紅參皂苷Rg3組和Rh2組混合皂苷的製備方法

2023-06-26 15:05:16 1

專利名稱：紅參皂苷Rg3組和Rh2組混合皂苷的製備方法
技術領域：
本發明涉及一種活性高、毒性小，對人體更安全的由紅參稀有皂苷20(5)-Rg3、 20 O ) -Rg3、Rkl和Rg5等四種組成的Rg3組混合皂苷、由紅參稀有皂苷20⑶-Rh2, 20 O ) -Rh2, Rk2和他3等四種組成的Μι2混合皂苷的製備方法。
背景技術：
人參皂苷2OC )-Rg3、2O0 )-Rg3、Rkl 和 Rg5 等四種，20 C )-Rh2、20 O )-Rh2、Rk2 和Μι3等四種是紅參中存在的紅參稀有皂苷。紅參加工過程中白參的原人參二醇類的Rbl、 Rb2、Rc或Rd在人參自身酶與其他物質的作用下轉化為20 C ) -Rg3和20 O ) -Rg3皂苷，進一步脫水20⑶-Rg3和20 O ) -Rg3皂苷的20-碳上的羥基，形成順反結構的Rg5和Wd皂苷， 形成Rg3組皂苷。同樣，紅參加工過程中白參的原人參二醇類的Rbl、Rb2、Rc和Rd在人參自身酶與其他物質的作用下轉化為20(5)-他2、20 0 )-他2、Rk2和他3皂苷，形成他2組皂苷(發明專利ZL 200510136799.8 高活性紅參的製作方法)。Rg3組和詘2組混合皂苷比Rg3、Rg5、Rh2, Rh3單體皂苷對人體更安全，毒性少； Rg3組和他2組中四種結構相似的皂苷起協同作用，比單體皂苷生理活性更高，對人參製品、保鍵食品和化妝品以及藥物開發意義很大。但是從紅參中分離提取由20(5)-Rg3、 20 O ) -Rg3、Rkl和Rg5等四種皂苷組成的Rg3組皂苷，分離提取由20⑶-Rh2、20 O ) -Rh2、 Rk2,Rh3等四種皂苷組成的Μι2組皂苷，難度很大，迄今為止沒有相關報導。

發明內容
本發明是從參根中提取含有人參自身皂苷酶和其他水溶性物質的提取物(不含皂苷、簡稱人參自身酶及水溶性物質的提取物)，與原人參二醇類Rbl、Rb2、Rc或Rd單體或者其混合物、或者F2皂苷反應，製備活性高、毒性小，對人體更安全的由紅參稀有皂苷20⑶-Rg3、20 O ) -Rg3、Rkl和Rg5等四種組成的Rg3組混合皂苷、由紅參稀有皂苷 20 C ) -Rh2、20 O ) -Rh2、Rk2和Rh3等四種組成的Rh2混合皂苷。本發明的技術解決方案是一種紅參皂苷Rg3組和他2組混合皂苷的製備方法，其特徵在於按如下步驟進行
a.人參根(以乾物計算)中加入6 10倍的65 80%乙醇，5(T75°C提取皂苷，重複2 3次； 提取皂苷後的濾渣中再加入6 10倍水(以乾物計算)，6(T80°C提取人參自身酶及水溶性物質，重複2 3次；將所提取的人參自身酶及水溶性物質在品溫65°C以下減壓濃縮、得到波美 58 62度的提取液，既為人參自身酶及水溶性物質的提取物；
b.向所得人參自身酶及水溶性物質的提取物中加入原人參二醇類Rbl、Rb2、Rc或Rd 單體或者其混合物、或者F2皂苷，加入量與人參自身酶及水溶性物質的提取物的重量比是 1 0.廣20，所述原人參二醇類Rbl、Rb2、Rc或Rd單體或者其混合物、或者F2皂苷的反應濃度為0.廣10% ；反應後分離皂苷。所述b步驟的反應過程中還加有有機酸，有機酸的加入量為反應體積的0. 0 ~50%。本發明工藝方法簡單，可從人參根中提取活性高、毒性小，對人體更安全的由紅參稀有皂苷20 {$) -Rg3、20 O ) -Rg3、Rkl和Rg5等四種組成的Rg3組混合皂苷、由紅參稀有皂苷20 (5·) -Rh2,20 O ) -Rh2,Rk2和詘3等四種組成的Μι2混合皂苷，可廣泛應用於人參製品、 保鍵食品和化妝品以及藥物等開發。


