梅毒螺旋體特異性抗體化學發光檢測試劑盒及其製備方法

2023-06-25 02:27:11

梅毒螺旋體特異性抗體化學發光檢測試劑盒及其製備方法
【專利摘要】梅毒螺旋體特異性抗體化學發光檢測試劑盒及其製備方法，涉及梅毒螺旋體。試劑盒設有外包裝盒、鹼性磷酸酶標記重組抗原瓶、發光底物瓶、梅毒螺旋體特異性抗體陰性對照品瓶、梅毒螺旋體特異性陽性對照品瓶、洗滌液瓶和重組抗原包被微孔板。先製備梅毒螺旋體特異性重組抗原、重組抗原包被微孔板，標記重組抗原的鹼性磷酸酶，再製備發光底物、洗滌液、對照品，最後組裝梅毒螺旋體特異性抗體化學發光檢測試劑盒。可用於臨床標本中梅毒特異性特異性抗體的檢測，採用特異固相，使得免疫及發光反應在較短的時間內快速完成，發光信號大大增強，靈敏度得以提高，檢測時間由此可以縮短，精密性得以改善。
【專利說明】梅毒螺旋體特異性抗體化學發光檢測試劑盒及其製備方法

【技術領域】
[0001]本發明涉及梅毒螺旋體，尤其是涉及採用微孔反應板化學發光方法進行梅毒螺旋體特異性抗體檢測的梅毒螺旋體特異性抗體化學發光檢測試劑盒及其製備方法。

【背景技術】
[0002]梅毒是由梅毒螺旋體引起的性傳播性疾病，近年來在國內的發病率逐年上升，梅毒的防控已列為我國公共衛生服務的主要任務之一。
[0003]梅毒螺旋體不能體外培養，而直接病原學暗視野顯微鏡檢查陽性率不高，血清學實驗包括心磷脂抗體和特異性抗體檢測，心磷脂抗體的假陽性率高，靈敏度低。而梅毒特異性抗體檢測方法包括梅毒螺旋體明膠顆粒凝集試驗(TPPA)、螢光梅毒螺旋體抗體吸收試驗(FTA-ABS)及免疫印跡法(Western-blot)等方法進行檢測，其特異性均較高。化學發光免疫分析是利用抗原抗體反應的高度特異性、高親和力，以及酶促化學發光反應高效率而建立起來的一種超敏感性微量定量測定技術，可以大大提高操作的便捷性，可稱之為當今最敏感、特異的抗體免疫定量測試方法，有著良好應用前景，目前多數化學發光方法採用磁珠作為反應固相，其反應的重複性受磁珠顆粒的大小和均勻的程度影響較大。
[0004]中國專利CN101881772A公開一種基於流式微球載體技術的梅毒螺旋體(TP)抗體檢驗試劑盒及其製備和檢測方法，具體包括用TP重組抗原包被高聚分子微球，用牛血清白蛋白封閉空白結合點，製成特異性TP探針-高聚分子微球；與待測標本共培養捕獲TP抗體，洗滌離心除去未結合的TP抗體，再加入螢光標記的抗人IgG或IgM抗體；使用流式細胞儀檢測微球的螢光強度，對受測抗體進行定性或定量分析。


