具有對卡那黴素抗性和增強的l－賴氨酸生產力的棒桿菌屬微生物及生產l－賴氨酸的方法

2023-06-26 14:04:16

專利名稱：具有對卡那黴素抗性和增強的l－賴氨酸生產力的棒桿菌屬微生物及生產l－賴氨酸的方法
相關專利申請的交叉參考本申請要求2005年11月30日提交於韓國知識產權局的韓國專利申請10-2005-0115905的利益，其全部內容通過參考結合與此。
背景技術：
1.發明領域本發明涉及具有對卡那黴素抗性和能生產L-賴氨酸的棒桿菌屬的微生物以及使用其生產L-賴氨酸的方法。
2.相關領域的描述Coryneform細菌是屬於棒桿菌屬和短桿菌屬的微生物。
L-賴氨酸是廣泛用於動物飼料、醫藥供應和食品的必需胺基酸。特別是，報導了L-賴氨酸於2004年的用量大約是80萬噸，並且預期將來對L-賴氨酸的需求以每年平均約10％持續增加。
L-賴氨酸由微生物如大腸桿菌，棒桿菌等通過直接發酵而生產，因而通過改善發酵工藝開發具有增加的產率或L-賴氨酸生產力的生產微生物具有極大的經濟效益。
L-賴氨酸由利用細菌的已知方法生產，所述細菌例如各種營養缺陷型突變體，各種抗藥物的細菌，各種對藥物敏感的細菌，各種對抗抗生素的細菌。在這些方法中，已知使用對抗抗生素的細菌的方法包括使用各種細菌的方法，所述細菌抗各種抗生素如利福平和鏈黴素等(參見，例如美國專利號4,623,623)。
然而，尚未報導對卡那黴素具有抗性並且生產L-賴氨酸的細菌，所述卡那黴素是一種基於氨基糖苷的抗生素。
本發明的發明人針對利用棒桿菌屬的微生物通過直接發酵來生產L-賴氨酸的方法進行了廣泛的研究以減少L-賴氨酸的生產成本和增加L-賴氨酸的產率，發現可以通過賦予棒桿菌屬微生物以對抗卡那黴素的抗性而增加L-賴氨酸的生產力，從而完成了本發明。
發明概述本發明提供了具有對卡那黴素抗性和能生產L-賴氨酸的棒桿菌屬微生物。
本發明還提供利用該微生物高產率生產L-賴氨酸的方法。
發明詳述依照本發明的一個方面，提供了能夠生產L-賴氨酸並對卡那黴素有抗性的棒桿菌屬微生物。
該微生物可以是能夠生產L-賴氨酸並且抵抗卡那黴素的棒桿菌屬的任何微生物。例如，棒桿菌屬的微生物可以是穀氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC 13032，Corynebacteriumthermoaminogenes FERM BP-1539，穀氨酸棒桿菌KFCC 10881和穀氨酸棒桿菌KFCC 11001，它們抵抗卡那黴素，但不限於此。
依照本發明一個實施方案的棒桿菌屬的微生物是穀氨酸棒桿菌KFCC10881的變體，其抵抗S-(2-氨基乙基)半胱氨酸，α-氨基-β-羥基戊酸，甲基賴氨酸和疊氮化鈉，並且對亮氨酸具有需求，對高絲氨酸具有寬鬆的需求(leaky requirement)，該變體對卡那黴素有抗性。在本發明的當前實施方案中，該變體是穀氨酸棒桿菌KFCC10881-CJP5103(登記號KCCM-10707P)。
棒桿菌屬的微生物可通過利用已知的突變方法在能夠生產L-賴氨酸的棒桿菌屬微生物中誘導突變，然後在存在卡那黴素的條件下培養得到的產物而獲得。可以通過將能夠生產L-賴氨酸的棒桿菌屬微生物暴露於誘變劑如放射性的輻射或誘變化合物來誘導突變。另外，可以使用位點定向誘變，但誘變並不局限於那些方法。
依照本發明實施方案的穀氨酸棒桿菌KFCC10881-CJP5103(登記號KCCM-10707P)可以通過利用化學誘變劑N-甲基-N』-硝基-N-亞硝基胍賦予親本菌株-穀氨酸棒桿菌KFCC10881以針對卡那黴素的抗性而產生。