圖1是本發明實施例lRg3組HPLC檢測圖譜。圖2是本發明實施例lRg3組進行UPLC-Q/T0F檢測圖譜。圖3是本發明實施例lRg3組進行UPLC-Q/T0F檢測，ESI+正模式下總離子流圖譜。圖4是本發明實施例lRg3組進行UPLC-Q/T0F檢測，ESI-負模式下總離子流圖譜。圖5是本發明實施例lRg3組中第一峰的離子峰在ESI+正模式下進行一級質譜分析的質譜圖。圖6是本發明實施例lRg3組中第二峰的離子峰在ESI+正模式下進行一級質譜分析的質譜圖。圖7是本發明實施例lRg3組中第三峰的離子峰在ESI+正模式下進行一級質譜分析的質譜圖。圖8是本發明實施例lRg3組中第四峰的離子峰在ESI+正模式下進行一級質譜分析的質譜圖。圖9是本發明實施例lRg3組中第一峰的離子峰在ESI-負模式下進行一級質譜分析的質譜圖。圖10是本發明實施例lRg3組中第二峰的離子峰在ESI-負模式下進行一級質譜分析的質譜圖。圖11是本發明實施例lRg3組中第三峰的離子峰在ESI-負模式下進行一級質譜分析的質譜圖。圖12是本發明實施例lRg3組中第四峰的離子峰在ESI-負模式下進行一級質譜分析的質譜圖。圖13是本發明實施例2他2組HPLC檢測圖譜。圖14是本發明實施例2詘2組進行UPLC-Q/T0F檢測圖譜。圖15是本發明實施例2他2組中第一峰的離子峰在ESI-負模式下進行一級質譜分析的質譜圖。圖16是本發明實施例2他2組中第二峰的離子峰在ESI-負模式下進行一級質譜分析的質譜圖。圖17是本發明實施例2他2組中第三峰的離子峰在ESI-負模式下進行一級質譜分析的質譜圖。圖18是本發明實施例2他2組中第四峰的離子峰在ESI-負模式下進行一級質譜分析的質譜圖。
具體實施方式
實施例1
參根中含有人參自身皂苷酶(C Zhang, H Yu, Y Bao, L An, F Jin (金鳳燮)伐湖. Pharm. Bull. , 2001，49(7)，795-798. ； Process BioChem. , 2002, 37，793-798·)。本發明從人參根中提取不含皂苷、含有人參自身皂苷酶和其他水溶性物質的提取物(人參自身酶及水溶性物質的提取物)，與原人參二醇類的Rbl、Rb2、Rc或Rd單體或者其混合物反應，製備由2O(5)-Rg3、2O0 )-Rg3、RkU Rg5等四種皂苷組成的Rg3組皂苷；與人參皂苷F2 反應，製備由2O(5)-Rh2、2O0 )-Rh2、Rk2、Rh3等四種皂苷組成的Rh2組皂苷。1、人參根的人參自身酶及水溶性物質的提取物的製備
新鮮人參3. 5公斤(相當於1公斤幹參)切成2毫米厚的片，加入8升的95%的乙醇，在 50-60°C提取人參皂苷6小時，分離提取液；其渣中再加入8升的70-75%的乙醇提取，共提取3次；合併乙醇提取液，用於製備人參皂苷。人參皂苷提取過的渣中加入8升水，在75°C 以下提取6小時，同樣方法共提取3次；合併提取液，品溫在60°C以下減壓濃縮至波美60 度，離心除渣、得到200-300毫升人參自身酶及水溶性物質的提取物，用於Rg3組和他2組紅參皂苷的製備。也可以用生曬乾燥人參切成2毫米厚片的1公斤生曬乾燥人參中，加入8升的 70-75%的乙醇，在50°C提取人參皂苷6小時；同樣方法共提取3次；合併乙醇提取液，用於製備人參皂苷。