NF－κB檢測雙鏈DNA微陣列晶片及製備的製作方法

2023-06-25 08:14:41 3

專利名稱：NF－κB檢測雙鏈DNA微陣列晶片及製備的製作方法
技術領域：
本發明是在基礎分子生物學及生物醫學領域中，提出了一種新的高通量檢測重要轉錄因子NF-κB的技術手段，即NF-κB檢測dsDNA微陣列晶片，並闡明了其各種製備方法；運用本發明提出的各種製備方法所製備的NF-κB檢測dsDNA微陣列晶片，在研究基因表達調控中轉錄因子NF-κB與其DNA結合靶點的相互作用規律、高通量檢測細胞核內各種NF-κB的表達及活化、篩選NF-κB DNA靶點結合藥物性小分子及NF-κB/DNA相互作用幹擾性藥物性小分子等重要基礎分子生物學及生物醫學領域中，具有重要的應用價值。
背景技術：
核因子κB(Nuclear Factor kappaB，NF-κB)是一類序列特異性轉錄因子，當細胞受到炎症介質、病毒感染、氧化應激等多種物質刺激後，NF-κB在胞質內被激活，進入細胞核與病毒(HIV，Adenovirus，HSV，SIV，SV-40，EBV)、細胞因子(IFN，TNF，IL-1，IL-2，IL-6，IL-8，IL-10，IL-11，IL-12，IL-13)、生長因子(G-CSF，GM-CSF，EPO，M-CSF，VEGF C)、細胞粘附分子(ELAM-1，ICAM-1，VCAM-1，MadCAM-1，Endoglin)、急性相反應蛋白(Angiotensinogen，beta-defensin-2，Tissue factor-1，Pentraxin PTX3，Complement factor C4)、酶(ADH，Lysozyme，PIM-1，Serpin 2A，Gelatinase B，GD3-synthase)等基因增強子序列結合，增強基因轉錄；因而在一系列由細胞因子、炎症介質及蛋白酶類參與的疾病的發病過程中發揮重要作用。大量研究表明NF-κB過度活化與炎症、血管疾病、腫瘤、病毒感染、腦血管疾病、阿爾茨海默病、帕金森氏病、過敏性腦炎、感染性休克、風溼性關節炎、支氣管哮喘、動脈粥樣硬化、潰瘍性結腸炎等病理過程存在非常密切的關係。目前，NF-κB已成為新藥開發的重要靶點，許多生物和生化抑制劑能夠阻斷NF-κB信號通路或抑制NF-κB/DNA結合，從而有助於NF-κB相關疾病的治療。NF-κB是一類序列特異性轉錄因子，其生理作用的發揮依賴於在細胞質內活化的NF-κB進入細胞核，與其調控的靶基因調控區NF-κB特異性結合增強子DNA序列結合，從而啟動或增強NF-κB調控靶基因的表達。因此，篩選抑制NF-κB作用的最佳部位是NF-κB與DNA的相互結合作用，只要能夠封閉或幹擾NF-κB與DNA的相互結合作用，就能夠有效地抑制NF-κB作用。要實現對NF-κB與DNA的相互作用幹擾性藥物性分子的篩選，建立高通量NF-κB與DNA相互作用分析技術是必須的。
NF-κB與DNA的相互作用是發生在基因表達調控中的生物大分子特異性識別、結合反應，這種生物大分子反應是介於生物大分子dsDNA(double-stranded DNA，dsDNA)與序列特異性DNA結合蛋白(sequence-specific DNA-binding protein)之間，是通過NF-κB蛋白質上特定的胺基酸和DNA上特定的鹼基間形成氫鍵、範德華力等化學鍵而產生的。在傳統分子生物學中，用來研究DNA與NF-κB等序列特異性DNA結合蛋白相互作用的常規方法主要有硝酸纖維素結合分析(Nitrocellulose-binding Assays)、凝膠遷移實驗(Gel Mobility-shift Analysis)、酶聯免疫吸附分析(ELISA)、Southwestern印記(Southwestern blotting)、報告構體(ReporterConstruct)，染色體免疫沉澱(Chromatin Immunoprecipitation，ChIP)，噬菌體展示(PhageDisplay)，結合位點籤名(Binding-site Signatures)，體外選擇(in-vitro selection)，紫外交聯(UV Crosslinking)，甲基化幹擾分析(Methylization Interfenng Assay)，X-射線晶體衍射(X-ray Crystallography)，原子力顯微鏡(Atomic Force microscopy，AFM)，表面激元共振(Surface Plasmon Resonance，SPR)，毛細管電泳(Capillary Electrophoresis，CE)，掃描力顯微鏡(Scanning Force Microscopy，SFM)，脫氧核糖核酸酶足跡法(DNaseI footprinting)，螢光足跡法(Fluorescence Footprinting)，螢光各向異性(Fluorescence Anisotropy)，螢光共振能量傳遞(Fluorescence Resonance Energy Transfer，FRET)等，這些技術方法能夠非常有效地反應DNA/NF-κB等序列特異性DNA結合蛋白相互作用的某一方面的特徵，至今在實驗研究中發揮重要作用；但這些方法都存在對實驗樣品消耗多、實驗耗時長、分析效率低或存在放射性標記對實驗人員及環境的危害等缺點，而且難以高通量獲取DNA/NF-κB相互作用的信息。因此建立一種高通量的序列特異性DNA/NF-κB相互作用的研究方法是非常重要的。目前還沒有非常有效的技術工具進行NF-κB與DNA的相互結合作用分析，以及NF-κB與DNA的相互作用幹擾性分子篩選，特別是高通量的技術手段，但NF-κB與DNA的相互作用幹擾性分子篩選在基礎分子生物學研究，特別是發現和尋找NF-κB相關疾病生物醫藥候選藥物方面具有重要價值。要實現高通量NF-κB與DNA的相互結合作用分析及NF-κB與DNA的相互作用幹擾性分子篩選，就必須進行研究技術的創新，我們長期從事研究的生物晶片技術為解決這一問題提供了契機。
生物晶片是指在固相支持物上組裝的核酸、蛋白質、細胞、微小組織等生物活性物質構成的微陣列。應用生物晶片可實現對待檢樣品中目標核酸分子、蛋白質分子、細胞、微小組織等物質的有無及多少進行準確、快速、大信息量檢測。具有微型化、高通量和自動化的檢測特徵。生物晶片在生物檢測、醫學檢測及疾病診斷、藥物篩選和基因序列分析上有著極其重要的應用價值意義，因此受到廣泛關注和投資，使其已經成為一個全球性的新型產業，即生物晶片產業。目前，從構成上來說，基因晶片和蛋白質晶片分別由單鏈DNA寡核苷酸分子和蛋白質分子構成，因此基因晶片只能依靠核酸分子之間的雜交檢測經核酸擴增後的樣品中目標單鏈DNA分子的有無及多少，蛋白質晶片主要通過蛋白質與樣品中靶蛋白分子的識別及結合檢測靶蛋白分子的有無及多少。因此基因晶片不能檢測蛋白質，蛋白質晶片也難於檢測DNA，這限制了運用DNA晶片直接對DNA結合蛋白質的檢測，而DNA與DNA結合蛋白質的識別及相互作用在基因組穩定性維持及基因的表達調節中發揮極其重要的作用，如序列特異性轉錄因子NF-κB在基因表達調控中與其受控基因調節區DNA位點間的相互作用。因此要使用生物晶片實現對DNA與DNA結合蛋白質，如NF-κB的相互作用分析和DNA/NF-κB相互作用幹擾性分子的篩選，就必須突破基因晶片和蛋白質晶片在製備上的思想束縛，基於DNA與DNA結合蛋白相互作用的生物學原理進行高通量生物晶片的研製。
雙鏈核酸微陣列晶片是一種生物晶片。雙鏈核酸微陣列晶片能夠克服單鏈核酸微陣列不能檢測蛋白質的缺陷，因為DNA結合蛋白常常識別和結合的是dsDNA，籍此在基因的表達調控中發揮重要作用。雙鏈核酸微陣列晶片的製備是這種晶片應用的關鍵。Lockhart等最早在1996年就提出在固相介質上製備dsDNA探針分子的方法(US patent No.5,556,752)，其基本方法是將兩段鹼基互補的寡核苷酸運用連接分子連接在一起，將一段固定到固相介質上，通過退火使兩段鹼基互補的寡核苷酸復性，形成帶有突環的雙鏈核酸單分子，用於檢測DNA結合生物分子；Lockhart在這一研究中的重要貢獻是最早將DNA微陣列技術引入到高通量檢測DNA/蛋白質相互作用的研究領域，但他提出的dsDNA陣列製備方法在應用中卻存在嚴重的技術和經濟問題，其dsDNA陣列製備技術若藉助光導向原位DNA微陣列合成技術，則不僅合成的全長dsDNA數量極少，使大部分合成寡核苷酸為殘缺(truncated molecules)分子，嚴重幹擾檢測反應，而且生產成本非常高昂；若藉助基因晶片點樣法完成，則生產成本更加高昂。Bulyk等在1999年提出了用核酸聚合酶引物延伸的辦法將ssDNA微陣列轉變為dsDNA微陣列方法，並申報了美國專利(US.Pat.6326489)。這一方法首先在玻片上通過Affymetrix光導向原位合成ssDNA微陣列，該微陣列的每條寡核苷酸靠近玻片的3′端含有長16個鹼基的通用(constant)引物退火序列，ssDNA微陣列與通用引物退火後，進行聚合酶引物延伸反應，合成第二鏈核酸，從而形成dsDNA微陣列。這一方法的優點是能利用DNA微陣列原位合成技術製備高密度dsDNA微陣列；但這一方法同樣存在嚴重的經濟和技術問題，在技術上它依賴於光刻掩膜原位DNA微陣列合成專利技術，但固相基質表面的單鏈寡核苷酸合成的效率不高，每個核苷酸的合成效率在92～96％，這樣合成一個40鹼基長的寡核苷酸，則只有4～20％的寡核苷酸達到要求的40鹼基長度，因此，以光刻掩膜原位合成技術製備的ssDNA及dsDNA微陣列嚴重地受到殘缺截短分子(truncated molecules)的汙染。眾多競爭性殘缺截短分子將可能強烈抑制和誤導蛋白質結合實驗；並且沒有理由相信光刻掩膜原位合成的單鏈寡核苷酸微陣列上的每個寡核苷酸都可以被引物寡核苷酸結合，這樣就會使一部分40鹼基全長寡核苷酸不能被轉換雙鏈核酸，這不但進一步降低了晶片上理想雙鏈核酸探針的數量，而且那些未被轉換為雙鏈的單鏈寡核苷酸同樣會抑制和誤導蛋白質結合實驗。另外，這一方法製備的dsDNA微陣列是雙分子(bimolecular)dsDNA微陣列，存在探針穩定性問題，即雙分子dsDNA受到結合、洗片等實驗環節的影響，會發生雙鏈解鏈而喪失探針功能；而且這種雙分子dsDNA微陣列只能使用一次，因此其使用效率極低。由於這一方法製備的dsDNA微陣列依賴目前非常昂貴的光刻掩膜原位DNA微陣列合成專利技術，加之這一方法本身的專利保護，使其不僅應用成本非常昂貴，而且不能在我國進行商業開發應用。
dsDNA微陣列晶片是進行高通量DNA/蛋白質相互作用研究的重要技術，這種晶片已經證明能夠非常有效地用於序列特異性DNA/蛋白質相互作用的研究，可高效分析生物分子結合相互作用(binding interaction)。我們在2000年就認識到dsDNA微陣列晶片研究的重要價值，並開始著手研發能夠高通量檢測序列特異性DNA/蛋白質相互作用的dsDNA微陣列晶片。在中國博士後科學基金(2001)和國家自然科學基金(60201005)的資助下，至今已經建立了兩種高效製備高性能dsDNA微陣列晶片的專利技術(中國專利申請號02112780.8；02137945.9)。我們的研究成果已經受到國內外學者的關注，有關論文發表在國際刊物Nanotechnology、Molecules、Analytical Biochemistry、Journal of Biochemical and BiophysicalMethods上；研究成果在2002年參加三次國際學術會議，並在清華大學、北京生物晶片技術國家工程研究中心、科技部、教育部和國家自然科學基金委員會主辦的「2002年國際生物晶片論壇」會議上獲得唯一的Poster獎勵。我們的研究表明運用我們的兩項專利技術，不僅可以高效地製備性能良好的單分子(unimolecular)dsDNA微陣列晶片，而且製備的可檢測多種疾病相關轉錄因子NF-κB(Nuclear Factor κB)的「點突變單分子dsDNA微陣列晶片」，可以靈敏地定量檢測細胞核抽提物中NF-κB蛋白的數量、測定DNA/NF-κ3相互作用的序列特異性和親合性、確定DNA/NF-κB相互作用中鹼基和胺基酸的鍵合(base-amino acid contacting)。我們設計的「單分子dsDNA微陣列晶片」製備方法與國內外基因晶片點樣製備技術完全兼容，而且在應用中與基因表達晶片的反應、檢測設備完全兼容，提高了晶片使用的簡便性。我們的方法尤其適宜製備最具應用價值的「點突變單分子dsDNA微陣列晶片」，這種晶片在研究DNA/蛋白質相互作用中鹼基和胺基酸的接觸規律、預測基因組中蛋白質結合位點和構建基因表達調控網絡非常有效。我們已經研究了「單分子dsDNA微陣列晶片」在篩選組合化學分子和天然藥物分子的應用，這一研究在生物醫學上具有重要應用價值。
