -FAM-AGGCCCCGCTCAACCCGAAG-TRAMA-3，。
[0074] 埃及伊蚊體內的登革熱2型病毒的病毒量見圖2 (每個實也圓點代表一隻埃及伊 蚊)。
[00巧]結果表明，導入用於抑制AaDEFC基因表達的dsRNA-1後，埃及伊蚊體內的登革熱 2型病毒的病毒量出現明顯上升，即抑制AaDEFC基因表達可W促進登革熱2型病毒在埃及 伊蚊體內的複製，即AaDEFC基因可W抑制登革熱2型病毒在埃及伊蚊體內的複製。
[0076] 實施例3、抑制AaDEFD基因表達的物質在促進登革熱病毒複製中的應用
[0077] -、製備 dsRNA
[0078] 1、設計用於製備抑制AaDE抑基因表達的dsRNA的編碼DM的引物如下：
[0079] AaDE抑-F ; 5 > - |TAATACGACTCACTATAG6G| CATCATTCAATTCCACAAGCTC-3 > ;
[0080] AaDE抑-R ; 5' - |TAATACGACTCACTATAGGG| GATCATAATAACAATGCGGC-3 '。
[0081] 上述引物中，方框標註的區域為T7啟動子序列。
[0082] 2、提取埃及伊蚊的總RNA並反轉錄為cDNA，W cDNA為模板，用AaDE抑-F和 AaDE抑-R組成的引物對進行PCR擴增，得到PCR擴增產物。
[0083] 3、取步驟2得到的PCR擴增產物，採用Ambion MEGAscriptT7Hi曲Yield Transcription Kit (產品目錄號為AM1334)並按試劑盒說明書進行體外轉錄，由於 AaDE抑-F和AaDE抑-R都具有T7啟動子，體外轉錄形成兩條反向互補的單鏈RNA分子，該兩 條反向互補的單鏈RNA分子自發形成序列表的序列8所示的雙鏈RNA分子（dsRNA-3)。
[0084] 二、抑制AaDE抑基因表達的物質在促進登革熱病毒複製中的應用
[0085] 1、將埃及伊蚊分成兩組，分別進行如下處理：
[0086] 實驗組；每隻埃及伊蚊通過胸腔注射2微克dsRNA-3 ;
[0087] 對照組；每隻埃及伊蚊通過胸腔注射2微克實施例2的步驟一製備的dsRNA-2 ;
[0088] 2、完成步驟1的注射3天後，給埃及伊蚊接種登革熱2型病毒(每隻埃及伊蚊通過 胸腔注射劑量為lOMIDw的DENV-2,注射體積為30化L)。
[0089] 3、完成步驟2的接種6天後，提取埃及伊蚊的總RNA並反轉錄為cDNA，利用化qman RT-QPCR檢測埃及伊蚊體內的登革熱2型病毒量(採用Actin基因為內參)。
[0090] 用於檢測登革熱2型病毒的引物對如下：
[0091] 上遊引物；5, -CATTCCAAGTGAGAATCTCTTTGTCA-3,；
[0092] 下遊引物；5，-CAGATCTCTGATGAATAACCAACG-3，。
[0093] 用於檢測登革熱2型病毒的探針如下：
[0094] 5, -FAM-ATGCTGAAACGCGAGAGAAACCGC-TRAMA-3，。
[0095] 用於檢測Actin基因的引物對如下：
[0096] 上遊引物；5, -GAACACCCAGTCCTGCTGACA-3,；
[0097] 下遊引物；5, -TGCGTCATCTTCTCACGGTTAG-3,。
[0098] 用於檢測Actin基因的探針如下：
[0099] 5, -FAM-AGGCCCCGCTCAACCCGAAG-TRAMA-3'。
[0100] 埃及伊蚊體內的登革熱2型病毒的病毒量見圖2 (每個實也圓點代表一隻埃及伊 蚊)。
[0101] 結果表明，導入用於抑制AaDE抑基因表達的dsRNA-3後，埃及伊蚊體內的登革熱 2型病毒的病毒量出現明顯上升，即抑制AaDEFD基因表達可W促進登革熱2型病毒在埃及 伊蚊體內的複製，即AaDEFD基因可W抑制登革熱2型病毒在埃及伊蚊體內的複製。