特別地，用誘變劑N-甲基-N』-硝基-N-亞硝基胍於30℃處理107-108/ml的親本菌株30分鐘以達到最終濃度500μg/ml，分離在含有5mg/l卡那黴素的基本瓊脂平板培養基中生長的細菌以獲得具有對卡那黴素抗性的突變體。另外，可以通過培養具有對卡那黴素抗性的突變體，彼此比較細菌的L-賴氨酸生產力，並選擇具有改善的L-賴氨酸生產力的細菌而獲得依照本發明當前實施方案的突變體。
親本菌株，穀氨酸棒桿菌KFCC10881，和從其獲得的具有對卡那黴素抗性的突變體具有如下描述的特性。
親本菌株，穀氨酸棒桿菌KFCC10881具有對S-(2-氨基乙基)半胱氧酸的抗性，具有對α-氨基-β-羥基戊酸的抗性，具有對甲基賴氨酸的抗性，和具有對疊氮化鈉的抗性，對高絲氨酸具有寬鬆的需求，並對亮氨酸具有需求。
突變體，穀氨酸棒桿菌KFCC10881-CJP5103具有對S-(2-氨基乙基)半胱氨酸的抗性，具有對α-氨基-β-羥基戊酸的抗性，具有對甲基賴氨酸的抗性，和具有對疊氮化鈉的抗性，對高絲氨酸具有寬鬆的需求，對亮氨酸具有需求，並具有對卡那黴素的抗性。
在本發明的當前實施方案中，卡那黴素是一種氨基糖苷基抗生素，通過結合參與蛋白質合成的核糖體而幹擾蛋白質的合成，從而具有抗生素能力。
如上所述，本發明的微生物具有對卡那黴素的抗性和改善的L-賴氨酸生產力。在賦予親本菌株以卡那黴素抗性的過程中，考慮參與甲基萘醌類生物合成的基因被滅活，結果獲得電子轉運活性降低的突變菌株。由於降低的電子轉運活性，認為細菌的氧需求也降低，因此L-胺基酸的產率增加。然而，依照本發明當前實施方案的微生物機制並不限於這些具體的機制。
本發明還提供一種生產L-賴氨酸的方法，包括培養依照本發明實施方案的微生物；從培養物中收集L-賴氨酸。
在依照本發明當前實施方案的方法中，可以利用任何培養條件和本領域已知的方法來培養棒桿菌屬的微生物。用於培養棒桿菌菌株的培養基的實例是美國細菌學會的普通細菌學方法手冊(Manual of Methods forGeneral Bacteriology by the American Society for Bacteriology)(WashingtonD.C.，USA，1981)中公開的培養基。可以用於培養基中的碳源包括下述碳源糖和碳水化合物如葡萄糖，蔗糖，乳糖，果糖，麥芽糖，澱粉和纖維素；油和脂肪如大豆油，葵花油，蓖麻油和椰子油；脂肪酸如棕櫚酸，硬脂酸和亞麻酸；醇如甘油，乙醇；和有機酸如乙酸。上述提及的糖源的實例可以單獨使用或組合使用。氮源實例包括下述物質蛋白腖，酵母提取物，肉提取物，麥芽提取物，玉米漿，大豆粉和尿素或無機化合物如硫酸銨，氯化銨，磷酸銨，碳酸銨和硝酸銨。磷源的實例包括下述物質磷酸二氫鉀，磷酸氫二鉀，或其相應的鈉鹽。另外，培養基可以包括金屬鹽如硫酸鎂或硫酸鐵，它們對於生長是必需的。另外，除了上述成分外，可以使用生長的必需物質如胺基酸和維生素。而且，可以在培養基中使用適當的前體。在分批或連續方式培養過程中可以向培養基中添加上述成分。
利用鹼性化合物如氫氧化鈉，氫氧化鉀或氨，或利用酸性化合物如磷酸或硫酸可以控制培養基的pH。另外，使用抗泡沫劑如脂肪酸聚乙二醇酯來抑制泡沫的產生。為了維持有氧條件，可以將氧或含氧的氣體如空氣注入到培養基中。培養基的溫度可以是20-45℃，優選25-40℃。可以進行培養直至產生所需量的L-賴氨酸，但進行培養10-160小時是理想的。
可以以連續的方式利用分批、補料分批、重複補料分批或分批發酵法進行培養。這些方法在本領域是眾所周知的，並且本發明並不局限於此。
可以通過用硫酸或鹽酸處理培養基然後結合使用如陰離子交換層析、濃縮、鹽析、等電點沉澱等的方法從培養物中收集L-胺基酸。
通過參考下述實施例將更詳細地描述本發明。這些實施例僅是用於舉例說明的目的，其不是意圖限制本發明的範圍。