【發明內容】

[0005]本發明的目的在於提供採用微孔反應板化學發光方法進行梅毒螺旋體特異性抗體檢測的梅毒螺旋體特異性抗體化學發光檢測試劑盒及其製備方法。為梅毒特異性抗體檢測提供高靈敏度、高精密度的檢測的技術手段。
[0006]所述梅毒螺旋體特異性抗體化學發光檢測試劑盒設有外包裝盒、鹼性磷酸酶標記重組抗原瓶、發光底物瓶、梅毒螺旋體特異性抗體陰性對照品瓶、梅毒螺旋體特異性陽性對照品瓶、洗滌液瓶和重組抗原包被微孔板；鹼性磷酸酶標記重組抗原瓶、發光底物瓶、梅毒螺旋體特異性抗體陰性對照品瓶、梅毒螺旋體特異性陽性對照品瓶、洗滌液瓶和重組抗原包被微孔板設在外包裝盒內；鹼性磷酸酶標記重組抗原瓶內裝有鹼性磷酸酶標記重組抗原、發光底物瓶內裝有發光底物、梅毒螺旋體特異性抗體陰性對照品瓶內裝有梅毒螺旋體特異性抗體陰性對照品、梅毒螺旋體特異性陽性對照品瓶內裝有梅毒螺旋體特異性陽性對照品、洗滌液瓶內裝有洗滌液。
[0007]所述梅毒螺旋體特異性抗體化學發光檢測試劑盒的製備方法，包括以下步驟:
[0008]I)製備梅毒螺旋體特異性重組抗原:
[0009]採用基因克隆技術，PCR擴增編碼梅毒螺旋體抗原的DNA，並插入大腸桿菌中使其表達，得梅毒螺旋體特異性抗原TPN17和TPN47 ；
[0010]2)製備重組抗原包被微孔板
[0011 ] 將步驟I)中的梅毒螺旋重組抗原TPN17和TPN47用包被緩衝液稀釋至20 μ g/mL,以每孔0.1mL加入微孔板中，4?包被24h ;取出抗原板,風乾；用0.01mmol/L pH7.4磷酸鹽緩衝液配製的1.0%脫脂奶粉，每孔0.2mL，4°C封閉24h，取出用磷酸鹽緩衝液洗滌5次，室溫風乾、消毒，製備重組抗原包被微孔板，密封備用；
[0012]3)重組抗原的鹼性磷酸酶標記
[0013]鹼性磷酸酶經過碘酸鈉活化，分別與步驟I)重組抗原分子的-NH2偶聯，形成鹼性磷酸酶標記重組抗原；
[0014]4)發光底物製備
[0015]人工合成金剛烷胺類發光底物(AMPPD)及其增強劑，均經無菌過濾，製備發光底物工作液；
[0016]5)洗滌液製備
[0017]洗滌液為溶有Tween-20的磷酸鹽緩衝液，其中Tween-20的終濃度為0.01% ;
[0018]6)對照品
[0019]梅毒螺旋體特異性抗體陰性對照品:由非梅毒感染的健康人群血清配製而成；
[0020]梅毒螺旋體特異性陽性對照品:梅毒患者的特異性抗體陽性血清配製而成；
[0021 ] 7)製備梅毒螺旋體特異性抗體化學發光檢測試劑盒
[0022]將鹼性磷酸酶標記重組抗原、發光底物、洗滌液、梅毒螺旋體特異性抗體陰性對照品、梅毒螺旋體特異性抗體陽性對照品分別裝入瓶內，再將鹼性磷酸酶標記重組抗原瓶、發光底物瓶、梅毒螺旋體特異性抗體陰性對照品瓶、梅毒螺旋體特異性陽性對照品瓶、洗滌液瓶和重組抗原包被微孔板裝入外包裝盒，組成梅毒螺旋體特異性抗體化學發光檢測試劑盒。
[0023]在步驟7)中，所述瓶可採用聚乙烯瓶。
[0024]本發明提供了一種梅毒螺旋體梅毒螺旋體特異性抗體化學發光檢測試劑盒，可用於臨床標本中梅毒特異性特異性抗體的檢測，採用特異固相，使得免疫及發光反應在較短的時間內快速完成，發光信號大大增強，靈敏度得以提高，檢測時間由此可以縮短，精密性得以改善。
[0025]本發明採用採用微孔反應板化學發光法進行梅毒螺旋體特異性抗體的檢測，採用特異固相，使得免疫及發光反應在較短的時間內快速完成，發光信號大大增強，靈敏度得以提高，檢測時間由此可以縮短，精密性得以改善。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0026]圖1為本發明所述梅毒螺旋體特異性抗體化學發光檢測試劑盒實施例的結構組成示意圖。