基於我們已經進行的深入研究，我們提出本專利申請的「NF-κB檢測dsDNA微陣列晶片及製備」專利晶片產品及晶片產品生產技術。

發明內容
(1)發明目的本發明的目的是提供一種檢測轉錄因子NF-κB蛋白的生物晶片，即NF-κB檢測dsDNA微陣列晶片，便於充分利用生物晶片能夠高通量檢測目標分子、高效獲取生物信息的特點，依靠目前已經商業化應用的微陣列晶片(如基因晶片、蛋白質晶片、DNA晶片等)微點樣製備儀器(如arrayer)及螢光標記檢測儀器(如scanner)，建立一種高通量檢測轉錄因子NF-κB蛋白的技術平臺，實現對多種疾病相關轉錄因子NF-κB在特定細胞或組織中表達及活化水平的測定、各種NF-κB蛋白與其受控基因調節區DNA靶點相互作用規律的分析、基因組中潛在NF-κB蛋白結合位點的篩選鑑定、NF-κB蛋白基因表達調控網絡構建、NF-κB蛋白DNA靶點特異性結合小分子篩選和NF-κB/DNA相互作用幹擾性小分子篩選等，這些研究將對NF-κB蛋白相關分子生物學及生物醫學研究產生重要影響。
(2)技術方案本發明採用多種技術方法在固相支持物表面製備NF-κB檢測DNA微陣列，並將其用於多種NF-κB蛋白相關的分子生物學及生物醫學研究。
(2.1)NF-κB檢測DNA微陣列晶片的製備包括如下9種技術方法①雙分子寡核苷酸復性點樣法步驟1固相化學合成兩條鹼基序列完全互補的寡核苷酸(如圖21-1c，2-2c，3-3c，4-4c)，其中寡核苷酸上嵌合NF-κB結合位點；
步驟2兩寡核苷酸液相復性(圖2A，Aannealing)；步驟3雙鏈寡核苷酸點樣連接到固相基質表面(圖2I，Iimmobilizing)。
②雙分子寡核苷酸點樣復性法步驟1固相化學合成兩條鹼基序列完全互補的寡核苷酸(如圖31-1c，2-2c，3-3c，4-4c)，其中寡核苷酸上嵌合NF-κB結合位點；步驟2將化學修飾的寡核苷酸點樣連接到固相基質表面(圖3I)；步驟3互補寡核苷酸雜交復性(圖3A)。
③雙分子寡核苷酸通用引物點樣復性延伸法步驟1固相化學合成兩條寡核苷酸，其中一條較長寡核苷酸上嵌合NF-κB結合位點(如圖41，2，3，4)，另一條較短的寡核苷酸作為通用引物(圖4 CP，CPconstantprimer)；步驟2將化學修飾的較長的寡核苷酸點樣連接到固相基質表面(圖4I)；步驟3通用引物寡核苷酸雜交復性(圖4A)；步驟4DNA聚合酶在片延伸反應(圖2E，Eelongating)。
④雙分子寡核苷酸通用引物復性點樣延伸法步驟1固相化學合成兩條寡核苷酸，其中一條較長寡核苷酸上嵌合NF-κB結合位點(如圖51，2，3，4)，另一條較短的寡核苷酸作為通用引物(圖5 CP)；步驟2化學修飾的寡核苷酸與通用引物寡核苷酸在液相雜交復性(圖5A)；步驟3復性產物點樣連接到固相基質表面(圖5I)；步驟4DNA聚合酶在片延伸反應(圖5E)。
⑤雙分子寡核苷酸通用引物復性延伸點樣法步驟1固相化學合成兩條寡核苷酸，其中一條較長寡核苷酸上嵌合NF-κB結合位點(如圖61，2，3，4)，另一條較短的寡核苷酸作為通用引物(圖6 CP)；步驟2化學修飾的寡核苷酸與通用引物寡核苷酸在液相雜交復性(圖6A)；步驟3DNA聚合酶延伸反應(圖6E)；步驟4延伸反應點樣連接到固相基質表面(圖2I)。
⑥單分子鏈內互補法步驟1固相化學合成一條長寡核苷酸，使寡核苷酸含有兩段鏈內反向互補序列，且反向互補序列內含有NF-κB結合位點(如圖71，2，3，4)；步驟2寡核苷酸點樣連接固定到固相基質表面(或寡核苷酸變性再復性)(圖7I)；步驟3寡核苷酸微陣列變性再復性(寡核苷酸點樣連接固定到固相基質表面)(圖7A)。
⑦單分子點樣復性發卡引物延伸法步驟1固相化學合成一條較短的寡核苷酸，使寡核苷酸含有NF-κB結合位點，並且在其3′端(羥基)含有兩段鏈內反向互補序列(如圖81，2，3，4)；步驟2寡核苷酸點樣連接固定(5′端)到固相基質表面(圖8I)；步驟3寡核苷酸微陣列變性再復性(圖8A)；
步驟4DNA聚合酶在片延伸反應(圖8E)。
⑧單分子復性連接點樣發卡引物延伸法步驟1固相化學合成兩條寡核苷酸，使其中寡核苷酸1含有NF-κB結合位點，並且在其磷酸化的3′端含一段核苷酸序列，該段核苷酸能夠與寡核苷酸2的3′端一段核苷酸序列互補(如圖91，2，3，4)；寡核苷酸2在5′端含有兩段鏈內反向互補序列，且兩段鏈內反向互補序列間有一個或多個C3dT氨基或其他化學修飾基團(圖9 CP)；步驟2兩條寡核苷酸在液相內復性(圖9A)；步驟3復性產物進行DNA連接酶連接反應(圖9L，Lligating)；步驟4復性產物點樣連接(C3dT氨基或其他化學修飾基團)到固相基質表面(圖9I)；步驟5DNA聚合酶在片延伸反應(圖9E)。
⑨C6dT單分子點樣復性發卡引物延伸法步驟1固相化學合成一條較長寡核苷酸，使寡核苷酸含有NF-κB結合位點，並且在其3′端(羥基)含兩段鏈內反向互補序列，且兩段鏈內反向互補序列間有一個或多個C3dT氨基或其他化學修飾基團(圖101，2，3，4)；步驟2寡核苷酸點樣連接固定(C6dT氨基或其他化學修飾基團)到固相基質表面(圖10I)；步驟3寡核苷酸微陣列變性再復性(圖10A)；步驟4DNA聚合酶在片延伸反應(圖10E)。
上述方法①～⑨中，為了實現寡核苷酸在固相支持物上的固定而進行的末端或中間化學修飾，僅僅是針對通過在寡核苷酸與固相支持物間形成穩定的化學鍵而製備NF-κB檢測dsDNA微陣列晶片的方法，而對其他不需要進行寡核苷酸化學修飾就可以將寡核苷酸固定在固相支持物上的方法，則不需進行寡核苷酸化學修飾，按照相似操作就可以製備NF-κB檢測dsDNA微陣列晶片。
上述方法中，用於進行DNA聚合反應的核酸聚合酶包括一切可以完成DNA聚合功能的酶，如核糖核酸聚合酶、脫氧核糖核酸聚合酶及反轉錄酶等；用於進行核苷酸聚合反應的核苷酸包括所有核糖核苷酸、脫氧核糖核苷酸、稀有核苷酸及化學修飾核苷酸；用於固定單鏈寡核苷酸的固相支持物包括可用於表面化學研究的擁有剛性和半剛性表面的材料。
(2.2)NF-κB檢測DNA微陣列晶片定量檢測特定細胞或組織中NF-κB蛋白表達及活化水平的技術操作方案步驟1NF-κB檢測DNA微陣列晶片與標準NF-κB蛋白樣品雜交並檢測(螢光標記的NF-κB蛋白抗體或螢光標記的NF-κB蛋白抗體的抗體即二抗)，繪製「螢光強度/NF-κB蛋白濃度」標準曲線；步驟2培養特定細胞(如HeLa細胞)，培養基中加不同劑量的NF-κB蛋白表達誘導劑(如TNF-α)誘導不同的時間，收集培養細胞，製備全細胞抽提物(cell extract)或細胞核抽提物(cell nuclear extract)；或製備特定組織(tissue)全細胞抽提物(cellextract)或細胞核抽提物(cell nuclear extract)；步驟3NF-κB檢測DNA微陣列晶片用適當封閉劑(blocking reagents)(如牛血清白蛋BSA；脫脂奶粉；Denharts溶液等)封閉；步驟4全細胞抽提物或細胞核抽提物與NF-κB檢測DNA微陣列晶片在適宜溫度雜交適當時間；雜交液中應含有適量兩性電解質(如HEPES，Tris-HCl)、擔體(如dI-dC)、陽離子(如Na+，K+)、去汙劑(如NP-40)、抗氧化劑(如DTT)等，提供NF-κB與DNA結合的環境條件；步驟5除去雜交液，晶片用洗滌緩衝液洗滌(如含有適量Tween-20或Triton-100的PBS溶液)；步驟6晶片與螢光標記NF-κB蛋白抗體雜交(或先與NF-κB蛋白抗體雜交，再與螢光標記NF-κB蛋白抗體的抗體即二抗雜交)；步驟7晶片在微陣列晶片掃描儀或螢光顯微鏡上觀察，記錄螢光信號強度；步驟8將螢光信號強度輸入標準曲線，獲得NF-κB蛋白定量數據。
(2.3)NF-κB檢測DNA微陣列晶片定性檢測特定細胞或組織中NF-κB蛋白種類的技術操作方案步驟1NF-κB檢測DNA微陣列晶片與各種標準NF-κB蛋白(RelA/p65、RelB、c-Rel、NF-κB1/p50、NF-κB2/p52)同二聚體(homodimer)(如p50·p50，p52·p52等)和異二聚體(heterodimer)(如p50·p65等)樣品雜交並檢測[螢光標記的NF-κB蛋白單克隆抗體(monoclonal antibody)(如mono-anti-p65，mono-anti-p50等)或螢光標記的NF-κB蛋白單克隆抗體的抗體即二抗)，確定不同種類NF-κB蛋白特異性檢測DNA探針(這一工作在NF-κB檢測DNA微陣列晶片性能測試研究中已經確定，並將此類DNA探針固定在NF-κB檢測DNA微陣列晶片的特定區域，專門NF-κB蛋白定性檢測)；步驟2培養不同種類的細胞(如HeLa細胞等)，培養基中加不同種類的NF-κB蛋白表達誘導劑(如TNF-α)誘導適當時間，收集培養細胞，製備全細胞抽提物(cell extract)或細胞核抽提物(cell nuclear extract)；或製備特定組織(tissue)全細胞抽提物(cell extract)或細胞核抽提物(cell nuclear extract)；步驟3NF-κB檢測DNA微陣列晶片雜交用適當封閉劑(blocking reagents)(如牛血清白蛋BSA；脫脂奶粉；Denharts溶液等)封閉；步驟4全細胞抽提物或細胞核抽提物與NF-κB檢測DNA微陣列晶片在適宜溫度雜交適當時間；雜交液中應含有適量兩性電解質(如HEPES，Tris-HCl)、擔體(如dI-dC)、陽離子(如Na+，K+)、去汙劑(如NP-40)、抗氧化劑(如DTT)等，提供NF-κB與DNA結合的環境條件；步驟5除去雜交液，晶片用洗滌緩衝液洗滌(如含有適量Tween-20或Triton-100的PBS溶液)；步驟6晶片與螢光標記NF-κB蛋白單克隆抗體雜交(或先與NF-κB蛋白單克隆抗體雜交，再與螢光標記NF-κB蛋白單克隆抗體的抗體即二抗雜交)；步驟7晶片在微陣列晶片掃描儀或螢光顯微鏡上觀察，記錄螢光信號；步驟8依據晶片上NF-κB蛋白定性檢測DNA探針系統的螢光信號，判別NF-κB蛋白定性種類。
(2.4)NF-κB檢測DNA微陣列晶片分析NF-κB/DNA相互作用規律技術操作方案步驟1培養特定細胞(如HeLa細胞)，培養基中加不同種類的NF-κB蛋白表達誘導劑(如TNF-α)誘導適當時間，收集培養細胞，抽提製備不同種類NF-κB純蛋白；或構建不同NF-κB蛋白原核或真核表達載體，將載體引物原核或真核表達系統(細胞或無細胞表達系統)，製備不同種類NF-κB純蛋白；步驟2NF-κB檢測DNA微陣列晶片雜交用適當封閉劑(blocking reagents)(如牛血清白蛋BSA；脫脂奶粉；Denharts溶液等)封閉；步驟3不同種類NF-κB純蛋白與NF-κB檢測DNA微陣列晶片在適宜溫度雜交適當時間；雜交液中應含有適量兩性電解質(如HEPES，Tris-HCl)、擔體(如dI-dC)、陽離子(如Na+，K+)、去汙劑(如NP-40)、抗氧化劑(如DTT)等，提供NF-κB與DNA結合的環境條件；步驟4除去雜交液，晶片用洗滌緩衝液洗滌(如含有適量Tween-20或Triton-100的PBS溶液)；步驟5晶片與螢光標記NF-κB蛋白抗體雜交(或先與NF-κB蛋白抗體雜交，再與螢光標記NF-κB蛋白抗體的抗體即二抗雜交)；步驟3-5也可以直接用螢光標記的不同種類NF-κB純蛋白與晶片的雜交代替。
