油菜抗裂角性狀主效基因位點分子標記及應用的製作方法

2023-06-26 22:48:21 1

專利名稱：油菜抗裂角性狀主效基因位點分子標記及應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於分子生物學及遺傳育種技術領域，具體涉及甘藍型油菜抗裂角性狀主效基因位點及其緊密連鎖的分子標記，同時還涉及該分子標記在油菜高抗裂角育種中的應用。
背景技術：
油菜是世界第三大油料作物，也是我國繼水稻、小麥、玉米和大豆之後的第五大農作物，全世界大約13%的植物油來自於油菜。除了作為食用油的主要原料之外，油菜也是重 要的工業原料和歐盟主要成員國可再生能源的主要生物資源。我國油菜的種植面積和總產量均佔世界的30%左右，它不僅關係到我國種植業結構的調整、優化和近億農民的增收，也關係到滿足人民生活水平提高、膳食結構改善及保障國家食物安全的需要，因此，加強油菜生產意義重大。機械化是現代農業發展的方向，而油菜角果易開裂正是目前制約油菜產業機械化收穫的瓶頸，嚴重地影響著油菜產業生產效率的提高。由於目前生產上利用的甘藍型油菜在成熟時特別容易裂角，一般都會造成產量損失10%左右，機械化收割損失將更加嚴重。如果遇到成熟期氣候比較惡劣，產量損失可高達50%以上，造成豐產不豐收。而且，易裂角除了帶來產量損失外還會造成一系列其他的不良影響，如落地籽粒在條件適宜時會萌發形成自生苗，影響下茬作物生長，同時也增加了使用除草劑去除再生苗的成本。未來隨著轉基因油菜的推廣應用，角果開裂種子散落還會帶來生態風險。目前生產上為了避免裂角造成的產量損失和對下茬作物的不良影響，通常是提前收穫，但這樣做會造成油菜籽含油量下降，種子中葉綠素含量過高，影響食用油的品質。因此，選育抗裂角的油菜品種對油菜生產顯得極為重要。但一般甘藍型油菜品種間抗裂角特性變異不大，在其他的近緣種中雖然存在抗裂角特性，但通過遠緣雜交很難除去不良農藝性狀的影響。雖然目前在擬南芥中已有許多與角果發育和開裂有關的基因被克隆，利用這些基因來抑制油菜角果開裂和防止種子損失已經成為可能，但有關基因轉化的結果是導致角果成筒狀結構，致使角果完全不能開裂，造成脫粒十分困難。因此，對甘藍型油菜抗裂角資源的發掘以及對抗裂角性狀主效基因位點的開發，有助於我們未來培育適用的抗裂角優異甘藍型油菜品種。大多數重要的農藝性狀均表現數量性狀的遺傳特點，如產量性狀、含油量、成熟期、品質、抗旱性等。數量性狀易受環境條件的影響，因此選擇效果不好。傳統育種方法周期長，主要是由數量性狀造成的。由於分子標記技術的發展，人們已可將複雜的數量性狀進行分解，像研究質量性狀基因一樣對控制數量性狀的多個基因進行研究。數量性狀基因座(quantitat ive trait locus,簡稱QTL)是在高密度的遺傳圖譜基礎上,通過一定實驗設計，獲得分子標記，藉助Mapmaker軟體分析確定控制某一性狀的基因在染色體上的位置。當目標性狀由少數幾個基因控制時用標記選擇，對發掘遺傳潛力非常有效。本研究通過遺傳分析及QTL定位，旨在篩選出對油菜抗裂角具有正向效應的QTL，用於油菜抗裂角的分子標記輔助選擇、分子育種及抗裂角基因的克隆。

發明內容
本發明目的是在於提供了一個油菜抗裂角性狀的主效基因位點的分子標記BrSF0007-39，該分子標記不僅有助於輔助篩選抗裂角材料，同時也有助於深入了解中雙11號高抗裂角性狀構成的分子機理，為今後主效QTL的精細定位及克隆奠定基礎。本發明的另一個目的在於一個油菜抗裂角性狀的主效基因位點的分子標記的弓I物，對今後中雙11號及其及其衍生品系的抗裂角性狀育種提供了極大的便利。本發明還有一個目的是提供了一個油菜抗裂角性狀的主效基因位點的分子標記在油菜產量育種中的應用。分子標記篩選主要優點就是可以在苗期篩選，大大節約成本和篩選工作量。常規篩選方法需要等到油菜完全成熟以後才能選擇，不能在苗期淘汰掉絕大部分不抗裂角的材料，進而可以快速篩選出高抗裂角株系用於油菜抗裂角育種。