人參皂苷提取過的渣中加入8升水，在75°C以下提取6小時，同樣方法共提取3次；合併提取液，品溫在60°C以下減壓濃縮至波美60度，離心除渣、得到200-300毫升人參自身酶及水溶性物質的提取物，用於Rg3組和Μι2組紅參皂苷的製備。幾次試驗，原料可以是人參、也可以是西洋參或者三七參的鮮參或者幹參。人參根 (以乾物計算)中加入6-10倍的65-80%乙醇、在50-75°C提取皂苷，可重複3次；提取皂苷的渣中再加入幹渣的6-10倍水在60-80°C提取，重複2-3次；所提取的水溶性物質，在品溫 65°C以下減壓濃縮，均得到所需要的人參根的複合物酶及水溶性物質提取物。2、Rg3組紅參混合皂苷的製備
50克的原人參二醇類的Rbl、Rb2、Rc和Rd混合皂苷加入於300毫升水中，研磨，再加入 100毫升的上述1的人參自身酶及水溶性物質的提取物和600毫升的水，在80°C反應6小時，110°C滅酶0. 5-1小時，幾乎所有的原人參二醇類的Rbl、Rb2、Rc和Rd混合皂苷轉化為紅參皂苷20 (5·) -Rg3、20 O ) -Rg3、Rkl和Rg5混合皂苷。其反應液經1升的大孔樹脂(HP-20 大孔樹脂，日本三菱公司產；或者AB-8大孔樹脂，天津南開大學產)柱吸附皂苷，再用8升的水洗掉未吸附的糖和渣；再用6升的75-80%乙醇洗脫皂苷，其洗脫液減壓濃縮、乾燥得36 克的20⑶-Rg3、20 O ) -Rg3、Rkl和Rg5混合皂苷，即得Rg3組紅參混合皂苷。幾次上述反應中，使用原人參二醇類的Rbl、Rb2、Rc或Rd單體皂苷，其結果與使用 Rbl、Rb2、Rc和Rd混合皂苷效果相同；製備中，人參皂苷的反應濃度0. 1-10%,人參皂苷與人參自身酶及水溶性物質的提取物(人參根幹品原料計算)的反應比例(重量)是1 :0. 1-20 倍，反應溫度70-120°C，均得到良好的效果。原人參二醇類Rbl、Rb2、Rc和Rd單體或者其混合皂苷可在市場上購買。實施例1所得Rg3組紅參皂苷，用高效液相色譜法(HPLC)和超高效液相色譜-質譜聯用法(UPLC-Q/T0F)確認。1) Rg3組紅參混合皂苷的確認Rg3組紅參皂苷測定的高效液相色譜儀，美國waters 2695儀器；檢測器，Photodiode Array Detector Waters 2996 ；Knauer C18 色譜柱(250mmX3mm)；流動相，乙腈(A)-水 (B) ；(T35min，19%A 等度；；35 55min，19%A 29%A 線性梯度；55 65min， 40%A 線性梯度； 65 95min，40%A 100%A線性梯度；進樣量，10 μ L ；柱溫，35°C ；體積流速，0. 6mL/min ；檢測波長，203nm。取上述Rg3組混合皂苷2毫克，溶解於1毫升的甲醇中，經0. 45 μ m濾膜過濾，高效液相色譜(HPLC)檢測結果，與標準品2O(5)-Rg3、2O0 )-Rg3、Rkl和Rg5皂苷比較，如圖 1所示。從圖1中可以看到，與標準品皂苷相比較，Rg3組含有2O(5)-Rg3、2O0 )_Rg3、Rkl、 Rg5四種皂苷，總含量90%以上；各皂苷含量比(峰面積比)為20⑶-Rg3 :20⑷-Rg3 =Rkl Rg5 = 29 26 :21 :24。2)超高效液相色譜-質譜聯用法(UPLC-Q/T0F)核對Rg3組的四種皂苷 超高效液相色譜-質譜聯用分析儀UPLC-Q/T0F Premier Micromass (Waters)儀