步驟6晶片在微陣列晶片掃描儀或螢光顯微鏡上觀察，記錄螢光信號；步驟7依據晶片上野生和突變(特別是點突變)DNA探針系統的螢光信號，分析不同種類NF-κB蛋白與DNA相互作用的規律，包括①不同種類NF-κB蛋白與不同野生和突變DNA靶點結合的特異性；②不同種類NF-κB蛋白與不同野生和突變DNA靶點結合的親合性；③不同種類NF-κB蛋白特異性識別結合的DNA靶點(用於NF-κB蛋白定性分析)；④NF-κB蛋白結合DNA靶點鹼基組成矩陣；⑤NF-κB蛋白結合DNA靶點預測；⑥預測的NF-κB蛋白結合DNA靶點基因組檢索分析；⑦預測的NF-κB蛋白結合DNA靶點調控基因鑑定；⑧構建基因組水平(genomic scale)NF-κB蛋白調控基因網絡。
(2.5)NF-κB檢測DNA微陣列晶片篩選NF-κB蛋白DNA靶點特異性結合小分子技術操作方案步驟1NF-κB檢測DNA微陣列晶片雜交用適當封閉劑(blocking reagents)(如牛血清白蛋BSA；脫脂奶粉；Denharts溶液等)封閉；步驟2NF-κB檢測DNA微陣列晶片再與含有組合化學分子或天然生物分子(如中藥)的雜交液雜交；雜交液中應含有適量兩性電解質(如HEPES，Tris-HCl)、擔體(如dI-dC)、陽離子(如Na+，K+)、去汙劑(如NP-40)、抗氧化劑(如DTT)等，提供NF-κB與DNA結合的環境條件；步驟3除去雜交液，晶片用洗滌緩衝液洗滌(如含有適量Tween-20或Triton-100的PBS溶液)；步驟4NF-κB純蛋白再與NF-κB檢測DNA微陣列晶片在適宜溫度雜交；雜交液中應含有適量兩性電解質(如HEPES，Tris-HCl)、擔體(如dI-dC)、陽離子(如Na+，K+)、去汙劑(如NP-40)、抗氧化劑(如DTT)等，提供NF-κB與DNA結合的環境條件；步驟4除去雜交液，晶片用洗滌緩衝液洗滌(如含有適量Tween-20或Triton-100的PBS溶液)；步驟5晶片與螢光標記NF-κB蛋白抗體雜交(或先與NF-κB蛋白抗體雜交，再與螢光標記NF-κB蛋白抗體的抗體即二抗雜交)；步驟3-5也可以直接用螢光標記的不同種類NF-κB純蛋白與晶片的雜交代替。
步驟6晶片在微陣列晶片掃描儀或螢光顯微鏡上觀察，記錄螢光信號；步驟7將晶片上DNA探針系統呈現的螢光信號和晶片直接與NF-κB蛋白雜交呈現的螢光信號(對照)進行比較，尋找那些螢光信號出現變化的DNA探針，用這些探針進行親合分離NF-κB蛋白DNA位點結合性分子的捕獲分離，並對分離純化的分子進行化學性質鑑定及生理、藥理作用分析研究，進而開發成為新的NF-κB相關疾病候選藥物。
(2.6)NF-κB檢測DNA微陣列晶片篩選NF-κB/DNA相互作用幹擾性小分子技術操作方案步驟1NF-κB檢測DNA微陣列晶片雜交用適當封閉劑(blocking reagents)(如牛血清白蛋BSA；脫脂奶粉；Denharts溶液等)封閉；步驟2NF-κB檢測DNA微陣列晶片再與含有組合化學分子或天然生物分子(如中藥)及NF-κB蛋白的雜交液雜交；雜交液中應含有適量兩性電解質(如HEPES，Tris-HCl)、擔體(如dI-dC)、陽離子(如Na+，K+)、去汙劑(如NP-40)、抗氧化劑(如DTT)等，提供NF-κB與DNA結合的環境條件；步驟3除去雜交液，晶片用洗滌緩衝液洗滌(如含有適量Tween-20或Triton-100的PBS溶液)；步驟4晶片與螢光標記NF-κB蛋白抗體雜交(或先與NF-κB蛋白抗體雜交，再與螢光標記NF-κB蛋白抗體的抗體即二抗雜交)；步驟2-4也可以直接用螢光標記的不同種類NF-κB純蛋白與晶片的雜交代替。
步驟6晶片在微陣列晶片掃描儀或螢光顯微鏡上觀察，記錄螢光信號；步驟7將晶片上DNA探針系統呈現的螢光信號和晶片直接與NF-κB蛋白雜交呈現的螢光信號(對照)進行比較，尋找那些螢光信號出現變化的DNA探針，用這些探針及相應的NF-κB蛋白進行親合分離NF-κB/DNA相互作用幹擾性分子的捕獲分離，並對分離純化的分子進行化學性質鑑定及生理、藥理作用分析研究，進而開發成為新的NF-κB相關疾病候選藥物。
上述方法(2.2)-(2.6)中，為了實現NF-κB蛋白與晶片雜交結果的檢測，所進行的NF-κB蛋白、NF-κB蛋白抗體、NF-κB蛋白二抗的螢光標記，可以用放射性同位素(如32P等)、酶(如HRP)、金屬(如Ag)等標記代替，而採用放射性同位素檢測(如X光膜感光、磷成像phosphoimaging等)、化學發光(如CSPD等)、化學生色(如NTP)及金標等檢測方法代替；甚至NF-κB蛋白、NF-κB蛋白抗體、NF-κB蛋白二抗等不進行任何標記，而採用物理學方法如原子力顯微鏡(AFM)等手段進行檢測；其他非標記的DNA/蛋白質相互作用檢測方法同樣可以用於NF-κB檢測晶片的檢測。
(3)技術效果本發明提出的NF-κB檢測dsDNA微陣列晶片為多種疾病相關轉錄因子NF-κB蛋白的高通量檢測建立了新的技術平臺，這一技術將在兩個領域發揮重要作用，一是為NF-κB相關基礎分子生物學中基因表達調控和信號傳導提供新的高通量研究手段，二是為生物醫學中NF-κB相關多種疾病候選藥物分子的高通量篩選及病理、藥理學研究提供新的技術手段。
本發明提出的NF-κB檢測dsDNA微陣列晶片為NF-κB相關基礎分子生物學中基因表達調控和信號傳導提供新的高通量研究手段。為了確證NF-κB檢測dsDNA微陣列晶片在檢測序列特異性轉錄因子NF-κB與其靶DNA序列的結合特異性和親合性的可行性。我們在國家自然科學基金項目(60201005)的資助下，運用我們的dsDNA微陣列晶片專利製備技術(02137945.9)，製備了單核苷酸突變的NF-κB靶DNA序列Ig-κB對應的dsDNA微陣列晶片，檢測了NF-κB家族蛋白p50同二聚體與野生Ig-κB(5′-GGGACTTTCC-3′)及單核苷酸突變的Ig-κB DNA位點的結合親合性，我們發現待檢溶液中的p50同二聚體蛋白能夠以不同的親合性與野生Ig-κB及單核苷酸突變的Ig-κB DNA位點結合(如附圖17)，通過傳統凝膠遷移實驗(Electrophoresis Mobility Shift Assay，EMSA)驗證，以及與其他方法如X光晶體衍射等取得的實驗結果相比較，證明單核苷酸突變的NF-κB靶DNA序列Ig-κB對應的dsDNA微陣列晶片能夠通過一次實驗，高通量確定NF-κB家族蛋白p50同二聚體與眾多DNA靶點(野生Ig-κB及及單核苷酸突變的Ig-κB DNA位點)結合的親合性，有力地分析出Ig-κB位點中各個核苷酸在p50同二聚體蛋白與Ig-κB位點相互作用中發揮的不同作用，從而確定NF-κB與其DNA靶點結合時，發生在蛋白質胺基酸和DNA鹼基之間的相互作用，並預測出基因組可能存在在其他NF-κB結合DNA靶點，如通過過我們的實驗，我們發現NF-κB結合的DNA靶點不僅僅體現為5′-GGGRNYYYCC-3′，基因組中存在的其他一些序列如5′-GGNRNYYYCC-3′可能與NF-κB也結合，比如序列5′-GGTACTTTCC-3′位點在我們的陣列上與p50同二聚體蛋白有高結合親合性，序列5′-GGAACTTTCC-3′與p50同二聚體蛋白也有顯著的結合親合性。我們對人類基因組進行了搜索，發現在人22號染色體上存在20個5′-GGTACTTTCC-3′位點和29個5′-GGAACTTTCC-3′位點，而在全基因組中存在966個5′-GGTACTTTCC-3′位點和942個5′-GGAACTTTCC-3′位點，這些位點可能是。NF-κB尚未發現的新的結合靶點，通過對這些位點性質的考察，可望鑑定那些受NF-κB調控的新基因，從而構建出全基因組NF-κB調控的基因網絡，這一NF-κB調控的基因網絡的完成，將為NF-κB調控基因表達的分子生物學基礎研究、NF-κB相關疾病的機理研究以及NF-κB藥物篩選全基因組靶點系統的確立產生極為重要的影響(Jin K.Wang，Tong X.Li，Yun F.Bai，Zu H.Lu.2002，Analyticai Biochemistry，316192-201)。
為了進一步確證NF-κB檢測dsDNA微陣列晶片在檢測序列特異性轉錄因子NF-κB與其靶DNA序列的結合特異性和親合性的可靠性。我們在國家自然科學基金項目(60121101)的資助下，運用我們的dsDNA微陣列晶片專利製備技術(02112780.8)，製備了含有30個野生型NF-κB靶DNA序列(表2)的dsDNA微陣列晶片，檢測了NF-κB家族蛋白p50同二聚體與30個野生型NF-κB靶DNA序列的結合親合性，我們發現待檢溶液中的p50同二聚體蛋白能夠以非常不同的親合性與各DNA位點結合(如附圖18)，通過傳統凝膠遷移實驗(Electrophoresis Mobility Shift Assay，EMSA)驗證，與上面單鹼基突變Ig-κBdsDNA微陣列晶片取得的結果相比較，以及和其他方法如X光晶體衍射等取得的實驗結果相比較，證明含有30個野生型NF-κB靶DNA序列的dsDNA微陣列晶片完全能夠通過一次實驗，高通量測定NF-κB家族蛋白p50同二聚體與眾多野生型DNA靶點結合的親合性；通過與單鹼基突變Ig-κBdsDNA微陣列晶片取得的結果相比較，我們發現兩個晶片揭示的NF-κB家族蛋白p50同二聚體與眾多DNA靶點結合時，發生在蛋白質胺基酸和DNA鹼基之間的相互作用規律非常一致，這一結果很有力地說明NF-κB檢測dsDNA微陣列晶片在檢測序列特異性轉錄因子NF-κB與其靶DNA序列的結合特異性和親合性時非常高效可靠，是一種基於生物晶片技術思想的高通量檢測序列特異性DNA結合蛋白與其基因組中靶dsDNA位點相互作用規律的新技術。
表1 30個野生型NF-κB靶DNA位點

本發明提出的NF-κB檢測dsDNA微陣列晶片為生物醫學中NF-κB相關多種疾病候選藥物分子的高通量篩選及病理、藥理學研究提供了新的技術手段。NF-κB是一類序列特異性轉錄因子，參與眾多基因的表達調控；如當細胞受到炎症介質、病毒感染、氧化應激等多種物質刺激後，NF-κB在胞質內被激活，進入細胞核與病毒(HIV，Adenovirus，HSV，SIV，SV-40，EBV)、細胞因子(IFN，TNF，IL-1，IL-2，IL-6，IL-8，IL-10，IL-11，IL-12，IL-13)、生長因子(G-CSF，GM-CSF，EPO，M-CSF，VEGF C)、細胞粘附分子(ELAM-1，ICAM-1，VCAM-1，MadCAM-1，Endoglin)、急性相反應蛋白(Angiotensinogen，beta-defensin-2，Tissue factor-1，Pentraxin PTX3，Complement factor C4)、酶(ADH，Lysozyme，PIM-1，Serpin 2A，Gelatinase B，GD3-synthase)、免疫球蛋白(Igκlight chain)等基因增強子序列結合，增強這些基因的轉錄；因而在一系列由細胞因子、炎症介質及蛋白酶類參與的疾病的發病過程中發揮重要作用。大量的研究表明NF-κB過度活化與炎症、血管疾病、腫瘤、病毒感染、腦血管疾病、阿爾茨海默病、帕金森氏病、過敏性腦炎、感染性休克、風溼性關節炎、支氣管哮喘、動脈粥樣硬化、潰瘍性結腸炎等病理過程存在非常密切的關係。因此目前NF-κB已成為新藥開發的重要靶點，許多生物和生化抑制劑能夠阻斷NF-κB信號通路或抑制NF-κB/DNA結合，從而有助於NF-κB相關疾病的治療。NF-κB是一類序列特異性轉錄因子，其生理作用的發揮依賴於在細胞質內活化的NF-κB進入細胞核，與其調控的靶基因調控區NF-κB特異性結合增強子DNA序列結合，從而啟動或增強NF-κB調控靶基因的表達。因此，篩選抑制NF-κB作用的最佳部位是NF-κB與DNA的相互結合作用，只要能夠封閉或幹擾NF-κB與DNA的相互結合作用，就能夠有效地抑制NF-κB作用。