實施例實施例1生產對卡那黴素具有抗性的穀氨酸棒桿菌KFCC10881的突變體從通過用化學誘變劑N-甲基-N』-硝基-N-亞硝基胍誘變作為親本菌株的穀氨酸棒桿菌KFCC10881而獲得的產物中篩選對卡那黴素具有抗性並且具有改善的L-賴氨酸生產力的穀氨酸棒桿菌KFCC10881突變體。
首先，於30℃用N-甲基-N』-硝基-N-亞硝基胍處理107-108/ml的親本菌株30分鐘，以達到最終濃度500μg/ml。接著，將誘變的微生物培養在包含濃度為5mg/l的卡那黴素的基本瓊脂平板培養基中，以分離生長的細菌。另外，培養分離的突變體，並測定它的L-賴氨酸生產力，以從分離的突變體中選擇具有最大L-賴氨酸生產力的細菌。
將獲得的對卡那黴素具有抗性的突變體命名為穀氨酸棒桿菌KFCC10881-CJP5103，將其於2005年11月16日保藏在韓國微生物保藏中心(KCCM)，保藏號為KCCM-10707P。
在實施例1中獲得的突變體和親本細菌具有下述特性。
親本細菌，穀氨酸棒桿菌KFCC10881抗S-(2-氨基乙基)半胱氨酸，抗α-氨基-β-羥基戊酸，抗甲基賴氨酸，抗疊氮化鈉，和對高絲氨酸具有寬鬆的需求，並需要亮氨酸。
突變體，穀氨酸棒桿菌KFCC10881-CJP5103抗S-(2-氨基乙基)半胱氨酸，抗α-氨基-β-羥基戊酸，抗甲基賴氨酸，抗疊氮化鈉，和對高絲氨酸具有寬鬆的需求，需要亮氨酸，並且抗卡那黴素。
接著，針對抗卡那黴素的所選擇的突變體穀氨酸棒桿菌KFCC10881-CJP5103和親本細菌進行對卡那黴素的抗性實驗。首先，將兩種微生物培養在LB液體培養基中16小時，然後利用無菌生理鹽水洗滌細胞兩次。然後，適當稀釋洗滌的細胞，並將得到的產物培養在含5mg/l卡那黴素的基本瓊脂平板培養基中4天，以測量每種微生物的生產力。基本瓊脂平板培養基的組成如下每1L的蒸餾水(pH7.0)中10g葡萄糖，2g(NH4)2SO4，2g尿素，1.0g KH2PO4，3.0g K2HPO4，0.5g MgSO4·7H2O，10mg FeSO4·7H2O，10mg MnSO4·7H2O，100μg生物素，100μg硫胺·HCl，100μg CaCl2·2H2O，80μg Na2B4O7·10H2O，40μg(NH4)6MoO27·4H2O，10μgZnSO4·7H2O，300μg CuSO4·7H2O，10μg MnCl2·4H2O，1mg FeCl3·6H2O，20g瓊脂，0.1g L-亮氨酸(如果需要)，0.1g L-蘇氨酸(如果需要)，0.1g L-甲硫氨酸(如果需要)。
測量突變體和親本細菌在含卡那黴素的培養基的生產力的結果示於表1中。
表1.穀氨基棒桿菌KFCC10881和穀氨酸棒桿菌KFCC10881-CJP5103針對卡那黴素的抗性
+++充分生長-無生長實施例2確定穀氨酸棒桿菌KFCC10881-CJP5103的L-賴氨酸生產力將穀氨酸棒桿菌KFCC10881-CJP5103和穀氨酸棒桿菌KFCC10881接種在含下述25ml接種培養基(seed culture medium)的250ml彎頭-擋板燒瓶(corner-baffled flask)中，將得到的產物於30℃培養20小時，同時於220rpm攪拌。接著，將1ml獲得的培養基接種到含25ml下述生產培養基的250ml彎頭-擋板燒瓶中，並將得到的產物於32℃培養96小時，同時於220rpm攪拌。
停止培養後，通過高壓液相色譜(HPLC)測量L-賴氨酸的產生。在穀氨酸棒桿菌KFCC10881和穀氨酸棒桿菌KFCC10881-CJP5103的培養物中L-賴氨酸的量以L-賴氨酸的鹽酸鹽形式表示，分別為44.5g/l和48.1g/l。
