染料木素‑維生素E琥珀酸酯‑聚乙二醇1000維生素E琥珀酸酯納米膠束的製備方法與流程

2023-06-25 08:14:36

本發明屬於藥品製劑技術領域，具有涉及一種染料木素-維生素e琥珀酸酯-聚乙二醇1000維生素e琥珀酸酯納米膠束的製備方法。

背景技術：

染料木素(4′,5,7-三羥基異黃酮，genistein，gen)，又名染料木黃酮、金雀異黃酮，淡黃色至淺褐色粉末，是一種植物雌激素，存在於人及動物食用的各種植物中，尤其在大豆、三葉草、苜蓿、燕麥、大麥、黑麥、小麥、玉米中含量較高。廣泛的流行病學動物研究和體外實驗表明，gen對癌症、心血管疾病、骨質疏鬆和絕經後症狀等有一定的療效。目前gen膠囊作為i類新藥已經進入臨床ii期研究，然而gen具有低溶解性，高滲透性，在生物藥劑學分類系統中屬染料木素-維生素e琥珀酸酯-聚乙二醇1000維生素e琥珀酸酯納米膠束於bcsii，水中的溶解度很低，只有0.13μg/ml(37℃)，口服生物利用度較低。

目前尚無關於改善gen水溶性與生物利用度方法的報導，因此解決gen在水中溶解度低以及提高gen的生物利用度成為亟待解決的問題。

技術實現要素：

為了解決染料木素在水中溶解度低以及提高其生物利用度，本發明利用復配表面活性劑的原理，以聚乙二醇1000維生素e琥珀酸酯(tpgs)和天然維生素e琥珀酸酯(ves)製備gen-ves-tpgs納米膠束，gen的口服生物利用度得到顯著的提高，且膠束粒徑小，穩定性高。

本發明解決技術問題所採用的技術方案為：

染料木素-維生素e琥珀酸酯-聚乙二醇1000維生素e琥珀酸酯納米膠束的製備方法，具體操作方法為：

稱取染料木素、天然維生素e琥珀酸酯、聚乙二醇1000維生素e琥珀酸酯，加入無水乙醇中超聲溶解，35-45℃減壓旋轉蒸發除去溶劑，加入磷酸鹽緩衝液，在45-55℃的條件下攪拌水化2-5h，然後於4℃，離心，上清液經過細胞粉碎儀破碎，微孔濾膜濾過，濾液即為澄清透明的gen-ves-tpgs納米膠束。

由於使用pbs水化較水作為水化溶劑形成的膠束具有更好的澄明度及更小的粒徑，因此水化時採用pbs為溶劑。

作為優選，所述染料木素、天然維生素e琥珀酸酯、聚乙二醇1000維生素e琥珀酸酯和無水乙醇的質量比為3-5:10-25:50-125:4。

作為優選，所述的磷酸鹽緩衝液的加入量為1.7-3.3ml/mg染料木素。

作為優選，所述的磷酸鹽緩衝液的ph為7.1-7.3。

作為優選，所述的離心操作的轉速為10000r/min，離心時間為10min。

作為優選，所述的微孔濾膜的孔徑為0.2-0.3μm。

聚乙二醇1000維生素e琥珀酸酯(tpgs)是由天然維生素e琥珀酸酯(ves)的羧基與聚乙二醇(peg)酯化而成，hlb值約為13～17，具有良好的兩親性和較好的水溶性，無明顯的生殖毒性，是一種安全的輔料。由於tpgs的兩親性以及良好的水溶性，在藥物傳遞系統中有著廣泛的應用，在製備膠束時，隨著tpgs在水中濃度變化可得到各向同性的球狀、圓筒狀、正反六角形、反球狀膠束。tpgs與其他表面活性劑相比，其生育酚酯的結構具有較好的抗氧化性，更有助於增加製劑的穩定性。

本發明的有益效果為：

本發明以聚乙二醇1000維生素e琥珀酸酯為表面活性劑，採用天然維生素e琥珀酸酯復配，製備出粒徑、zeta電位大小合適的gen-ves-tpgs納米膠束，所製備gen-ves-tpgs納米膠束澄明度好，平均粒徑為(43.50±1.65)nm，包封率為(98.99±0.69)％，載藥量為(2.57±0.04)％；膠束呈球形，可見明顯的囊泡結構，gen原料藥和納米膠束在體外均呈現緩釋特徵；大鼠ig藥動學結果顯示，所構建的gen納米膠束生物利用度為gen原料藥的162.96％。