大量的實驗已經證明許多小分子能夠與NF-κB的DNA靶點直接結合，封閉或幹擾NF-κB與DNA的相互結合，有效地抑制NF-κB對DNA靶點調控的下遊基因的表達增強作用，如己酮可可鹼[Pentoxifylline(1-(5′-oxohexyl)3，7-dimetylxanthine，PTX)]、1，25-二羥膽骨化醇[Calcitriol(1，25-dihydroxyvitamine D3)]、羥基吡啶硫酮(Pyrithione)、甲基紅黴素(Clarithromycin)、Quinadril(ACE inhibitor)、阱(Diamide)、三(氮)唑核苷，病毒唑(抗病毒藥)(ribavirin)、醌衍生物[E3330(quinone derivative)]、血液複合胺衍生物[Serotonin derivative(N-(p-coumaroyl)serotonin，SC)]、除鏽黴素A(Herbimycin A)、水楊酸偶氮磺胺吡啶(Sulfasalazine)、對苯二酚(Hydroquinone(HQ))、洛凡司丁(Mevinolin)，5′-甲硫腺苷[5′-methylthioadenosine(MTA)]、嗎啡合成衍生[KT-90(morphine synthetic derivative)]、N-乙基-順丁烯二醯亞胺[N-ethyl-maleimide(NEM)]、菸鹼(Nicotine)、Kamebakaurin、ADP ribosylationinhibitors(nicotinamide，3-aminobenzamide)、Atrial Natriuretic Peptide(ANP)、Phenyl-N-tert-butylnitrone(PBN)、Atrovastat(HMG-CoA reductase inhibitor)、Pituitary adenylatecyclase-activating polypeptide(PACAP)、Secretory leukocyte protease inhibitor(SLPI)、Vascularendothelial growth factor(VEGF)、IL-4、Vasoactive intestinal peptide(VIP)、IkB-like proteins(encoded by ASFV)、Metals(chromium，cadmium，gold，mercury，zinc，arsenic)。特別是研究表明，中藥中存在一些小分子，能夠直接與NF-κB的DNA靶點直接結合，封閉或幹擾NF-κB與DNA的相互結合，有效地抑制NF-κB對DNA靶點調控的下遊基因的表達增強作用，如甘草酸(Glycyrrhizin)(抗病毒)、金絲桃素(Hypericin)(抗病毒、腫瘤)、水飛薊(黃酮)(Silymarin)(保肝)。我們運用甘草酸(甘草皂苷、甘草甜素)研究了運用NF-κB檢測dsDNA微陣列晶片高通量篩選NF-κB相關多種疾病候選藥物分子的可行性，我們觀察到隨著NF-κB蛋白體系中存在的甘草酸分子濃度的逐步提高，NF-κB蛋白與DNA靶點結合的親合性越低，即證明甘草酸分子競爭性佔據了晶片DNA探針上的NF-κB蛋白結合位點，導致晶片上可供NF-κB蛋白結合的DNA位點減少(如附圖19)。這一實驗證明運用NF-κB檢測dsDNA微陣列晶片可以高通量篩選中藥或組合化學藥物中潛在的NF-κB/DNA相互作用幹擾性分子，開發新的NF-κB相關疾病候選藥物。
四

圖1是固相支持物表面合成的NF-κ5檢測dsDNA微陣列晶片圖2是固相支持物表面製備NF-κB檢測dsDNA微陣列的方法①圖3是固相支持物表面製備NF-κB檢測dsDNA微陣列的方法②圖4是固相支持物表面製備NF-κB檢測dsDNA微陣列的方法③圖5是固相支持物表面製備NF-κB檢測dsDNA微陣列的方法④圖6是固相支持物表面製備NF-κB檢測dsDNA微陣列的方法⑤圖7是固相支持物表面製備NF-κB檢測dsDNA微陣列的方法⑥圖8是固相支持物表面製備NF-κB檢測dsDNA微陣列的方法⑦圖9是固相支持物表面製備NF-κB檢測dsDNA微陣列的方法⑧圖10是固相支持物表面製備NF-κB檢測dsDNA微陣列的方法⑨圖11是NF-κB檢測dsDNA微陣列晶片定量檢測NF-κB蛋白示意12是NF-κB檢測dsDNA微陣列晶片定性檢測NF-κB蛋白示意13是NF-κB檢測dsDNA微陣列晶片篩選NF-κB蛋白DNA靶點結合分子示意14是NF-κB檢測dsDNA微陣列晶片篩選NF-κB/DNA相互作用幹擾性分子示意15是Cy3-標記dUTP滲入在片延伸反應合成的dsDNA微陣列晶片螢光信號16是Cy3標記NF-κB蛋白與dsDNA微陣列晶片雜交螢光信號17是NF-κB p50蛋白與野生及單鹼基突變的Ig-κBdsDNA微陣列晶片雜交信號18是NF-κB p50蛋白與含有30個野生型NF-κB DNA靶點的dsDNA微陣列晶片雜交信號19是含甘草酸的NF-κB p50蛋白與dsDNA微陣列晶片雜交信號圖五具體實施方式
1、固相支持物準備用於本發明製備雙鏈核酸的固相支持物可以是硝酸纖維素膜、尼龍膜、LB膜、(聚)四氟乙烯膜，(聚)偏二氟乙烯膜，聚苯乙烯膜，聚碳酸酯等化學膜、瓊脂糖凝膠體、聚丙烯醯胺凝膠體、表面化學修飾的玻璃、矽、金等固相化學所用材料；固相支持物表面含有活性基團如羧基、醛基、氨基、羥基、硫醇基等類似基團。
下面NF-κB檢測dsDNA微陣列晶片製備技術操作實施方式中，僅用表面以矽烷處理的玻片為固相支持物和在晶片上製備一個DNA探針為例，對NF-κB檢測dsDNA微陣列晶片製備及應用加以說明。
玻片的準備及矽烷化及醛基修飾若使用商業化提供的基因晶片專用玻片如Telechem公司的SuperAldehyde Slides等，則此步不需要再執行；若從普通製備組織切片的玻片開始，則不許對玻片進行處理。首先對玻片進行常規清洗，再用矽烷化試劑如Sigma公司的aminopropyltriethoxysilane(三乙氧基氨基矽烷)進行矽烷化處理5-10分鐘(含2％aminopropyltriethoxysilane的95％丙酮，acetone)。矽烷化處理後用去離子水洗滌兩次，在75℃烘烤45分鐘。將矽烷化處理好的玻片浸泡在含5％戊二醛(glutaraldehyde)的磷酸緩衝液(0.01M PB，pH7.0)中30分鐘，之後用去離子水洗滌兩次，氮氣吹乾，保存在4℃，半月內使用。
2.單鏈寡核苷酸的設計及化學合成設計並用固相化學合成技術合成探針單鏈寡核苷酸及通用單鏈寡核苷酸。僅在晶片上製備一個dsDNA探針為例，對NF-κB檢測dsDNA微陣列晶片製備及應用加以說明。
表2在醛基修飾玻片上製備一個NF-κB檢測探針所使用的固相化學合成的單鏈寡核苷酸 3.點樣DNA準備及在玻片表面固定及晶片製備用表2中合成的寡核苷酸，按上面說明書中的技術方案進行NF-κB檢測dsDNA微陣列晶片的製備，各種方法的具體操作如下。
①雙分子寡核苷酸復性點樣法步驟1固相化學合成兩條鹼基序列完全互補的寡核苷酸(如表2①1，①2)，其中寡核苷酸上嵌合NF-κB結合位點(紅色鹼基GGGACTTTCC)；步驟2兩寡核苷酸以80μM溶解在TE緩衝液中，混合併在60℃復性1小時；復性產物中加入等體積碳酸緩衝液(0.1M carbonate buffer，pH9.0)；步驟3雙鏈寡核苷酸用PixSys5500(Cartesian Technology Inc.)點樣(溼度80％)到醛基修飾玻片表面，點樣後置於溼盒內0.1M碳酸緩衝液(pH9.0)浸溼的濾紙上，密封溼盒，在37℃溫育1小時，再用2×SSC/0.1％SDS和0.2×SSC/0.1％SDS溶液各洗滌5分鐘，用滅菌雙蒸水簡單淋洗，氮氣吹乾，4℃保存備用。
②雙分子寡核苷酸點樣復性法步驟1固相化學合成兩條鹼基序列完全互補的寡核苷酸(如表2②1，②2)，其中寡核苷酸上嵌合NF-κB結合位點(紅色鹼基GGGACTTTCC)；步驟2將氨基寡核苷酸②1以40μM溶解在碳酸緩衝液(0.1M carbonate buffer，pH9.0)中，用PixSys5500(Cartesian Technology Inc.)點樣(溼度80％)到醛基修飾玻片表面，點樣後置於溼盒內0.1M碳酸緩衝液(pH9.0)浸溼的濾紙上，密封溼盒，在37℃溫育1小時，再用0.1％SDS溶液洗滌2分鐘；玻片用滅菌雙蒸水簡單淋洗後，轉入硼氫化鈉溶液
中，浸泡3分鐘，再用滅菌雙蒸水淋洗兩次，氮氣吹乾，4℃保存備用；步驟3將寡核苷酸②2以40nM溶解在雜交液中，加10μL到步驟2製備的單鏈寡核苷酸②1的微陣列上，用憎水矽烷[PlusoneRepel-Silane ES(Dimethyldichlorosilance solution 2％ w/v in octamethylcyclotetra-sixane)，Pharmacia Biotech)處理的蓋玻片覆蓋溶液及微陣列，放置於密封溼盒內60℃復性1小時；復性後玻片用2×SSC/0.1％SDS和0.2×SSC/0.1％SDS溶液各洗滌5分鐘，用滅菌雙蒸水簡單淋洗，氮氣吹乾，4℃保存備用。
③雙分子寡核苷酸通用引物點樣復性延伸法步驟1固相化學合成兩條寡核苷酸，其中一條較長寡核苷酸上嵌合NF-κB結合位點(如表2③1)(紅色鹼基GGGACTTTCC)，另一條較短的寡核苷酸作為通用引物(constant primer)(表2③2)；步驟2將3′端氨基修飾的寡核苷酸③1以40μM溶解在0.1M碳酸緩衝液(pH9.0)中，用PixSys5500(Cartesian Technology Inc.)點樣(溼度80％)到醛基修飾玻片表面，點樣後置於溼盒內0.1M碳酸緩衝液(pH9.0)浸溼的濾紙上，密封溼盒，在37℃溫育1小時，再用0.1％SDS溶液洗滌2分鐘；玻片用滅菌雙蒸水簡單淋洗後，轉入硼氫化鈉溶液
中，浸泡3分鐘，再用滅菌雙蒸水淋洗兩次，氮氣吹乾，4℃保存備用；步驟3將通用引物寡核苷酸③2以40nM溶解在雜交液中，加10μL到步驟2製備的單鏈寡核苷酸③1的微陣列上，用憎水矽烷[PlusoneRepel-Silane ES(Dimethyldichlorosilance solution 2％ w/v in octamethylcyclotetra-sixane)，Pharmacia Biotech)處理的蓋玻片覆蓋溶液及微陣列，放置於密封溼盒內60℃復性1小時；復性後玻片用2×SSC/0.1％SDS溶液洗滌2分鐘，用滅菌雙蒸水簡單淋洗，氮氣吹乾，4℃保存備用；步驟4將10μL DNA聚合酶反應緩衝液[Polymerase Reaction50mM Tris-HCl(pH7.2)，10mM MgSO4，0.1mM DTT，40μM of each dNTP，20μg/ml acetylated BSA，2U/μlDNA polymerase I large(Klenow)fragment(3′to 5′exo-；Promega，Madison，WI)]加到步驟3製備的寡核苷酸微陣列上，用憎水矽烷[PlusoneRepel-Silane ES(Dimethyldichlorosilance solution 2％ w/v in octamethylcyclotetra-sixane)，Pharmacia Biotech)處理的蓋玻片覆蓋溶液及微陣列，放置於密封溼盒內37℃延伸反應1小時；反應後玻片用2×SSC/0.1％SDS和0.2×SSC/0.1％SDS溶液各洗滌5分鐘，用滅菌雙蒸水簡單淋洗，氮氣吹乾，4℃保存備用。