器；色譜柱BEH shield RP18 (2. 1 X 100mm，1. 7 μ m，Waters)。超高效液相色譜-四級杆串聯質譜聯用檢測在UPLC-Q/TOF PremierTM Micromass (Waters)儀器完成。ESI源，正、 負離子模式下，「V」模式下進行檢測。超高效液相色譜(UPLC)檢測條件流動相為(A) 0. 1%甲酸-乙腈——(B) 0. 1% 甲酸-水；梯度洗脫(T5min，5%A 95%A線性梯度，5 lOmin，95%A等度。進樣量，10 μ L ；流速，0.5 mL/min ；柱溫，30°C ；檢測波長，203nm。四級時間飛行串聯質譜(Q/T0F)檢測條件毛細管電壓，2. 5kv ；樣品孔電壓，35v ； 離子源溫度，100°c ；脫溶劑氣溫度，350°C ；錐孔氣流速，50L/hr ；脫溶劑氣流速，1000L/hr ； 質量掃描範圍，IOO-IOOODa0Rg3 組中 20 (S) -Rg3 和 20 O ) -Rg3 皂苷分子式為 C42H72O13 ；分子量為 784 ； Rg5 和 Rkl 分子式，C42H70O12 ；分子量，766。上述的收3組樣品進行UPLC-Q/T0F檢測，得到的圖譜如圖2、3、4所示。從圖2、3、4中可以看出，收3組樣品的UPLC圖譜有四個明顯的紫外吸收峰，和圖 1的HPLC檢測的2OC )-Rg3、2O0 )-Rg3、RkU Rg5的紫外吸收峰一致，其保留時間依次為 3. 77,3. 83,4. 43,4. 49 (min)。在正、負離子模式下，通過串聯質譜(Q/T0F)檢測、得到Rg3 組樣品的總離子流圖，也有四個峰，其和UPLC圖譜有四個明顯的紫外吸收峰一致，保留時間分別為 3. 81,3. 87,4. 46,4. 51 (min)。由此，可以進行總離子流各峰的一級質譜分析，確定Rg3樣品中各物質的分子量。(1) Rg3組人參稀有皂苷在ESI+正模式下的一級質譜分析
首先對Rg3組第一、第二的離子峰在ESI+正模式下進行一級質譜分析，得到的一級質譜如圖5、6所示。20C )-Rg3和2O0 )-Rg3的分子量為784 ；從圖5、6中可以看出，在ESI+正模式下，使第一、第二峰物質分子上加了一個H，形成了 m/z為785的準分子離子峰，即[M+H]+。 m/z767離子是為m/z785離子峰失去一分子H2O產生的碎片；m/z 605離子為m/z785離子峰失去末端的葡萄糖基，再失去一分子H2O產生的碎片；m/z461離子為m/z785離子峰失去兩個葡萄糖基所產生的碎片；m/z443、m/z425、m/z407離子為m/z461碎片再依次失去一分子吐0產生的碎片；因此第一、第二峰物質的分子量為784 ；可確定為第一峰為20(5)-Rg3 ； 第二峰為 2O0 )-Rg3。再對Rg3組的第三、第四離子峰在ESI+正模式下進行一級質譜分析，得到的一級質譜如圖7、8所示。Rkl和Rg5的分子量為766 ；從圖7、8中可以看出，在ESI+正模式下，使第三、第四峰的物質的分子加上了一個H，形成了 m/z為767的準分子離子峰，即[M+H] +。m/z785離子峰歸屬於ESI+模式下形成的[M+H20] +。m/z749離子是m/z767離子峰失去一分子H2O所產生的碎片；m/z 605離子為m/z767離子峰失去末端的葡萄糖所產生的碎片；m/z587離子是 m/z605離子峰再失去一分子H2O所產生的碎片；m/z443離子是m/z767離子峰失去兩個葡萄糖基所產生的碎片；m/z425和m/z407離子是m/z443碎片再依次失去一分子H2O所產生的碎片。由此得到第三、第四峰物質的分子量為766 ；可確定為Wd和Rg5皂苷。(2) Rg3組人參稀有皂苷在ESI-負模式下進行一級質譜分析