[0102] 實施例4、AaDEFC蛋白在抑制病毒複製過程中的應用
[0103] 一、重組質粒 pMT-AaDEFC-V5-HisA 的構建
[0104] 1、提取埃及伊蚊的總RNA並反轉錄得到cDNA。
[010引 2、W步驟1得到的CDNA為模板，用F1和R1組成的引物對進行PCR擴增，得到PCR 擴增產物。
[0106] F1 ;5, -CGAAGATCTCTCCCAGAGGAACTGGCCG-3'；
[0107] R1 ; 5' -CAGACTCGAGATTTCGACAAACGCAAACCTTTTTC-3'。
[0108] 3、用限制性內切酶Bglll和化〇1雙酶切步驟2的PCR擴增產物，回收酶切產物。
[0109] 4、用限制性內切酶Bgln和趾〇1雙酶切質粒pMT/BiP/V5-HisA，回收約5000bp的 載體骨架。
[0110] 5、將步驟3的酶切產物和步驟4的載體骨架連接，得到重組質粒 pMT-AaDEFC-V5-HisA。根據測序結果，對重組質粒pMT-AaDEFC-V5-HisA進行結構描述如 下；在質粒pMT/BiP/V5-HisA的Bglll和化〇1酶切位點之間插入了序列表的序列2自5' 末端第70至297位核巧酸所示的雙鏈DNA分子。重組質粒中，插入的雙鏈DNA分子與載體 骨架上的部分DNA形成序列表的序列10所示的融合基因，表達序列表的序列9所示的融合 蛋白。
[0111] 序列表的序列9中，自N末端第1至18位胺基酸殘基為信號膚(成熟後被切除)，第 21至96位胺基酸殘基為AaDEFC成熟膚，第105至118位胺基酸殘基組成V5標籤，第122 至127位胺基酸殘基為6X化S標籤。序列表的序列9中，自N末端第19至127位胺基酸 殘基組成融合蛋白的成熟膚（由109個胺基酸殘基組成，分子量約11. 81KD)。
[0112] 6、藉助轉染試劑（Effectene Transfection Reagent,購自 Qiagen,產品目錄號 為301425)並按說明書進行操作，將重組質粒pMT-AaDEFC-V5-HisA轉入S2細胞，轉染2化 後用500mM濃度的化"（W化S〇4的形式加入)誘導4她（即28C靜置培養)，收集上清液並 採用Anti-V5鼠單克隆抗體（Anti-V5-tag mAb，購自MBL公司，產品目錄號為M167-3)作為 一抗進行Westernblot，圖譜見圖3 (發生了修飾，所W每個泳道顯示兩條帶)，可W觀察到 檢測到特異的陽性條帶。
[0113] 二、AaDEFC蛋白在抑制病毒複製中的應用
[0114] 1、實驗組的處理
[0115] (1)藉助轉染試劑（Effectene Transfection Reagent,購自 Qiagen,產品目錄號 為301425)並按說明書進行操作，將重組質粒pMT-AaDEFC-V5-HisA轉入S2細胞，轉染2化 後用500mM濃度的化"（W化S〇4的形式加入）誘導4她（即28C靜置培養)，收集上清液。
[0116] (2)在步驟（1)得到的上清液中加入登革熱2型病毒的病毒液，使登革熱2型病毒 的濃度為1〇中化/mL，28°C靜置賠育化。
[0117] (3)將2X 106個細胞/ml的Vero細胞的細胞液鋪6孔板，每孔2ml。
[0118] (4)將步驟（2)得到的溶液加入步驟（3)得到的6孔板，每孔lml，37°C靜置培養 3h，然後更換DMEM完全培養基(購自Life Technology,產品目錄號為11965-084)培養2化。