④雙分子寡核苷酸通用引物復性點樣延伸法步驟1固相化學合成兩條寡核苷酸，其中一條較長寡核苷酸上嵌合NF-κB結合位點(如表2④1)(紅色鹼基GGGACTTTCC)，另一條較短的寡核苷酸作為通用引物(constant primer)(表2④2)；步驟2兩寡核苷酸以80μM溶解在TE緩衝液中，混合併在50℃復性1小時；復性產物中加入等體積0.1M碳酸緩衝液(pH9.0)；步驟3步驟2寡核苷酸產物用PixSys5500(Cartesian Technology Inc.)點樣(溼度80％)到醛基修飾玻片表面，點樣後置於溼盒內0.1M碳酸緩衝液(pH9.0)浸溼的濾紙上，密封溼盒，在37℃溫育1小時，再用2×SSC/0.1％SDS溶液洗滌2分鐘，用滅菌雙蒸水簡單淋洗，氮氣吹乾，4℃保存備用；步驟4將10μL DNA聚合酶反應緩衝液[Polymerase Reaction50mM Tris-HCl(pH7.2)，10mM MgSO4，0.1mM DTT，40μM of each dNTP，20μg/ml acetylated BSA，2U/μl DNA polymerase I large(Klenow)fragment(3′to 5′exo-；Promega，Madison，WI)]加到步驟3製備的寡核苷酸微陣列上，用憎水矽烷[PlusoneRepel-SilaneES(Dimethyldichlorosilance solution 2％ w/v in octamethylcyclotetrasixane)，Pharmacia Biotech)處理的蓋玻片覆蓋溶液及微陣列，放置於密封溼盒內37℃延伸反應1小時；反應後玻片用2×SSC/0.1％SDS和0.2×SSC/0.1％SDS溶液各洗滌5分鐘，用滅菌雙蒸水簡單淋洗，氮氣吹乾，4℃保存備用。
⑤雙分子寡核苷酸通用引物復性延伸點樣法步驟1固相化學合成兩條寡核苷酸，其中一條較長寡核苷酸上嵌合NF-κB結合位點(如表2⑤1)(紅色鹼基GGGACTTTCC)，另一條較短的寡核苷酸作為通用引物(constant primer)(表2⑤2)；步驟2兩寡核苷酸以80μM溶解在TE緩衝液中，混合併在50℃復性1小時；步驟3將步驟2寡核苷酸產物以適宜濃度加入DNA聚合酶反應液[Polymerase Reaction50mM Tris-HCl(pH7.2)，10mM MgSO4，0.1mM DTT，40μM of each dNTP，20μg/ml acetylated BSA，2U/μl DNA polymerase I large(Klenow)fragment(3′to5′exo-；Promega，Madison，WI)]中，37℃延伸反應1小時；純化反應產物，並以80μM溶解在0.1M碳酸緩衝液(pH9.0)；步驟4步驟3寡核苷酸產物用Pixsys5500(Cartesian Technology Inc.)點樣(溼度80％)到醛基修飾玻片表面，點樣後置於溼盒內0.1M碳酸緩衝液(pH9.0)浸溼的濾紙上，密封溼盒，在37℃溫育1小時，再用2×SSC/0.1％SDS溶液洗滌2分鐘，用滅菌雙蒸水簡單淋洗，氮氣吹乾，4℃保存備用。
⑥單分子鏈內互補法步驟1固相化學合成一條長寡核苷酸(如表2⑥1)，使寡核苷酸含有兩段鏈內反向互補序列，且反向互補序列內含有NF-κB結合位點(紅色鹼基GGGACTTTCC)；步驟2將氨基寡核苷酸⑥1以40μM溶解在碳酸緩衝液(0.1M carbonate buffer，pH9.0)中，用PixSys5500(Cartesian Technology Inc.)點樣(溼度80％)到醛基修飾玻片表面，點樣後置於溼盒內0.1M碳酸緩衝液(pH9.0)浸溼的濾紙上，密封溼盒，在37℃溫育1小時，再用0.1％SDS溶液洗滌2分鐘；玻片用滅菌雙蒸水簡單淋洗後，轉入硼氫化鈉溶液
中，浸泡3分鐘，再用滅菌雙蒸水淋洗兩次，氮氣吹乾，4℃保存備用；步驟3將10μL雜交液加到步驟2製備的寡核苷酸⑥1的微陣列上，用憎水矽烷PlusoneRepel-Silane ES(Dimethyldichlorosilance solution 2％ w/v inoctamethylcyclotetrasixane)，Pharmacia Biotech)處理的蓋玻片覆蓋溶液及微陣列，放置於密封溼盒內60℃復性1小時；復性後玻片用2×SSC/0.1％SDS溶液洗滌2分鐘，用滅菌雙蒸水簡單淋洗，氮氣吹乾，4℃保存備用。
⑦單分子點樣復性發卡引物延伸法步驟1固相化學合成一條較短的寡核苷酸(如表2⑦1)，使寡核苷酸含有NF-κB結合位點(紅色鹼基GGGACTTTCC)，並且在其3′端(羥基)含有兩段鏈內反向互補序列(黃色鹼基)；步驟2將氨基寡核苷酸⑦1以40μM溶解在碳酸緩衝液(0.1M carbonate buffer，pH9.0)中，用PixSys5500(Cartesian Technology Inc.)點樣(溼度80％)到醛基修飾玻片表面，點樣後置於溼盒內0.1M碳酸緩衝液(pH9.0)浸溼的濾紙上，密封溼盒，在37℃溫育1小時，再用0.1％SDS溶液洗滌2分鐘；玻片用滅菌雙蒸水簡單淋洗後，轉入硼氫化鈉溶液
中，浸泡3分鐘，再用滅菌雙蒸水淋洗兩次，氮氣吹乾，4℃保存備用；步驟3將10μL雜交液加到步驟2製備的寡核苷酸⑥1的微陣列上，用憎水矽烷[PlusoneRepel-Silane ES(Dimethyldichlorosilance solution 2％ w/v inoctamethylcyclotetrasixane)，Pharmacia Biotech)處理的蓋玻片覆蓋溶液及微陣列，放置於密封溼盒內60℃復性1小時；復性後玻片用2×SSC/0.1％SDS溶液洗滌2分鐘，用滅菌雙蒸水簡單淋洗，氮氣吹乾，4℃保存備用；步驟4將10μL DNA聚合酶反應緩衝液[Polymerase Reaction50mM Tris-HCl(pH7.2)，10mM MgSO4，0.1mM DTT，40μM dNTP，20μg/ml acetylated BSA，2U/μl DNApolymerase I large(Klenow)fragment(3′to 5′exo-；Promega，Madison，WI)]加到步驟3製備的寡核苷酸微陣列上，用憎水矽烷[PlusoneRepel-Silane ES(Dimethyldichlorosilance solution 2％ w/v in octamethylcyclotetra-sixane)，Pharmacia Biotech)處理的蓋玻片覆蓋溶液及微陣列，放置於密封溼盒內37℃延伸反應1小時；反應後玻片用2×SSC/0.1％SDS和0.2×SSC/0.1％SDS溶液各洗滌5分鐘，用滅菌雙蒸水簡單淋洗，氮氣吹乾，4℃保存備用。
⑧單分子復性連接點樣發卡引物延伸法步驟1固相化學合成兩條寡核苷酸，使其中寡核苷酸1含有NF-κB結合位點(紅色鹼基GGGACTTTCC)，並且在其磷酸化的3′端含一段核苷酸序列，該段核苷酸能夠與寡核苷酸2的3′端一段核苷酸序列互補(如表2⑧1)(紫紅鹼基CGTACGC)；寡核苷酸2在5′端含有兩段鏈內反向互補序列(黃色鹼基)，在3′端含有一段與寡核苷酸1的3′端核苷酸序列互補的序列(紫紅鹼基GCGTACG)，且兩段鏈內反向互補序列間有一個C3dT氨基修飾基團(紅色T)，；步驟2兩寡核苷酸以80μM溶解在TE緩衝液中，混合併在60℃復性1小時；步驟3將步驟2寡核苷酸產物以適宜濃度加入DNA連接酶反應液[Ligation Reaction40mM Tris-HCl(pH7.8)，10mM MgCl4，10mM DTT，0.5mM ATP and 0.5U/μlT4 DNA ligase(MBI fermentas)]中，37℃連接反應1小時；反應產物用離心柱[CentriSpin-10 spin column(Princeton Separations，Adelphia，NJ)]轉移到0.1M碳酸緩衝液(pH9.0)中，DNA濃度為40μM，純化反應產物，並以80μM溶解在0.1M碳酸緩衝液(pH9.0)；步驟4將步驟3寡核苷酸產物用PixSys5500(Cartesian Technology Inc.)點樣(溼度80％)到醛基修飾玻片表面，點樣後置於溼盒內0.1M碳酸緩衝液(pH9.0)浸溼的濾紙上，密封溼盒，在37℃溫育1小時，再用0.1％SDS溶液洗滌2分鐘；玻片用滅菌雙蒸水簡單淋洗後，轉入硼氫化鈉溶液
中，浸泡3分鐘，再用滅菌雙蒸水淋洗兩次，氮氣吹乾，4℃保存備用；(圖9I)；步驟5將10μL DNA聚合酶反應緩衝液[Polymerase Reaction50mM Tris-HCl(pH7.2)，10mM MgSO4，0.1mM DTT，40μM dNTP，20μg/ml acetylated BSA，2U/μl DNApolymerase I large(Klenow)fragment(3′to 5′exo-；Promega，Madison，WI)]加到步驟4製備的寡核苷酸微陣列上，用憎水矽烷[PlusoneRepel-Silane ES(Dimethyldichlorosilance solution 2％ w/v in octamethylcyclotetra- sixane)，Pharmacia Biotech)處理的蓋玻片覆蓋溶液及微陣列，放置於密封溼盒內37℃延伸反應1小時；反應後玻片用2×SSC/0.1％SDS和0.2×SSC/0.1％SDS溶液各洗滌5分鐘，用滅菌雙蒸水簡單淋洗，氮氣吹乾，4℃保存備用。
⑨C6dT單分子點樣復性發卡引物延伸法步驟1固相化學合成一條較長寡核苷酸(如表2⑨1)，使寡核苷酸含有NF-κB結合位點(紅色鹼基GGGACTTTCC)，並且在其3′端(羥基)含兩段鏈內反向互補序列(黃色鹼基)，且兩段鏈內反向互補序列間有一個C3dT氨基修飾基團(紅色T)步驟2將氨基寡核苷酸⑨1以40μM溶解在碳酸緩衝液(0.1M carbonate buffer，pH9.0)中，用PixSys5500(Cartesian Technology Inc.)點樣(溼度80％)到醛基修飾玻片表面，點樣後置於溼盒內0.1M碳酸緩衝液(pH9.0)浸溼的濾紙上，密封溼盒，在37℃溫育1小時，再用0.1％SDS溶液洗滌2分鐘；玻片用滅菌雙蒸水簡單淋洗後，轉入硼氫化鈉溶液
中，浸泡3分鐘，再用滅菌雙蒸水淋洗兩次，氮氣吹乾，4℃保存備用；步驟3將10μL雜交液加到步驟2製備的寡核苷酸⑥1的微陣列上，用憎水矽烷[PlusoneRepel-Silane ES(Dimethyldichlorosilance solution 2％ w/v inoctamethylcyclotetrasixane)，Pharmacia Biotech]處理的蓋玻片覆蓋溶液及微陣列，放置於密封溼盒內60℃復性1小時；復性後玻片用2×SSC/0.1％SDS溶液洗滌2分鐘，用滅菌雙蒸水簡單淋洗，氮氣吹乾，4℃保存備用；步驟4將10μL DNA聚合酶反應緩衝液[Polymerase Reaction50mM Tris-HCl(pH7.2)，10mM MgSO4，0.1mM DTT，40μM dNTP，20μg/ml acetylated BSA，2U/μl DNApolymerase I large(Klenow)fragment(3′to 5′exo-；Promega，Madison，WI)]加到步驟3製備的寡核苷酸微陣列上，用憎水矽烷[PlusoneRepel-Silane ES(Dimethyldichlorosilance solution 2％w/v in octamethylcyclotetra- sixane)，Pharmacia Biotech)處理的蓋玻片覆蓋溶液及微陣列，放置於密封溼盒內37℃延伸反應1小時；反應後玻片用2×SSC/0.1％SDS和0.2×SSC/0.1％SDS溶液各洗滌5分鐘，用滅菌雙蒸水簡單淋洗，氮氣吹乾，4℃保存備用。
圖15是用上述方法之一製備的寡核苷酸微陣列，為了反映製備效果，在DNA聚合酶延伸反應中，用螢光素Cy3-dUTP代替了正常的dTTP，延伸反應後，在微陣列晶片掃描儀(如ScanArrayLite，Packard Biochip Technologies)上掃描(Cy3channel、80％laser power，80％PMT gain，5μm resolution.)，記錄螢光信號；結果反映運用上述方法能夠成功地製備dsDNA寡核苷酸微陣列。