【具體實施方式】
[0027]以下實施例將結合附圖對本發明作進一步的說明。
[0028]實施例1
[0029]參見圖1，所述梅毒螺旋體特異性抗體化學發光檢測試劑盒設有外包裝盒1、鹼性磷酸酶標記重組抗原瓶2、發光底物瓶3、梅毒螺旋體特異性抗體陰性對照品瓶4、梅毒螺旋體特異性陽性對照品瓶5、洗滌液瓶6和重組抗原包被微孔板7 ;鹼性磷酸酶標記重組抗原瓶2、發光底物瓶3、梅毒螺旋體特異性抗體陰性對照品瓶4、梅毒螺旋體特異性陽性對照品瓶5、洗滌液瓶6和重組抗原包被微孔板7設在外包裝盒I內；鹼性磷酸酶標記重組抗原瓶2內裝有鹼性磷酸酶標記重組抗原、發光底物瓶3內裝有發光底物、梅毒螺旋體特異性抗體陰性對照品瓶4內裝有梅毒螺旋體特異性抗體陰性對照品、梅毒螺旋體特異性陽性對照品瓶5內裝有梅毒螺旋體特異性陽性對照品、洗滌液瓶6內裝有洗滌液。
[0030]所述梅毒螺旋體特異性抗體化學發光檢測試劑盒及其製備，包括以下步驟:
[0031](I)製備梅毒螺旋體特異性重組抗原:
[0032]採用基因克隆技術，PCR擴增編碼梅毒螺旋體抗原的DNA，並插入大腸桿菌中使其表達，得梅毒螺旋體特異性抗原TPN17和TPN47。
[0033](2)製備重組抗原包被微孔板
[0034]將步驟(I)中的梅毒螺旋重組抗原TPN17和TPN47用包被緩衝液稀釋至20 μ g/mL,以每孔0.1mL加入微孔板中，4?包被24h ;取出抗原板,風乾；用0.01mmol/L pH7.4磷酸鹽緩衝液配製的1.0%脫脂奶粉，每孔0.2mL，4°C封閉24h，取出用磷酸鹽緩衝液洗滌5次，室溫風乾、消毒，製備重組抗原包被微孔板，密封備用。
[0035](3)重組抗原的鹼性磷酸酶標記
[0036]鹼性磷酸酶經過碘酸鈉活化，分別與步驟(I)重組抗原分子的-NH2偶聯，形成鹼性磷酸酶標記重組抗原。
[0037](4)發光底物製備
[0038]人工合成金剛烷胺類發光底物(AMPPD)及其增強劑，均經無菌過濾，製備發光底物工作液。
[0039](5)洗滌液製備
[0040]洗滌液為溶有Tween-20的磷酸鹽緩衝液，其中Tween-20的終濃度為0.01 %。
[0041](6)對照品
[0042]梅毒螺旋體特異性抗體陰性對照品:由非梅毒感染的健康人群血清配製而成；
[0043]梅毒螺旋體特異性陽性對照品:梅毒患者的特異性抗體陽性血清配製而成；
[0044](7)製備梅毒螺旋體抗體高通量檢測試劑盒
[0045]重組抗原包被微孔板、鹼性磷酸酶標記重組抗原、發光底物、洗滌液、梅毒螺旋體特異性抗體陰性對照品、梅毒螺旋體特異性抗體陽性對照品和外包裝盒共同組成的梅毒螺旋體特異性抗體化學發光檢測試劑盒。
[0046]步驟(7)所述鹼性磷酸酶標記重組抗原、發光底物、洗滌液、梅毒螺旋體特異性抗體陰性對照品、梅毒螺旋體特異性抗體陽性對照品均裝在相應的聚乙烯瓶中。
[0047]實施例2
[0048]以下給出採用梅毒螺旋體抗體高通量檢測試劑盒檢測患者的臨床標本中的梅毒螺旋體特異性抗體:
[0049]1、標本處理:血清:靜脈血5mL,置37°C水浴30min, 3000g離心1min,上清為檢測樣品備用。
[0050]2、加樣:加100 μ L的標本於反應板中，同時作空白、陰性和陽性對照孔。37°C孵育Ih0
[0051]3、洗滌:37°C反應30min後，被測定的梅毒特異性抗體與微孔板上包被的梅毒特異性重組抗原結合，洗滌分離未結合的游離成分；
[0052]4、加入鹼性磷酸酶標記重組抗原，再加入發光底物工作液，鹼性磷酸酶催化底物脫磷酸基，並發出463nm的可見光。於第10_20min測定各加樣品孔的相對發光強度單位(relative light units, RLU)。樣品的RLU與待測梅毒抗體濃度正相相關。
[0053]實施例3
[0054]以下給出梅毒螺旋體抗體高通量檢測試劑盒的性能檢定。
[0055](I)陽性標本符合率