附圖說明

圖1為gen-ves-tpgs納米膠束粒徑分布和tem圖。

圖2為gen-ves-tpgs膠束和gen原料藥釋藥曲線圖。

圖3為大鼠口服gen原料藥與gen-ves-tpgs納米膠束後時間-血藥濃度曲線。

具體實施方式

為了使本發明的目的、技術方案及優點更加清楚明白，以下結合實施例對本發明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發明，並不用於限定本發明。

實施例1

採用薄膜分散法製備gen-ves-tpgs納米膠束：精密稱取6mggen、30mgves、200mgtpgs適量，加入10ml無水乙醇超聲溶解，40℃減壓旋轉蒸發除去溶劑，加入15ml的磷酸鹽緩衝液(pbsph7.2)，在50℃的條件下攪拌水化3h，然後於4℃，10000r/min離心10min，上清液經過細胞粉碎儀破碎，0.22μm微孔濾膜濾過，濾液即為澄清透明的gen-ves-tpgs納米膠束。

採用透射電子顯微鏡(tem)觀察納米膠束粒子形態，取適量的納米膠束溶液滴加在銅網上，用濾紙在邊緣吸去多餘的納米膠束，然後滴加1％的醋酸雙氧鈾負染，自然晾乾後觀察膠束粒子形態，見圖1。在最終的處方工藝下所製備的納米膠束的平均粒徑為(43.50±1.65)nm，多分散係數為0.17±0.04，zeta電位為(-30.33±1.55)mv，表明所製備的納米膠束粒徑大小合適，粒徑均一，表面呈負電荷，膠束形態完整，呈球形，分布均勻，可見明顯的囊泡結構。

實施例2

採用薄膜分散法製備gen-ves-tpgs納米膠束：精密稱取8mggen、20mgves、210mgtpgs適量，加入10ml無水乙醇超聲溶解，35℃減壓旋轉蒸發除去溶劑，加入13.6ml的磷酸鹽緩衝液(pbsph7.1)，在55℃的條件下攪拌水化2h，然後於4℃，10000r/min離心10min，上清液經過細胞粉碎儀破碎，0.22μm微孔濾膜濾過，濾液即為澄清透明的gen-ves-tpgs納米膠束。

實施例3

採用薄膜分散法製備gen-ves-tpgs納米膠束：精密稱取10mggen、50mgves、180mgtpgs適量，加入10ml無水乙醇超聲溶解，45℃減壓旋轉蒸發除去溶劑，加入33ml的磷酸鹽緩衝液(pbsph7.3)，在45℃的條件下攪拌水化5h，然後於4℃，10000r/min離心10min，上清液經過細胞粉碎儀破碎，0.22μm微孔濾膜濾過，濾液即為澄清透明的gen-ves-tpgs納米膠束。

gen-ves-tpgs納米膠束包封率的測定

採用高速離心法(10000r/min，10min，4℃)除去膠束中的游離藥物，上清液經過細胞粉碎儀破碎，0.22μm微孔濾膜濾過，濾液即為載藥膠束。分別取1ml離心前的膠束溶液和載藥膠束溶液，加入適量的無水乙醇，超聲破壞膠束結構後，稀釋至10ml，精密吸取0.1ml用無水乙醇稀釋至10ml，0.22μm微孔濾膜濾過，測定膠束中gen的量，計算包封率；同時將載藥膠束溶液在-80℃冰箱中預凍24h後，取出，放入凍幹機凍幹12h後(真空度＜10pa)取出，得到膠束凍幹品。稱取一定量的膠束凍幹品，加入無水乙醇超聲溶解破壞，測定gen的量，計算載藥量。