3.NF-κB檢測DNA微陣列晶片檢測待檢測物中NF-κB蛋白的技術操作步驟1轉錄因子NF-κB p50蛋白用人p50全長cDNA(編碼453胺基酸)表達載體在細菌中表達提取(Promega，Madison，WI)；步驟2NF-κB檢測DNA微陣列晶片用5％BSA/PBS溶液封閉室溫封閉1小時步驟3適量NF-κB蛋白溶解於DNA結合緩衝液中(DNA-binding buffer10mM HEPESpH7.9，50mM KCl，2.5mM DTT，0.1mM EDTA，0.05％ NP-40，10％Glycerol，5％BSA)，室溫保育30分鐘；取10μL DNA結合緩衝液滴加到NF-κB檢測DNA微陣列上，用憎水矽烷[Plusone Repel-Silane ES(Dimethyldichlorosilancesolution 2％ w/v in octamethylcyclotetrasixane)，Pharmacia Biotech)處理的蓋玻片覆蓋溶液及微陣列，放置於密封溼盒內37℃或室溫保育1小時；步驟4反應後玻片在室溫下分別用PBS/0.05％Tween 20，PBS/0.01％Triton 100及PBS(141mM NaCl，7.2mM Na2HPO4，2.8mM NaH2PO4，pH7.4)洗滌15min；步驟5氮氣吹乾玻片，取10μL含有適量螢光素Cy3(FluoroLinkTMCy3 monofunctionaldye，Amersham Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)標記的NF-κB蛋白抗體[NE-κBp50(E-10)sc-8414，Santa Cruz Biotechnology，Inc.]的PBS(141mM NaCl，7.2mM Na2HPO4，2.8mM NaH2PO4，pH7.4)溶液，滴加到NF-κB檢測DNA微陣列上，用憎水矽烷[PlusoneRepel-Silane ES(Dimethyldichlorosilance solution 2％w/v in octamethylcyclotetrasixane)，Pharmacia Biotech)處理的蓋玻片覆蓋溶液及微陣列，放置於密封溼盒內37℃或室溫保育1小時；步驟6抗體反應後，玻片用PBS(141mM NaCl，7.2mM Na2HPO4，2.8mM NaH2PO4，pH7.4)溶液室溫洗滌30分鐘，再用用滅菌雙蒸水簡單淋洗，氮氣吹乾。
步驟7晶片在微陣列晶片掃描儀(如ScanArrayLite，Packard Biochip Technologies)上掃描(適當參數channel、laser power，PMT gain，resolution.)，記錄螢光信號；步驟8用晶片晶片螢光信號分析軟體(如QuantArraymicroarray analysis software，Packard Biochip Technologies)進行數據分析。
圖16是用上述NF-κB檢測DNA微陣列晶片製備方法之一製備的寡核苷酸微陣列，為了反映所製備的dsDNA寡核苷酸微陣列能夠和檢測溶液中的NF-κB蛋白發生結合作用，晶片製備中使用四種正常dNTP進行DNA聚合酶延伸反應，晶片製備好後，用Cy3(FluoroLinkTMCy3 monofunctional dye，Amersham PharmaciaBiotech，Piscataway，NJ)標記的NF-κB p50蛋白直接與微陣列晶片雜交，雜交後經PBS/0.05％Tween 20，PBS/0.01％Triton 100及PBS(141mM NaCl，7.2mMNa2HPO4，2.8mM NaH2PO4，pH7.4)各洗滌15min，氮氣吹乾，在掃描儀ScanArrayLite，Packard Biochip Tecmologies上掃描(Cy3 channel、80％laserpower，80％PMT gain，5μm resolution.)，記錄螢光信號；結果反映運用上述方法製備的dsDNA寡核苷酸微陣列能夠與檢測無中的NF-κB蛋白良好地結合。
圖17為了反映所製備的NF-κB檢測DNA微陣列晶片能夠用於高通量研究NF-κB蛋白與眾多DNA靶點相互作用的規律，用NF-κB檢測DNA微陣列晶片中單核苷酸突變Ig-κB DNA靶點陣列與Cy3(FluoroLinkTMCy3 monofunctional dye，Amersham Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)標記的NF-κB p50蛋白雜交，雜交後經PBS/0.05％Tween 20，PBS/0.01％Triton 100及PBS(141mM NaCl，7.2mM Na2HPO4，2.8mM NaH2PO4，pH7.4)各洗滌15min，氮氣吹乾，在掃描儀ScanArrayLite，Packard Biochip Technologies上掃描(Cy3 channel、80％laserpower，80％PMT gain，5μm resolution.)，記錄螢光信號結果反映NF-κB檢測DNA微陣列晶片能夠高通量檢測NF-κB蛋白與眾多DNA靶點相互作用的特異性及親合性特徵。其中晶片上DNA探針的序列如表3表3 NF-κB檢測DNA微陣列晶片上單核苷酸突變Ig-κB DNA位點

圖18為了反映所製備的NF-κB檢測DNA微陣列晶片能夠用於高通量研究NF-κB蛋白與眾多DNA靶點相互作用的規律，用NF-κB檢測DNA微陣列晶片中30個野生型dsDNA靶點陣列與Cy3(FluoroLinkTMCy3 monofunctional dye，AmershamPharmacia Biotech，Piscataway，NJ)標記的NF-κB p50蛋白雜交，雜交後經PBS/0.05％Tween 20，PBS/0.01％Triton 100及PBS(141mM NaCl，7.2mMNa2HPO4，2.8mM NaH2PO4，pH7.4)各洗滌15min，氮氣吹乾，在掃描儀ScanArrayLite，Packard Biochip Technologies上掃描(Cy3 channel、80％laserpower，80％PMT gain，5μm resolution.)，記錄螢光信號；結果反映NF-κB檢測DNA微陣列晶片能夠高通量檢測NF-κB蛋白與眾多不同野生型dsDNA靶點相互作用的特異性及親合性特徵。其中晶片上DNA探針的序列如表4表4 NF-κB檢測DNA微陣列晶片上30個野生型位點

圖19為了反映所製備的NF-κB檢測DNA微陣列晶片能夠用於高通量shaixuan篩選NF-κB/dsDNA相互作用幹預性組合化學及天然生物分子，用NF-κB檢測DNA微陣列晶片中的重複Ig-κB靶點陣列與Cy3(FluoroLinkTMCy3 monofunctionaldye，Amersham Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)標記的NF-κB p50蛋白及甘草酸分子雜交，雜交後經PBS/0.05％Tween 20，PBS/0.01％Triton 100及PBS(141mM NaCl，7.2mM Na2HPO4，2.8mM NaH2PO4，pH7.4)各洗滌15min，氮氣吹乾，在掃描儀ScanArrayLite，Packard Biochip Technologies上掃描(Cy3 channel、80％laser power，80％PMT gain，5μm resolution.)，記錄螢光信號；結果反映隨著雜交體系中甘草酸分子濃度的逐步提高，NF-κB蛋白與微陣列晶片上Ig-κB靶點結合的數量不斷下降，證明NF-κB檢測DNA微陣列晶片能夠用於高通量shaixuan篩選NF-κB/dsDNA相互作用幹預性組合化學及天然生物分子。
權利要求
1.一種檢測核因子-κB(Nuclear Factor-κB，NF-κB)的雙鏈DNA微陣列晶片(double-stranded DNA microarray chip，dsDNA microarray chip)及其製備(Fabrication)方法，其特徵在於該微陣列晶片具有如下結構、功能及製備特徵(a)NF-κB檢測dsDNA微陣列晶片的結構特徵NF-κB檢測dsDNA微陣列晶片由固相支持物及固定在固相支持物表面的dsDNA微陣列構成，該dsDNA微陣列由大量固定在固相支持物表面的dsDNA探針分子文庫(library)組成，文庫中不同的dsDNA探針分子上有DNA序列不同的NF-κB轉錄因子結合位點(DNA-binding sites)。(b)NF-κB檢測dsDNA微陣列晶片的功能特徵NF-κB檢測dsDNA微陣列晶片可以依靠序列特異性DNA結合蛋白NF-κB轉錄因子與晶片dsDNA探針分子上NF-κB的DNA結合位點發生結合反應，實現對被檢測物中NF-κB蛋白的高通量檢測，發揮多項生物功能，包括①確定特定細胞核抽提物或溶液中不同NF-κB/Re1家族蛋白包括Re1A/p65、Re1B、c-Re1、NF-κB1/p50和NF-κB2/p52的表達種類；②確定特定細胞核抽提物或溶液中不同NF-κB/Re1家族蛋白如Re1A/p65、Re1B、c-Re1、NF-κB1/p50和NF-κB2/p52的表達水平和活化程度；③確定不同NF-κB/Re1家族蛋白與大量突變型及野生型dsDNA靶點的相互作用的特異性與親合性特徵；④確定NF-κB/Re1蛋白與大量突變型及野生型dsDNA靶點相互作用的鹼基和胺基酸鍵合規律；⑤確定NF-κB/Re1蛋白dsDNA結合靶點的鹼基組成矩陣(matrix)，預測新的NF-κB/Re1蛋白dsDNA結合靶點，並從全基因組DNA序列中搜索預測的新的NF-κB/Re1蛋白dsDNA結合靶點，尋找這些dsDNA結合靶點的上、下遊基因，研究這些基因是否受到NF-κB/Re1蛋白的表達調控，從而鑑定新的NF-κB/Re1蛋白調控基因；⑥通過鑑定新的NF-κB/Re1蛋白調控基因，並結合已知的NF-κB/Re1蛋白調控基因，構建全基因組NF-κB/Re1蛋白基因表達調控網絡；⑦篩選NF-κB/Re1蛋白dsDNA靶點序列特異性結合組合化學分子及天然生物分子；⑧篩選NF-κB/Re1蛋白與dsDNA靶點相互作用幹預性組合化學分子及天然生物分子。