[0056]用梅毒特異性抗體陽性參比血清50份檢定，計算陽性符合率。
[0057](2)陰性標本符合率
[0058]用梅毒特異性抗體陰性參比血清50份檢定，計算陰性符合率。
[0059](3)批內差異
[0060]同一批次試劑盒,用特徵性血清檢測,要求CV彡10%。
[0061](4)批間差異
[0062]不同批次試劑盒,用特徵性血清檢測,要求CV ( 12%。
[0063](5)幹擾試驗
[0064]用溶血、脂血和黃疸標本各50例進行的幹擾實驗檢測。
[0065](6)交叉反應
[0066]採用本試劑盒，進行系統性紅斑狼瘡(η = 50)、類風溼病(η = 50)、免疫性肝炎(η=50)等自身免疫系統疾病的檢測，觀察交叉反應。
[0067](7)穩定性檢測
[0068]應用Arrhenius法則,將試劑盒放置37°C 20天後檢測，以上各項指標無顯著變化，確保成品在室溫乾燥條件下保存，有效期為18個月。
【權利要求】
1.梅毒螺旋體特異性抗體化學發光檢測試劑盒，其特徵在於設有外包裝盒、鹼性磷酸酶標記重組抗原瓶、發光底物瓶、梅毒螺旋體特異性抗體陰性對照品瓶、梅毒螺旋體特異性陽性對照品瓶、洗滌液瓶和重組抗原包被微孔板；鹼性磷酸酶標記重組抗原瓶、發光底物瓶、梅毒螺旋體特異性抗體陰性對照品瓶、梅毒螺旋體特異性陽性對照品瓶、洗滌液瓶和重組抗原包被微孔板設在外包裝盒內；鹼性磷酸酶標記重組抗原瓶內裝有鹼性磷酸酶標記重組抗原、發光底物瓶內裝有發光底物、梅毒螺旋體特異性抗體陰性對照品瓶內裝有梅毒螺旋體特異性抗體陰性對照品、梅毒螺旋體特異性陽性對照品瓶內裝有梅毒螺旋體特異性陽性對照品、洗滌液瓶內裝有洗滌液。
2.如權利要求1所述梅毒螺旋體特異性抗體化學發光檢測試劑盒的製備方法，其特徵在於包括以下步驟: 1)製備梅毒螺旋體特異性重組抗原: 採用基因克隆技術，PCR擴增編碼梅毒螺旋體抗原的DNA，並插入大腸桿菌中使其表達，得梅毒螺旋體特異性抗原TPN17和TPN47 ； 2)製備重組抗原包被微孔板 將步驟I)中的梅毒螺旋重組抗原TPN17和TPN47用包被緩衝液稀釋至20 μ g/mL,以每孔0.1mL加入微孔板中，411C包被24h ;取出抗原板,風乾；用0.01mmol/L pH7.4磷酸鹽緩衝液配製的1.0%脫脂奶粉，每孔0.2mL，4°C封閉24h，取出用磷酸鹽緩衝液洗滌5次，室溫風乾、消毒，製備重組抗原包被微孔板，密封備用； 3)重組抗原的鹼性磷酸酶標記 鹼性磷酸酶經過碘酸鈉活化，分別與步驟I)重組抗原分子的-NH2偶聯，形成鹼性磷酸酶標記重組抗原； 4)發光底物製備 人工合成金剛烷胺類發光底物及其增強劑，均經無菌過濾，製備發光底物工作液； 5)洗滌液製備 洗滌液為溶有Tween-20的磷酸鹽緩衝液，其中Tween-20的終濃度為0.01% ; 6)對照品 梅毒螺旋體特異性抗體陰性對照品:由非梅毒感染的健康人群血清配製而成； 梅毒螺旋體特異性陽性對照品:梅毒患者的特異性抗體陽性血清配製而成； 7)製備梅毒螺旋體特異性抗體化學發光檢測試劑盒 將鹼性磷酸酶標記重組抗原、發光底物、洗滌液、梅毒螺旋體特異性抗體陰性對照品、梅毒螺旋體特異性抗體陽性對照品分別裝入瓶內，再將鹼性磷酸酶標記重組抗原瓶、發光底物瓶、梅毒螺旋體特異性抗體陰性對照品瓶、梅毒螺旋體特異性陽性對照品瓶、洗滌液瓶和重組抗原包被微孔板裝入外包裝盒，組成梅毒螺旋體特異性抗體化學發光檢測試劑盒。
3.如權利要求1所述梅毒螺旋體特異性抗體化學發光檢測試劑盒的製備方法，其特徵在於在步驟7)中，所述瓶採用聚乙烯瓶。
【文檔編號】G01N33/571GK104316681SQ201410628360
【公開日】2015年1月28日 申請日期:2014年11月10日 優先權日:2014年11月10日
【發明者】劉莉莉, 楊天賜, 童曼莉, 張惠林, 林麗蓉, 張長弓 申請人:廈門大學附屬中山醫院, 廈門市波生生物技術有限公司