為了實現上述的目的，本發明採用以下技術措施一種油菜抗裂角性狀主效基因位點的分子標記，其篩選步驟是a)利用在抗裂角指數上有極顯著差異的油菜品種中雙11(抗裂角指數為0. 83)和73290 (抗裂角指數為0. 48)雜交，雜種Fl代自交產生F2和F2:3代分離群體；b)採用CTAB法提取親本中雙11和73290及F2分離群體的葉片總DNA，過程中所用到的試劑包括提取液(I. 4M NaCiaOOmM Tris, pH8. 0,20mM EDTA, pH8. 0，2%CTAB)、氯仿、異戊醇、無水乙醇；c)合成油菜SSR引物，並對親本DNA進行PCR擴增，產物在變性聚丙烯醯胺凝膠中電泳，染色和顯影后對條帶的大小進行判別，篩選多態性引物；d)利用多態性引物對F2代分離群體進行基因型分析和遺傳圖譜的構建，結合其抗裂角指數的性狀數據進行QTL定位，檢測到油菜第9染色體具有一個QTL位點Psr. A9 (見表2)，與其性狀緊密連鎖的SSR標記為BrSF0007_39，該標記位於QTL位點Psr. A9的置信區間內，在中雙11號中可擴增出大小為204bp和228bp的兩條帶，在73290中只能擴出大小為228bp和260bp的兩條帶(圖4)，引物序列為BrSF0007_39_F 5』 -ACCAAACCAAACCAAACCAA-3』，BrSF0007_39-R : 5』 -CGATCTTTTGGTGGAAGGAA-3』 ；Joinmap3. 0作圖軟體用於對所獲得的多態性標記位點進行連鎖分析，WinQTL cart2. 5軟體用於QTL分析。本研究用到的兩個親本材料抗裂角指數相差接近一倍，均由中國農業科學院油料作物研究所油菜生物技術育種課題組科技人員在王漢中研究員帶領下育成。中雙11號及73290來源詳見遺傳資源來源披露登記表。油菜兩親本、後代分離群體單株抗裂角指數的測定參照文獻(文雁成，甘藍型油菜抗裂角品種的篩選與分析，作物學報，2008，I)中的隨機碰撞法完成，植物葉片總DNA的提取、PCR及聚丙烯醯胺凝膠電泳均為常用的分子生物學技術，通常按照常規條件如Sambrook等人,分子克隆實驗室手冊(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989),和 Draper 等人,Blackwell,科學出版社，1988 中的條件進行。實驗過程中涉及的所有試劑[包括CTAB提取液(0.2M Tris — C1，0. 25M NaCl, 25mMEDT A，0. 5% (質量比)SDS, pH7. 5，Taq酶，dNTP，丙烯醯胺，尿素，冰醋酸，AgNO3，氯仿，異戊醇，RNA酶和無水乙醇]均可從商業途徑獲得，並按照實驗手冊中的條件或所用試劑製造廠商所建議的條件使用。
利用上述技術措施，申請人最終獲得了一種油菜抗裂角性狀主效基因位點的分子標記，具體如下該標記位於QTL位點Psr. A9的置信區間內，其引物序列為BrSF0007_39_F 5』 -ACCAAACCAAACCAAACCAA-3』，BrSF0007-39-R :5』 -CGATCTTTTGGTGGAAGGAA-3 。Psr. A9,該主效基因位點位於油菜第9染色體，和分子標記BrSF0007-39緊密連鎖，利用QTLCart2. 5軟體分析測得其對油菜抗裂角性狀的貢獻率為32. 7%,加性效應為0. 87，顯性效應為0. 97，屬於完全顯性遺傳。