(c)NF-κB檢測dsDNA微陣列晶片的製備方法NF-κB檢測dsDNA微陣列晶片的製備方法包括如下9種①固相化學合成兩條鹼基序列完全互補的寡核苷酸，其中寡核苷酸上嵌合NF-κB結合位點，通過液相復性成為雙分子(bimolecular)雙鏈寡核苷酸，再點樣連接固定到固相基質表面，形成NF-κB檢測dsDNA微陣列晶片(雙分子寡核苷酸復性點樣法)；②固相化學合成兩條鹼基序列完全互補的寡核苷酸，其中寡核苷酸上嵌合NF-κB結合位點，先將其中化學修飾的一條寡核苷酸點樣連接固定到固相基質表面，形成單鏈DNA微陣列晶片，再用互補的另一條寡核苷酸雜交復性成為雙分子(bimolecular)雙鏈寡核苷酸，形成NF-κB檢測dsDNA微陣列晶片(雙分子寡核苷酸點樣復性法)；③固相化學合成兩條寡核苷酸，其中一條較長寡核苷酸上嵌合NF-κB結合位點，另一條較短的寡核苷酸作為通用引物，先將化學修飾的較長寡核苷酸點樣連接固定到固相基質表面，形成單鏈DNA微陣列晶片，再與通用引物寡核苷酸雜交復性成為部分雙分子(partialbimolecular)雙鏈寡核苷酸，再用DNA聚合酶進行在片延伸反應，使部分雙分子雙鏈寡核苷酸成為完整雙分子(complete bimolecular)雙鏈寡核苷酸，形成NF-κB檢測dsDNA微陣列晶片(雙分子寡核苷酸通用引物點樣復性延伸法)；④固相化學合成兩條寡核苷酸，其中一條較長寡核苷酸上嵌合NF-κB結合位點，另一條較短的寡核苷酸作為通用引物，先將化學修飾的較長寡核苷酸與通用引物寡核苷酸在液相雜交復性成為部分雙分子(partial bimolecular)雙鏈寡核苷酸，將復性產物點樣連接固定到固相基質表面，形成部分雙分子雙鏈寡核苷酸微陣列晶片，再用DNA聚合酶進行在片延伸反應，使部分雙分子雙鏈寡核苷酸成為完整雙分子(complete bimolecular)雙鏈寡核苷酸，形成NF-κB檢測dsDNA微陣列晶片(雙分子寡核苷酸通用引物復性點樣延伸法)；⑤固相化學合成兩條寡核苷酸，其中一條較長寡核苷酸上嵌合NF-κB結合位點，另一條較短的寡核苷酸作為通用引物，先將化學修飾的較長寡核苷酸與通用引物寡核苷酸在液相雜交復性成為部分雙分子(partial bimolecular)雙鏈寡核苷酸，再用DNA聚合酶進行延伸反應，使部分雙分子雙鏈寡核苷酸成為完整雙分子(complete bimolecular)雙鏈寡核苷酸，將延伸產物點樣連接固定到固相基質表面，形成NF-κB檢測dsDNA微陣列晶片(雙分子寡核苷酸通用引物復性延伸點樣法)；⑥合成一條長寡核苷酸，使寡核苷酸含有兩段鏈內反向互補序列，且反向互補序列內含有NF-κB結合位點，將復性寡核苷酸點樣連接固定到固相基質表面，形成寡核苷酸微陣列晶片，通過變性再復性成為單分子(unimolecular)雙鏈寡核苷酸微陣列晶片，形成NF-κB檢測dsDNA微陣列晶片；此法也可以先在液相進行變性再復性，然後點樣連接固定到固相基質表面，形成寡核苷酸微陣列晶片(單分子鏈內互補法)；⑦合成一條較短的寡核苷酸，使寡核苷酸含有NF-κB結合位點，並且在其3′端(羥基)含有兩段鏈內反向互補序列，將寡核苷酸點樣連接固定(5′端)到固相基質表面，形成寡核苷酸微陣列晶片，再通過變性、再復性和DNA聚合酶進行在片延伸反應，製備單分子(unimolecular)雙鏈寡核苷酸微陣列晶片，形成NF-κB檢測dsDNA微陣列晶片形成NF-κB檢測dsDNA微陣列晶片(單分子點樣復性發卡引物延伸法)；⑧合成兩條寡核苷酸，使其中寡核苷酸1含有NF-κB結合位點，並且在其磷酸化的3′端含一段核苷酸序列，該段核苷酸能夠與寡核苷酸2的3′端一段核苷酸序列互補；寡核苷酸2在5′端含有兩段鏈內反向互補序列，且兩段鏈內反向互補序列間有一個或多個C3dT氨基或其他化學修飾基團；在液相內將兩條寡核苷酸復性後點樣連接固定(C3dT氨基或其他化學修飾基團)到固相基質表面，形成寡核苷酸微陣列晶片；再通過DNA聚合酶進行在片延伸反應，製備單分子(unimolecular)雙鏈寡核苷酸微陣列晶片，形成NF-κB檢測dsDNA微陣列晶片形成NF-κB檢測dsDNA微陣列晶片(單分子復性連接點樣發卡引物延伸法)；⑨合成一條較長寡核苷酸，使寡核苷酸含有NF-κB結合位點，並且在其3′端(羥基)含兩段鏈內反向互補序列，且兩段鏈內反向互補序列間有一個或多個C3dT氨基或其他化學修飾基團；將寡核苷酸復性後點樣連接固定(C3dT氨基或其他化學修飾基團)到固相基質表面，形成寡核苷酸微陣列晶片；再通過變性、再復性和DNA聚合酶進行在片延伸反應，製備單分子(unimolecular)雙鏈寡核苷酸微陣列晶片，形成NF-κB檢測dsDNA微陣列晶片形成NF-κB檢測dsDNA微陣列晶片(C6dT單分子點樣復性發卡引物延伸法)。
2.根據權利要求1所述的NF-κB檢測dsDNA微陣列晶片，其結構特徵在於(a)中固定或承載dsDNA探針分子的固相支持物包括剛性和半剛性的材料，如硝酸纖維素膜、尼龍膜、LB膜、(聚)四氟乙烯膜、(聚)偏二氟乙烯膜，聚苯乙烯膜，聚碳酸酯、瓊脂糖及聚丙烯醯胺等凝膠、玻璃珠、玻璃管、矽顆粒、玻片、矽片等；固相支持物具有光學平整的表面或孔狀表面，dsDNA探針分子可以固定在固相支持物光學平整的表面上，如玻片、矽片等，也可以固定在固相支持物孔狀表面的孔內，如瓊脂糖及聚丙烯醯胺等凝膠。
3.根據權利要求1所述的NF-κB檢測dsDNA微陣列晶片，其結構特徵在於(a)中固相支持物表面dsDNA探針分子的固定方式多樣，包括藉助化學反應在DNA分子末端(3′或5′端)的化學修飾基團(如氨基)與固相支持物表面的化學基團(如醛基)間形成化學鍵(如Schiff base)，將dsDNA探針分子固定到固相支持物表面；或藉助物理反應，如電荷作用(DNA分子的負電荷與固相支持物表面的正電荷相互吸引)，將dsDNA探針分子固定到固相支持物表面，如帶正電荷的尼龍膜等。
4.根據權利要求1所述的NF-κB檢測dsDNA微陣列晶片，其結構特徵在於(a)中固相支持物表面固定的dsDNA探針分子文庫(library)是由大量不同的dsDNA探針分子組成，不同的dsDNA探針分子上有DNA序列組成不同的NF-κB轉錄因子結合位點(DNA-binding sites)，這些結合位點可以被檢測物中存在的NF-κB轉錄因子識別結合。
5.根據權利要求1所述的NF-κB檢測dsDNA微陣列晶片，其結構特徵在於(a)中不同的dsDNA探針分子上嵌合的DNA序列組成NF-κB轉錄因子的不同結合位點(DNA-binding sites)包括生物基因組DNA序列自然(或野生，natural or wildtype)存在的NF-κB結合位點，如存在於人免疫球蛋白κ輕鏈基因增強子DNA序列和人免疫缺陷病病毒(HIV)基因組DNA長末端(LTR)中的Ig-κB位點(GGGACTTTCC)，以及人工設計的突變NF-κB結合位點，如對野生型NF-κB結合位點進行單鹼基突變(single nucleotide mutants)或多鹼基突變(multiple nucleotide mutants)後形成的NF-κB結合位點，這些可以用來揭示NF-κB與其DNA結合位點相互作用中的重要生物學規律。
6.根據權利要求1所述的NF-κB檢測dsDNA微陣列晶片，其功能特徵在於(b)被檢測物中存在的NF-κB轉錄因子與晶片dsDNA上嵌合的NF-κB結合位點發生的結合反應是一種生物大分子間的識別性結合反應。
7.根據權利要求1所述的NF-κB檢測dsDNA微陣列晶片，其功能特徵在於(b)中被檢測物中存在的NF-κB轉錄因子與晶片dsDNA上NF-κB結合位點發生的結合反應，是依靠蛋白質分子上特定胺基酸和dsDNA分子上特定核苷酸間形成氫鍵、範德華力等化學鍵以及電荷作用而實現的。
8.根據權利要求1所述的NF-κB檢測dsDNA微陣列晶片，其功能特徵在於(b)中被檢測物中存在的NF-κB轉錄因子與晶片dsDNA上NF-κB結合位點的結合反應，不同的dsDNA結合位點能夠與不同的NF-κB蛋白以不同的親合性和特異性進行結合作用。
9.根據權利要求1所述的NF-κB檢測dsDNA微陣列晶片，其功能特徵在於(b)中NF-κB檢測dsDNA微陣列晶片反應的被檢測物形式多樣，包括特定培養細胞如HeLa的全細胞抽提物(whole cell extract)、特定培養細胞的細胞核抽提物(cell nuclear extract)、特定組織的蛋白抽提物(tissue extract)、特定培養原核或真核細胞中NF-κB表達載體表達產物、人工體外表達系統中NF-κB表達載體表達產物、自然細胞或人工體外表達系統純化的NF-κB蛋白等。
10.根據權利要求1所述的NF-κB檢測dsDNA微陣列晶片，其功能特徵在於(b)中NF-κB檢測dsDNA微陣列晶片反應的被檢測物中存在的NF-κB蛋白包括所有野生型NF-κB蛋白如Re1A/p65、Re1B、c-Re1、NF-κB1/p50、NF-κB2/p52，以及通過如定點突變等構建的表達載體表達製備的突變型NF-κB蛋白。
11.根據權利要求1所述的NF-κB檢測dsDNA微陣列晶片，其功能特徵在於(b)中NF-κB檢測dsDNA微陣列晶片能夠實現對被檢測物中存在的NF-κB蛋白的高通量檢測(high-throughput detection)，即NF-κB檢測dsDNA微陣列晶片與被檢測物的一次結合反應，可以獲得大量的生物信息。
12.根據權利要求1所述的NF-κB檢測dsDNA微陣列晶片，其功能特徵在於(b)中NF-κB檢測dsDNA微陣列晶片能夠定性檢測(qualitative detection)被檢測物中的NF-κB蛋白，即不同NF-κB/Re1家族蛋白，包括Re1A/p65、Re1B、c-Re1、NF-κB1/p50和NF-κB2/p52，確定細胞內NF-κB/Re1家族蛋白的表達種類。
13.根據權利要求1所述的NF-κB檢測dsDNA微陣列晶片，其功能特徵在於(b)中NF-κB檢測dsDNA微陣列晶片能夠定量檢測(quantitative detection)被檢測物中的NF-κB蛋白，即不同NF-κB/Re1家族蛋白，包括Re1A/p65、Re1B、c-Re1、NF-κB1/p50和NF-κB2/p52在特定細胞或組織中的表達量和活化水平。
14.根據權利要求1所述的NF-κB檢測dsDNA微陣列晶片，其功能特徵在於(b)中NF-κB檢測dsDNA微陣列晶片上不同的dsDNA結合位點能夠與不同的NF-κB蛋白以不同的特異性(specificity)進行結合作用，即不同的dsDNA結合位點能夠識別並結合特定的NF-κB蛋白。
15.根據權利要求1所述的NF-κB檢測dsDNA微陣列晶片，其功能特徵在於(b)中NF-κB檢測dsDNA微陣列晶片上不同的dsDNA結合位點能夠與不同的NF-κB蛋白以不同的親合性(affinity)進行結合作用，即不同的dsDNA結合位點能夠以不同的結合強度識別並結合特定的NF-κB蛋白。
16.根據權利要求1所述的NF-κB檢測dsDNA微陣列晶片，其功能特徵在於(b)中運用NF-κB檢測dsDNA微陣列晶片實驗構建的全基因組NF-κB/Re1蛋白基因表達調控網絡，是指將通過NF-κB檢測dsDNA微陣列晶片實驗預測和鑑定的新的NF-κB結合位點調控的基因整合到已知的NF-κB調控的基因網絡中，建立全基因組中受NF-κB/Re1蛋白調控的所有基因的關係網絡，這一全基因組NF-κB/Re1蛋白基因表達調控網絡對於NF-κB相關基礎分子學、生物醫學研究至管重要，同時這一調控網絡能夠確定針對NF-κB/Re1蛋白的藥物篩選的所有靶點。
17.根據權利要求1所述的NF-κB檢測dsDNA微陣列晶片，其功能特徵在於(b)中NF-κB檢測dsDNA微陣列晶片篩選的dsDNA靶點序列特異性結合組合化學分子及天然生物分子，是指那些能夠和NF-κB蛋白的不同dsDNA位點直接結合，但不與NF-κB蛋白發生結合作用，而幹擾NF-κB蛋白與dsDNA位點正常結合的組合化學分子及天然生物分子。
18.根據權利要求1所述的NF-κB檢測dsDNA微陣列晶片，其功能特徵在於(b)中NF-κB檢測dsDNA微陣列晶片篩選的NF-κB/Re1蛋白與dsDNA靶點相互作用幹預性組合化學分子及天然生物分子，是指那些能夠通過與NF-κB蛋白的結合影響NF-κB蛋白與dsDNA靶點結合的組合化學分子及天然生物分子；或同時與NF-κB蛋白和dsDNA靶點發生作用影響NF-κB蛋白與dsDNA靶點結合的組合化學分子及天然生物分子；或不與NF-κB蛋白和dsDNA靶點直接發生作用，但可以插入(嵌入)NF-κB蛋白和dsDNA靶點的作用界面空間，從而影響NF-κB蛋白與dsDNA靶點結合的組合化學分子及天然生物分子。
19.根據權利要求1所述的NF-κB檢測dsDNA微陣列晶片製備方法(c)，其特徵在於方法①、②中化學合成的兩條鹼基序列完全互補的寡核苷酸，為了便於將寡核苷酸固定到化學修飾的固相基質表面，可以在其中任一條鏈的任一端(3′或5′端)連接化學基團(如氨基等)，寡核苷酸修飾的化學基團與固相基質表面修飾的化學基團可以發生化學反應，形成共價鍵，從而將寡核苷酸連接固定在固相基質表面。
20.根據權利要求1所述的NF-κB檢測dsDNA微陣列晶片製備方法(c)，其特徵在於方法①、②中化學合成的兩條鹼基序列完全互補的寡核苷酸，寡核苷酸上嵌合的NF-κB結合位點兩端都有一定長的鹼基作為旁側序列(最好大於5個鹼基)，避免將NF-κB結合位點暴露的寡核苷酸端部，而且連接到固相基質表面一側的旁側序列應較長(最好大於10個鹼基)，避免寡核苷酸上NF-κB結合位點離固相基質表面太近，妨礙NF-κB與DNA的結合。