[0119] (5)完成步驟（4)後，吸棄上清，用抑7.4的PBS緩衝液清洗細胞一次，然後 採用RNA抽提試劑盒（AxyPrep總RNA小量製備試劑盒，購自Axygen,產品目錄號為 AP-MN-MS-RNA-250)提取總RNA，然後採用逆轉錄試劑盒（iScript cDNA Synthesis Kit 購 自Bio-Rad,產品目錄號為170-8890)進行逆轉錄得到cDNA，W cDNA為模板，利用"Tagman RT-QPCR檢測Vero細胞中登革熱2型病毒的病毒量(採用GADPH基因為內參)。
[0120] 用於檢測登革熱2型病毒的引物對如下：
[0121] 上遊引物；5, -CATTCCAAGTGAGAATCTCTTTGTCA-3,；
[0122] 下遊引物；5，-CAGATCTCTGATGAATAACCAACG-3，。
[0123] 用於檢測登革熱2型病毒的探針如下：
[0124] 5，-FAM-ATGCTGAAACGCGAGAGAAACCGC-TRAMA-3，。
[0125] 用於檢測GADPH基因的引物對如下：
[0126] 上遊引物；5' -GAAGGTGAAGGTCGGAGT-3' ；
[0127] 下遊引物；5，-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3，。
[012引用於檢測GADPH基因的探針如下：
[0129] 5' -FAM-CCGACTCTTGCCCTTCGA AC-TRAMA-3'。
[0130] 2、對照組的處理
[013。 用質粒pMT/BiP/V5-HisA代替重組質粒pMT-AaDEFC-V5-HisA，其它同步驟1。
[0132] 3、結果分析
[0133] 實驗組和對照組中，Vero細胞中登革熱2型病毒的病毒量見圖4 (進行H次重複 實驗，每次重複實驗中設置5個重複處理，結果取平均值)。結果表明，加入AaDEFC蛋白後， Vero細胞內的登革熱2型病毒的病毒量出現明顯下降，即AaDEFC蛋白可W抑制登革熱2型 病毒在Vero細胞中的複製。
[0134] 實施例5、AaDE抑蛋白在抑巧瞞毒複製過程中的應用
[0135] 一、重組質粒pMT-AaDE抑-V5-HisA的構建
[0136] 1、提取埃及伊蚊的總RNA並反轉錄得到cDNA。
[0137] 2、W步驟1得到的cDNA為模板，用巧和R2組成的引物對進行PCR擴增，得到PCR 擴增產物。
[0138] F2 ;5' -CGAAGATCTGCCTACCCACAGGAACCGG-3' ；
[0139] R2 ; 5 ' -CAGACTCGAGATTCCGGCAGACGCACACC-3'。
[0140] 3、用限制性內切酶Bglll和化〇1雙酶切步驟2的PCR擴增產物，回收酶切產物。
[014。 4、用限制性內切酶Bgln和趾01雙酶切質粒pMT/BiP/V5-HisA，回收約5000bp的 載體骨架。
[0142] 5、將步驟3的酶切產物和步驟4的載體骨架連接，得到重組質粒 pMT-AaDE抑-V5-HisA。根據測序結果，對重組質粒pMT-AaDE抑-V5-HisA進行結構描述如 下；在質粒pMT/BiP/V5-HisA的Bglll和化〇1酶切位點之間插入了序列表的序列4自5' 末端第58至294位核巧酸所示的雙鏈DNA分子。重組質粒中，插入的雙鏈DNA分子與載體 骨架上的部分DNA形成序列表的序列12所示的融合基因，表達序列表的序列11所示的融 合蛋白。
[0143] 序列表的序列11中，自N末端第1至18位胺基酸殘基為信號膚(成熟後被切除)， 第21至99位胺基酸殘基為AaDE抑成熟膚，第108至121位胺基酸殘基組成V5標籤，第 125至130位胺基酸殘基為6X化S標籤。序列表的序列11中，自N末端第19至130位氨 基酸殘基組成融合蛋白的成熟膚（由112個胺基酸殘基組成，分子量約12. 14KD)。