首先對收3組的第一、第二離子峰在ESI-負模式下進行一級質譜分析，得到的一級質譜如圖9、10所示。2OC )-Rg3、2O0 )_Rg3分子量為784 ；從圖9、10中可以看出，在ESI-負模式下形成[第一、第二峰物質+HC00H]一離子峰，而負離子模式下又減少一個H，所以通過Q/T0F得到的離子峰m/z 829;其物質丟失一甲基後生成核離子碎片m/z 783。故可判斷，樣品中含有20⑶-Rg3和20 O ) _Rg3，其分子量為784。再對Rg3組的第三、第四離子峰在ESI-負模式下進行一級質譜分析，得到的一級質譜如圖11、12所示。Rkl和Rg5的分子量為766 ；從圖11、12中可以看出，在ESI-負模式下，形成[第三、第四峰物質+HC00H]一離子峰，而負離子模式下又減少一個H，所以第三、第四峰得到離子峰m/z 811，其丟失一甲基後生成核離子碎片m/z765。故可判斷，樣品中含有Wd和Rg5， 其分子量為766。由此重新證明，所製備的Rg3組中含有2OC )-Rg3、2O0 )_Rg3、Rkl和Rg5等四種紅參稀有皂苷；結構式分別為
經過幾次試驗，所製備的Rg3組中20 (5·) -Rg3和20 O ) -Rg3在Rg3組總皂苷中的含量比例的範圍20-80%。實施例2
權利要求
1.一種紅參皂苷Rg3組和他2組混合皂苷的製備方法，其特徵在於按如下步驟進行a.人參根(以乾物計算)中加入6 10倍的65 80%乙醇，5(T75°C提取皂苷，重複2 3次； 提取皂苷後的濾渣中再加入6 10倍水(以乾物計算)，6(T80°C提取人參自身酶及水溶性物質，重複2 3次；將所提取的人參自身酶及水溶性物質在品溫65°C以下減壓濃縮、得到波美 58 62度的提取液，既為人參自身酶及水溶性物質的提取物；b.向所得人參自身酶及水溶性物質的提取物中加入原人參二醇類Rbl、Rb2、Rc或Rd 單體或者其混合物、或者F2皂苷，加入量與人參自身酶及水溶性物質的提取物的重量比是 1 0.廣20，所述原人參二醇類Rbl、Rb2、Rc或Rd單體或者其混合物、或者F2皂苷的反應濃度為0.廣10% ；反應後分離皂苷。
2.根據權利要求1所述紅參皂苷Rg3組和他2組混合皂苷的製備方法，其特徵在於所述b步驟的反應過程中還加有有機酸，有機酸的加入量為反應體積的0. 0廣50%。
全文摘要
本發明公開一種紅參皂苷Rg3組和Rh2組混合皂苷的製備方法，是用人參根中提取的不含皂苷、含有人參自身皂苷酶和其他水溶性物質的提取物，與原人參二醇類皂苷Rb1、Rb2、Rc或Rd單體或者混合物皂苷反應，製備由20(S)-Rg3、20(R)-Rg3、Rk1和Rg5紅參皂苷組成的Rg3組皂苷；與人參皂苷F2反應，製備由20(S)-Rh2、20(R)-Rh2、Rk2和Rh3紅參皂苷組成的Rh2組皂苷。Rg3組和Rh2組混合紅參皂苷比Rg3和Rh2等單體皂苷對人體更安全，活性更高，可用於人參製品、保健品和化妝品和其他藥物開發。
文檔編號C12P33/20GK102352402SQ201110214290
公開日2012年2月15日 申請日期2011年7月29日 優先權日2011年7月29日
發明者金鳳燮, 魚紅閃 申請人:金鳳燮