21.根據權利要求1所述的NF-κB檢測dsDNA微陣列晶片製備方法(c)，其特徵在於方法③中化學合成的兩條寡核苷酸，其中嵌合NF-κB結合位點的寡核苷酸最好進行末端(3′或5′端)化學基團(如氨基等)修飾，修飾化學基團與固相基質表面修飾的化學基團可以發生化學反應，形成共價鍵，從而將寡核苷酸連接固定在固相基質表面；並且嵌合NF-κB結合位點的寡核苷酸兩端都有一定長的鹼基作為旁側序列，避免將NF-κB結合位點暴露的寡核苷酸端部。
22.根據權利要求1所述的NF-κB檢測dsDNA微陣列晶片製備方法(c)，其特徵在於方法③中嵌合NF-κB結合位點的寡核苷酸若進行3′端化學基團(如氨基等)修飾，則3′端旁側序列應較長(最好大於10個鹼基)，並且3′端旁側序列中含有與通用引物鹼基完全配對互補的序列，以便通用引物復性該處，進行後面的聚合酶延伸反應。
23.根據權利要求1所述的NF-κB檢測dsDNA微陣列晶片製備方法(c)，其特徵在於方法③中嵌合NF-κB結合位點的寡核苷酸若進行5′端化學基團(如氨基等)修飾，則5′端和5′端旁側序列都應較長(最好大於10個鹼基)，並且3′端旁側序列中含有與通用引物鹼基完全配對互補的序列，以便通用引物復性該處，進行後面的聚合酶延伸反應；5′端旁側序列較長(最好大於10個鹼基)，避免寡核苷酸上NF-κB結合位點離固相基質表面太近，妨礙NF-κB與DNA的結合。
24.根據權利要求1所述的NF-κB檢測dsDNA微陣列晶片製備方法(c)，其特徵在於方法④、⑤固相化學合成的嵌合NF-κB結合位點的寡核苷酸兩端旁側序列中，其中之一應含有與通用引物鹼基完全配對互補的序列，以便通用引物復性該處，進行後面的聚合酶延伸反應。
25.根據權利要求1所述的NF-κB檢測dsDNA微陣列晶片製備方法(c)，其特徵在於方法④、⑤固相化學合成的兩條寡核苷酸，可以對兩條寡核苷酸的任一條進行末端化學修飾，以便將寡核苷酸固定到固相基質表面。
26.根據權利要求22所述的寡核苷酸的末端化學修飾，其特徵在於若化學修飾嵌合NF-κB結合位點的寡核苷酸，則其化學修飾端旁側序列應較長(最好大於10個鹼基)；這種情況下，若化學修飾端為3′端，則位於3′端的旁側序列最好含有通用引物結合序列，而寡核苷酸5′端為較短的旁側序列，以便縮短合成的寡核苷酸，降低合成成本；若化學修飾端為5′端，則位於3′端的旁側序列必須含有通用引物結合序列，此時，寡核苷酸的NF-κB結合位點兩端都為較長的旁側序列。
27.根據權利要求22所述的寡核苷酸的末端化學修飾，其特徵在於若化學修飾通用引物寡核苷酸，則其化學修飾端必須是其5′端，相應嵌合NF-κB結合位點的寡核苷酸3′端旁側序列較長(最好大於10個鹼基)，並含有通用引物結合序列，其5′端可為較短的旁側序列，以便縮短合成的寡核苷酸，降低合成成本。
28.根據權利要求1所述的NF-κB檢測dsDNA微陣列晶片製備方法(c)，其特徵在於方法⑥固相化學合成的長寡核苷酸，其任一端可以進行末端化學修飾，以便將寡核苷酸固定到固相基質表面。
29.根據權利要求1所述的NF-κB檢測dsDNA微陣列晶片製備方法(c)，其特徵在於方法⑥固相化學合成的長寡核苷酸，其兩端鏈內反向互補序列中應嵌合NF-κB結合位點，NF-κB結合位點間的序列應較長，這些序列應在緊接NF-κB結合位點的部分能夠復性後形成一段互補雙鏈(最好大於5個鹼基)，以便保護NF-κB結合位點，有利於NF-κB蛋白結合，其餘鹼基可有可無，若有，可以反向配對互補(復性後形成雙鏈)，也可以不配對互補(復性後形成環(loop))。以進行末端化學修飾，以便將寡核苷酸固定到固相基質表面。應含有與通用引物鹼基完全配對互補的序列，以便通用引物復性該處，進行後面的聚合酶延伸反應。
30.根據權利要求1所述的NF-κB檢測dsDNA微陣列晶片製備方法(c)，其特徵在於方法⑥固相化學合成的長寡核苷酸，其與固相基質表面連接的一端，應含有較長的旁側序列(最好大於10個鹼基)，另一端可以較短一些，但在復性後緊接NF-κB結合位點處應形成5個鹼基以上的雙鏈，以便保護NF-κB結合位點，有利於NF-κB蛋白結合。
31.根據權利要求1所述的NF-κB檢測dsDNA微陣列晶片製備方法(c)，其特徵在於方法⑦固相化學合成的寡核苷酸，其與固相基質表面連接的5′端應含有較長的旁側序列(最好大於10個鹼基)；3′端兩反向互補序列長度應大於5個鹼基，並且GC含量較高，以便復性時易於形成穩定的發卡引物；3′端兩反向互補序列間鹼基可有可無，若有，應較少，有利於兩反向互補序列復性；寡核苷酸復性、延伸反應後在NF-κB結合位點遠離固相支持物表面的一側應形成至少5個鹼基以上的雙鏈旁側序列，以便保護NF-κB結合位點，有利於NF-κB蛋白結合。
32.根據權利要求1所述的NF-κB檢測dsDNA微陣列晶片製備方法(c)，其特徵在於方法⑧固相化學合成的寡核苷酸，其與固相基質表面連接的寡核苷酸2(通用單鏈寡核苷酸片段)5′端兩反向鹼基互補序列間插入的C6胺化的脫氧胸腺嘧啶核苷酸，可以被其他化學修飾的核苷酸或化學分子代替，但代替分子必須與固相支持物表面相應的化學基團發生化學反應，形成穩定牢固的化學鍵，從而將寡核苷酸連接到固相支持物表面。
33.根據權利要求1所述的NF-κB檢測dsDNA微陣列晶片製備方法(c)，其特徵在於方法⑧固相化學合成的寡核苷酸，其與固相基質表面連接的寡核苷酸2(通用單鏈寡核苷酸片段)5′端兩反向鹼基互補序列間插入的C6胺化的脫氧胸腺嘧啶核苷酸，其數目可變，可以有一個，可以有多個，但數目太多不利寡核苷酸2鏈內復性。
34.根據權利要求1所述的NF-κB檢測dsDNA微陣列晶片製備方法(c)，其特徵在於方法⑧固相化學合成的寡核苷酸，其與固相基質表面連接的寡核苷酸2(通用單鏈寡核苷酸片段)5′端兩反向鹼基互補序列最好不要低於10個鹼基，且GC含量較高，以利於鏈內復性。
35.根據權利要求1所述的NF-κB檢測dsDNA微陣列晶片製備方法(c)，其特徵在於方法⑧固相化學合成的寡核苷酸，其與固相基質表面連接的寡核苷酸2(通用單鏈寡核苷酸片段)3′端突出序列(overhang sequence)最好不要低於10個鹼基，且GC含量較高，以利於其與寡核苷酸1(靶寡核苷酸)的復性。
36.根據權利要求1所述的NF-κB檢測dsDNA微陣列晶片製備方法(c)，其特徵在於方法⑧固相化學合成的嵌合NF-κB結合位點的寡核苷酸1(靶寡核苷酸)，其3′最末端必須是與寡核苷酸23′端突出序列(overhang sequence)嚴格配對的鹼基序列，其鹼基數與寡核苷酸23′端突出序列鹼基數必須相等；寡核苷酸15′端NF-κB結合位點旁側序列最好不要少於5個鹼基。
37.根據權利要求1所述的NF-κB檢測dsDNA微陣列晶片製備方法(c)，其特徵在於方法⑧固相化學合成的寡核苷酸1(靶寡核苷酸)3′最末端與寡核苷酸23′端突出序列(overhang sequence)互補配對序列、寡核苷酸23′端突出序列(overhang sequence)、寡核苷酸2(通用單鏈寡核苷酸片段)5′端兩反向鹼基互補的Tm值(復性溫度)最好相同，以便兩寡核苷酸的雜交復性。
38.根據權利要求1所述的NF-κB檢測dsDNA微陣列晶片製備方法(c)，其特徵在於方法⑧固相化學合成的寡核苷酸1(靶寡核苷酸)和寡核苷酸2(通用單鏈寡核苷酸片段)，在液相反應體系中只經過退火和核酸連接酶連接兩個反應就形成3′端帶發卡結構的單分子寡核苷酸，而不需要其他更多反應。
39.根據權利要求1所述的NF-κB檢測dsDNA微陣列晶片製備方法(c)，其特徵在於方法⑧固相化學合成的寡核苷酸1(靶寡核苷酸)和寡核苷酸2(通用單鏈寡核苷酸片段)，在晶片製備中可以在液相反應體系中經過退火和核酸連接酶連接兩個反應形成3′端帶發卡結構的單分子寡核苷酸後再點樣；也可以在液相反應體系中先退火形成3′端帶發卡結構的、含有一切刻(nick)的雙分子寡核苷酸再點樣，而點樣後再進行在片核酸連接酶連接反應，形成形成3′端帶發卡結構的單分子寡核苷酸。
40.根據權利要求1所述的NF-κB檢測dsDNA微陣列晶片製備方法(c)，其特徵在於方法⑨固相化學合成的寡核苷酸，其3′端兩反向鹼基互補序列最好不要低於10個鹼基，且GC含量較高，以利於鏈內復性；其5′端NF-κB結合位點旁側序列最好不要少於5個鹼基。
41.根據權利要求1所述的NF-κB檢測dsDNA微陣列晶片製備方法(c)，其特徵在於方法⑨固相化學合成的寡核苷酸，其3′端兩反向鹼基互補序列間插入的C6胺化的脫氧胸腺嘧啶核苷酸，可以被其他化學修飾的核苷酸或化學分子代替，但代替分子必須與固相支持物表面相應的化學基團發生化學反應，形成穩定牢固的化學鍵，從而將寡核苷酸連接到固相支持物表面。
42.根據權利要求1所述的NF-κB檢測dsDNA微陣列晶片製備方法(c)，其特徵在於方法⑨固相化學合成的寡核苷酸，其3′端兩反向鹼基互補序列間插入的C6胺化的脫氧胸腺嘧啶核苷酸，其數目可變，可以有一個，可以有多個，但數目太多不利寡核苷酸2鏈內復性。
43.根據權利要求1所述的NF-κB檢測dsDNA微陣列晶片製備方法(c)，其特徵在於方法⑨固相化學合成的寡核苷酸，其3′端兩反向鹼基互補序列間除插入C6胺化的脫氧胸腺嘧啶核苷酸外，在C6胺化的脫氧胸腺嘧啶核苷酸兩邊，可以含有其它數目不等的鹼基，這些鹼基復性時，可以互補配對，形成雙鏈，也可以不配對，形成環(loop)，但這些鹼基數目最好少一些，避免影響3′端兩反向鹼基互補序列復性。
44.根據權利要求1所述的NF-κB檢測dsDNA微陣列晶片製備方法(c)，其特徵在於方法⑨中使用的核酸連接酶包括核糖核酸連接酶和脫氧核糖核酸連接酶，如大腸桿菌DNA連接酶、T4連接酶。
45.根據權利要求1所述的NF-κB檢測dsDNA微陣列晶片製備方法(c)，其特徵在於製備晶片所化學合成的寡核苷酸，在NF-κB結合位點中的正常核苷酸可以用其它修飾核苷酸替代，用以研究NF-κB與DNA相互作用的特徵，如使用甲基化核苷酸。
46.根據權利要求1所述的NF-κB檢測dsDNA微陣列晶片製備方法(c)，其特徵在於製備晶片所使用的核酸聚合酶包括核糖核酸聚合酶、脫氧核糖核酸聚合酶及反轉錄酶。
全文摘要
本發明在固相支持物(solid substrates)表面製備一種雙鏈脫氧核糖核酸(double－strandedDNA，dsDNA)微陣列(microarray)，使其dsDNA探針(probes)上嵌合核因子κB(nuclear factorκB，NF－κB)的序列特異性DNA結合位點(sequence－specific DNA－binding sites)，用以高通量檢測(high－throughput detecting)細胞核內NF－κB的含量及篩選dsDNA/NF－κB相互作用幹擾性分子(molecules interfering dsDNA/NF－κB interaction)。本發明首先依靠專利技術(中國專利02112780.8及02137945.9)及其它本發明提出的方法，在固相支持物表面製備dsDNA微陣列，使該dsDNA微陣列上的大量dsDNA探針上含有NF－κB的序列特異性DNA結合位點，再將該dsDNA微陣列與特定細胞核蛋白或NF－κB純蛋白雜交結合，通過NF－κ、B與微陣列靶點dsDNA的相互作用，實現對特定細胞核中NF－κB蛋白的定性或定量測定，或通過檢測在外源分子，如組合化學分子、天然生物分子的存在下，NF－κB與微陣列靶點dsDNA相互作用特徵的改變，篩選能夠幹擾NF－κB與其靶點dsDNA的相互作用的分子，特別是能夠降低NF－κB與其靶點dsDNA結合親合性(binding affinity)的組合化學或天然生物小分子。本發明製備的NF－κB檢測dsDNA微陣列晶片，在基礎分子生物學研究，特別是NF－κB相關基因表達調控和生物醫學研究，如NF－κB相關疾病藥物作用機理研究和藥物性分子篩選中有廣泛而重要的應用價值。
文檔編號C12Q1/68GK1580278SQ0313220
公開日2005年2月16日 申請日期2003年7月31日 優先權日2003年7月31日
發明者王進科, 李同祥, 陸祖宏 申請人:王進科, 李同祥, 陸祖宏, 南京新益華集團有限公司