包封率＝納米膠束中gen量/gen的投藥量

載藥量＝凍幹膠束中gen量/凍幹膠束的質量

不同的藥物-載體比例對gen-ves-tpgs納米膠束包封率、載藥量、平均粒徑、zeta電位的影響見表1：

表1：

從表1中可以看出：膠束的包封率及載藥量隨著ves用量的增加先增加後降低，在此基礎上固定ves與tpgs的量，考察不同藥物-載體比例下膠束的包封率、載藥量、平均粒徑、zeta電位，結果見表1。當藥物-載體比例為3∶115時膠束的包封率接近99％，膠束澄明度好，未離心出遊離藥物，載體基本能將投入的gen全部包封。隨著藥物-載體比例增大，膠束包封率一直下降，在藥物-載體比為4∶115時，水化後的膠束中有明顯可見不溶性藥物及載體析出，隨著藥物-載體比例增大，水化後的膠束中游離藥物與載體逐漸增加，當藥物-載體比例為6∶115時，膠束的包封率僅為(50.56±0.81)％。5個不同藥物-載體比例下的膠束載藥量接近，可知在水化體積一定時形成的載藥膠束中藥物濃度基本固定，膠束疏水內核中的藥物基本飽和，無法再進一步包封更多的藥物進去。

體外釋藥行為考察

選擇gen原料藥作為對照，精密稱取30mg的gen原料藥，精密加入3ml無水乙醇，超聲溶解，精密移取0.5ml，用pbs(ph7.2±0.1)定容至10ml，形成0.5mg/ml的gen混懸液[14]。稱取含有5mggen的納米膠束凍幹品，加入pbs溶脹後，定容到10ml，得到含gen0.5mg/ml的納米膠束溶液。分別吸取2ml的gen混懸液與納米膠束溶液放入處理好的透析袋中，兩端紮緊。將透析袋置於50ml釋放介質中(ph7.2±0.1的pbs，含2％聚山梨酯-80)。原料藥組和膠束組分別平行3組，於(37.0±0.5)℃恆溫水浴振蕩(50r/min)。分別於0.25、0.5、1、2、4、6、8、10、12、24、36、48、60、72、84、96h取1ml含藥釋放介質，同時補加同溫1ml空白釋放介質，經0.22μm微孔濾膜濾過，續濾液採用高效液相色譜項方法測定gen量，具體測試條件為：c18色譜柱(250mm×4.6mm，5μm)，流動相為甲醇-水(60∶40)，體積流量1.0ml/min，檢測波長260nm，柱溫28℃，進樣量10μl，理論塔板數不低於2800。累積釋放曲線見圖2。結果表明gen原料和納米膠束在體外均呈現緩釋特徵，由於被膠束包裹，納米膠束緩釋效果比原料藥明顯。

藥物代謝動力學研究

gen原料藥組和膠束組各6隻sd大鼠，分別ig給予gen0.5％cmc-na混懸液和gen凍幹膠束pbs復溶液，給藥量為65mg/kg。分別在ig給藥後5、10、20、30、40min及1、2、3、5、8、12、24h經過眼眶取血0.6ml，8000r/min離心10min，吸取300μl血漿，加入800μl醋酸乙酯，渦旋1min，離心，吸取上清液，下層液體再加入400μl醋酸乙酯，渦旋1min，離心，吸取上層液體合併到第1次萃取液中，40℃水浴下氮氣吹乾，加入100μl無水乙醇，超聲，渦旋混勻後離心，吸取上清液至微量進樣管中，經hplc分析，測定gen的血藥濃度。

藥動學標準曲線的繪製：精密稱取gen對照品10.6mg，用無水乙醇稀釋得到質量濃度分別為2.544、1.02、0.407、0.163、0.065、0.026μg/ml的gen對照品溶液，按hplc法測定，以峰面積為縱坐標(y)，gen質量濃度為橫坐標(x)繪製標準曲線，標準曲線方程為y＝61370x+2.3802，線性範圍為0.026～2.544μg/ml，r＝0.9996，線性關係良好。

gen混懸液與gen-ves-tpgs納米膠束的血藥濃度-時間曲線見圖3，從圖3可以看出：將gen製備成gen-ves-tpgs納米膠束後在大鼠體內的生物利用度有較大提高。

以上僅列舉了本發明的優選實施方案，本發明的保護範圍並不限制於此，本領域技術人員在本發明權利要求範圍內所作的任何改變均落入本發明保護範圍內。