[0144] 6、藉助轉染試劑（Effectene Transfection Reagent,購自 Qiagen,產品目錄號 為301425)並按說明書進行操作，將重組質粒pMT-AaDE抑-V5-HisA轉入S2細胞，轉染2化 後用500mM濃度的CU" (W化S〇4的形式加入)誘導4她（即28C靜置培養)，收集上清液並 採用Anti-V5鼠單克隆抗體（Anti-V5-tag mAb，購自MBL公司，產品目錄號為M167-3)作為 一抗進行Westernblot，圖譜見圖3 (發生了糖基化修飾，所W每個泳道顯示兩條帶)，可W 觀察到檢測到特異的陽性條帶。
[0145] 二、AaDE抑蛋白在抑制病毒複製中的應用
[0146] 1、實驗組的處理
[0147] (1)藉助轉染試劑（Effectene Transfection Reagent,購自 Qiagen,產品目錄號 為301425)並按說明書進行操作，將重組質粒pMT-AaDE抑-V5-HisA轉入S2細胞，轉染2化 後用500mM濃度的化"（W化S〇4的形式加入）誘導4她（即28C靜置培養)，收集上清液。 [014引（2)在步驟（1)得到的上清液中加入登革熱2型病毒的病毒液，使登革熱2型病毒 的濃度為10中化/mL，28°C靜置賠育化。
[0149] (3)將2X 106個細胞/ml的Vero細胞的細胞液鋪6孔板，每孔2ml。
[0150] (4)將步驟（2)得到的溶液加入步驟（3)得到的6孔板，每孔lml，37°C靜置培養 3h，然後更換DMEM完全培養基(購自Life Technology,產品目錄號為11965-084)培養2化。
[0151] (5)完成步驟（4)後，吸棄上清，用抑7.4的PBS緩衝液清洗細胞一次，然後 採用RNA抽提試劑盒（AxyPrep總RNA小量製備試劑盒，購自Axygen,產品目錄號為 AP-MN-MS-RNA-250)提取總RNA，然後採用逆轉錄試劑盒（iScript cDNA Synthesis Kit 購 自Bio-Rad,產品目錄號為170-8890)進行逆轉錄得到cDNA，W cDNA為模板，利用hginan RT-QPCR檢測Vero細胞中登革熱2型病毒的病毒量(採用GADPH基因為內參)。
[0152] 用於檢測登革熱2型病毒的引物對如下：
[0巧3]上遊引物；5, -CATTCCAAGTGAGAATCTCTTTGTCA-3,；
[0154] 下遊引物；5，-CAGATCTCTGATGAATAACCAACG-3，。
[0155] 用於檢測登革熱2型病毒的探針如下：
[0156] 5，-FAM-ATGCTGAAACGCGAGAGAAACCGC-TRAMA-3，。
[0157] 用於檢測GADPH基因的引物對如下：
[0158] 上遊引物；5' -GAAGGTGAAGGTCGGAGT-3' ；
[0159] 下遊引物；5，-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3，。
[0160] 用於檢測GADPH基因的探針如下：
[0161] 5' -FAM-CCGACTCTTGCCCTTCGA AC-TRAMA-3'。
[0162] 2、對照組的處理
[0163] 用質粒pMT/BiP/V5-HisA代替重組質粒pMT-AaDE抑-V5-HisA，其它同步驟1。
[0164] 3、結果分析
[0165] 實驗組和對照組中，Vero細胞中登革熱2型病毒的病毒量見圖4 (進行H次重複 實驗，每次重複實驗中設置5個重複處理，結果取平均值)。結果表明，加入AaDE抑蛋白後， Vero細胞內的登革熱2型病毒的病毒量出現明顯下降，即AaDEFD蛋白可W抑制登革熱2型 病毒在Vero細胞中的複製。
【權利要求】