接種培養基(pH7.0)20g原糖(raw sugar)，10g蛋白腖，5g酵母提取物，1.5g尿素，4gKH2PO4，8g K2HPO4，0.5g MgSO47H2O，100μg生物素，1,000μg硫胺HCl，2,000μg泛酸鈣，2,000μg煙醯胺(1L蒸餾水為基礎)生產培養基(pH7.0)100g原糖，40g(NH4)2SO4，2.5g大豆蛋白，5g corn steep solid，3g尿素，1g KH2PO4，0.5g MgSO47H2O，100μg生物素，1,000μg硫胺HCl，2,000μg泛酸鈣，3,000μg煙醯胺，30g CaCO3(1L的蒸餾水為基礎)
實施例3從穀氨酸棒桿菌KFCC10881-CJP5103的培養基中分離L-賴氨酸向1L賴氨酸發酵液中加入鹽酸，所述發酵液通過在含糖蜜和原糖的培養基中培養穀氨酸棒桿菌KFCC10881-CJP5103獲得，將發酵液的pH調至pH2.0，鈣離子轉化為CaSO4和CaCl2。然後，通過使培養基向上方流動將培養基吸附到陽離子交換樹脂(Diaion SK-L10)，其以銨的形式再生。通過用軟化水洗滌去除陽離子交換樹脂中的殘餘細菌後，通過用2N氫氧化銨洗脫樹脂收集高度濃縮的賴氨酸。將收集的溶液濃縮並通過冷卻至20℃結晶，同時調整pH至5.0。通過離心分離結晶完全的淤漿獲得首批溼產物，通過分批濃縮和結晶母液獲得第二批溼產物。通過合併首批和第二批溼產物並乾燥所述合併的產物獲得44g的乾燥的賴氨酸產物，其具有98.5％的賴氨酸含量。
實施例4從穀氨酸棒桿菌KFCC10881-CJP5103的培養基中分離L-賴氨酸向1L賴氨酸發酵液中加入硫酸，所述發酵液通過在含糖蜜和原糖的培養基中培養穀氨酸棒桿菌KFCC10881-CJP5103獲得，將發酵液的pH調至pH2.0。然後，通過使培養基向上方流動將培養基吸附到陽離子交換樹脂(Diaion SK-L10)，其以銨的形式再生。通過用軟化水洗滌去除陽離子交換樹脂中的殘餘細菌後，通過用2N氫氧化銨洗脫樹脂收集高度濃縮的賴氨酸。將收集的溶液濃縮並通過冷卻至20℃結晶，同時利用鹽酸調整pH至5.0。通過離心分離結晶完全的淤漿獲得首批溼產物，通過分批濃縮和結晶母液獲得第二批溼產物。通過合併首批和第二批溼產物並乾燥所述合併的產物獲得45g的乾燥的賴氨酸產物，其具有99％的賴氨酸含量。
依照本發明的微生物具有L-賴氨酸生產力。
在利用依照本發明的微生物生產L-賴氨酸的方法中，可以高產率地生產L-賴氨酸。
儘管參考本發明的示例性實施方案已經具體顯示和描述了本發明，本領域的普通技術人員可以理解可以對本發明進行各種形式和細節變化而不背離如後附的權利要求所限定的本發明的精神和範圍。
權利要求
1.棒桿菌屬微生物，其能夠產生L-賴氨酸，並且對卡那黴素有抗性。
2.權利要求1的棒桿菌屬微生物，其中所述微生物是穀氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)KFCC10881的變體，其對S-(2-氨基乙基)半胱氨酸，α-氨基-β-羥基戊酸，甲基賴氨酸和疊氮化鈉有抗性，並且對亮氨酸有需求，對高絲氨酸有寬鬆的需求，所述變體對卡那黴素有抗性。
3.權利要求2的棒桿菌屬微生物，其中所述微生物是穀氨酸棒桿菌KFCC10881-CJP5103(登記號是KCCM-10707P)。
4.一種生產L-賴氨酸的方法，其包含培養依照權利要求1-3任一項的棒桿菌屬微生物；和從培養物中收集L-賴氨酸。
全文摘要
提供了能夠生產L－賴氨酸並對卡那黴素有抗性的棒桿菌屬微生物，以及使用其生產L－賴氨酸的方法。
文檔編號C12R1/15GK1974762SQ20061016370
公開日2007年6月6日 申請日期2006年11月30日 優先權日2005年11月30日
發明者樸英薰, 林相曹, 文準玉, 成珍錫 申請人:Cj株式會社