1. AaDEF蛋白或具有所述AaDEF蛋白的融合蛋白；所述AaDEF蛋白為如下（a)或（b)或 (c)或（d)或（e): (a) 由序列表的序列1自N端第24至99位氣基酸殘基組成的蛋白質； (b) 由序列表的序列1所示的胺基酸序列組成的蛋白質； (c) 由序列表的序列4自N端第20至98位氣基酸殘基組成的蛋白質； (d) 由序列表的序列4所示的胺基酸序列組成的蛋白質； (e) 將（a)或（b)或（c)或（d)經過一個或幾個胺基酸殘基的取代和/或缺失和/或添 加且具有抗菌肽功能的由其衍生的蛋白質。
2. 如權利要求1所述的融合蛋白，其特徵在於：所述融合蛋白為如下（f)或（g)或（h) 或（i )或（j ): (f) 由序列表的序列9自N端第19至127位氣基酸殘基組成的蛋白質； (g) 由序列表的序列9所不的氣基酸序列組成的蛋白質； (h) 由序列表的序列11自N端第19至130位氣基酸殘基組成的蛋白質； (i) 由序列表的序列11所示的胺基酸序列組成的蛋白質； (j )將（f)或（g)或（h)或（i )經過一個或幾個胺基酸殘基的取代和/或缺失和/或添 加且具有抗菌肽功能的由其衍生的蛋白質。
3. 編碼權利要求1所述AaDEF蛋白的基因或編碼權利要求1所述融合蛋白的基因。
4. 如權利要求3所述的基因，其特徵在於：編碼權利要求1所述AaDEF蛋白的基因為 如下（1)或（2)或（3)或（4)或（5)或（6)或（7)或（8)所述的DNA分子： (1) 序列表的序列2自5'末端第70至297位核苷酸所示的DNA分子； (2) 序列表的序列2所不的DNA分子； (3) 序列表的序列3所不的DNA分子； (4) 序列表的序列5自5'末端第58至294位核苷酸所不的DNA分子； (5) 序列表的序列5所示的DNA分子； (6) 序列表的序列6所示的DNA分子； (7) 在嚴格條件下與（1)或（2)或（3)或（4)或（5)或（6)限定的DNA序列雜交且編碼 具有抗菌肽功能的蛋白的DNA分子； (8) 與（1)或（2)或（3)或（4)或（5)或（6)或（5)或（6)限定的DNA序列至少具有90% 以上同源性且編碼具有抗菌肽功能的蛋白的DNA分子。
5. 如權利要求3所述的基因，其特徵在於：編碼權利要求1所述融合蛋白的基因為如 下（9)或（10)或（11)或（12)或（13)或（14)所述的DNA分子： (9) 序列表的序列10自5'末端第55至381位核苷酸所不的DNA分子； (10) 序列表的序列10所不的DNA分子； (11) 序列表的序列12自5'末端第55至390位核苷酸所不的DNA分子； (12) 序列表的序列12所不的DNA分子； (13) 在嚴格條件下與（9)或（10)或（11)或（12)限定的DNA序列雜交且編碼具有抗菌 肽功能的蛋白的DNA分子； (14) 與（9)或（10)或（11)或（12)限定的DNA序列至少具有90%以上同源性且編碼具 有抗菌肽功能的蛋白的DNA分子。
6. 含有權利要求3或4或5所述基因的表達盒、重組載體、轉基因細胞系或重組菌。
7. -種抑制微生物增殖和/或複製和/或感染的產品，包括權利要求1所述AaDEF蛋 白或權利要求1所述融合蛋白。
8. 權利要求1所述AaDEF蛋白或權利要求1所述融合蛋白在製備試劑盒中的應用；所 述應試劑盒的功能為抑制微生物增殖和/或複製和/或感染。
9. 權利要求1所述AaDEF蛋白或權利要求1所述融合蛋白的應用；所述應用為抑制微 生物增殖和/或複製和/或感染。
【文檔編號】A61K38/17GK104513302SQ201310459570
【公開日】2015年4月15日 申請日期:2013年9月29日 優先權日:2013年9月29日
【發明者】程功, 肖小平 申請人:清華大學