一種抗裂角主效基因位點Psr. A9的分子標記BrSF0007_39在油菜產量育種中的應用利用Psr. A9位點的分子標記BrSF0007_39對兩親本的F3代進行基因型鑑定，並在收穫後進行抗裂角性狀的考種。結果表明，通過分子標記輔助選擇得到的植株抗裂角指數超過F2:3家系均值(抗裂角指數0. 655)的佔85. 7%，在保留下來的植株再篩選高油、高產的株系。常規篩選方法需要等到油菜完全成熟以後才能選擇，不能在苗期淘汰掉絕大部分 不抗裂角的材料，通過鑑定上述抗裂角主效基因位點來預測油菜抗裂角性，可迅速提高油菜高抗裂角、高產品種篩選的效率，加快育種進程。與現有技術相比，本發明具有以下優點I、本發明首次定位了油菜品種中雙11控制抗裂角性狀的主效基因位點，它對油菜抗裂角性狀的貢獻率為32. 7%，使得油菜抗裂角主效基因位點的定位工作居於同領域世界前列，基於此位點篩選連鎖分子標記對目標性狀判斷的準確性大大提高。2、在常規育種方法中，抗裂角性狀鑑定要等到成熟期收穫後考種，受環境影響較大而且費時費力。因此，選擇效率低且成本高。通過檢測抗裂角性狀主效QTL位點，可以在苗期進行淘汰，不僅節約生產成本而且大大提高選擇效率。3、本發明中抗裂角主效基因位點位置明確，主效基因位點的檢測方法方便快速，不受環境影響。通過檢測與抗裂角性狀相關的分子標記，即可以預測抗裂角指數的高低，進而可以快速篩選高抗裂角株系，輔助育種選擇目標明確，節約成本。


圖I為一種中雙11X73290組合F2和F2:3群體在武漢種植時的抗裂角指數分布圖。結果表明抗裂角表型呈連續性分布，證明抗裂角屬於數量性狀。圖2為一種A9連鎖群標記示意圖。右半部分指示該連鎖群上的標記名稱，左半部分指示每個標記對應的遺傳圖距。圖3為一種位於第9連鎖群上的抗裂角主效基因位點LOD曲線示意圖。圖中橫坐標代表連鎖群，縱坐標代表LOD值。圖4為一種利用分子標記BrSF0007_39對F3單株進行基因型分析和篩選示意圖。圖中1-39為F3單株編號，最後兩個Pl和P2分別代表親本中雙11和73290。
具體實施例方式實施例I.油菜抗裂角分離群體的構建及性狀測定本實施例中使用的群體為油菜高抗裂角和不抗裂角親本(中雙11 :抗裂角指數0.83 ；73290 :抗裂角指數0. 48)雜交後代一 F2和F2:3群體。親本、F2和F2:3群體的抗裂角表型在成熟期收穫後經考種鑑定。F2和F2:3分離群體抗裂角指數結果表明兩群體抗裂角指數均呈連續分布，但變異分布不呈典型正態分布，證明抗裂角性狀屬於數量性狀且存在主效基因位點(圖I)。
實施例2.親本、F2和F2:3分離群體葉片總DNA的提取利用CTAB法提取葉片總DNA，具體步驟如下A.取0. I克油菜葉片鮮樣放入研磨，加700微升提取液研磨，隨即裝入I. 5毫升離心管中置於65° C恆溫水浴60分鐘，其間混合2-3次；B.加等體積的苯酚氯仿異戊醇(25 24 :1，V / V / V)，輕輕顛倒使其充分混勻；12000rpm離心10分鐘使其分層，輕輕吸取上清液轉入另一 I. 5毫升離心管；加等體積的氯仿異戊醇(24 :1，V / V)重新抽提一次；C.加入I毫升的-20° C預冷無水乙醇，置於-20° C冷凍不超過30分鐘讓DNA析出；12000rpm離心10分鐘，倒掉離心管中乙醇溶液；用75%乙醇清洗2_3次；倒掉浸泡液，打開離心管蓋置於通風櫥內吹乾；D.乾燥後加入 TE (IOmM Tris, pH8. 0 ；lmM EDTA, pH8. 0)溶解 DNA ;紫外分光光度計測定DNA的濃度，於_20°C冰箱中保存備用；實施例3.引物的開發合成及多態性的篩選我們採用的SSR引物包括兩類一類是已發表文章和芸苔屬資料庫中公開的引物序列(http://www. brassica. info/resource/markers/ssr-exchange. php),包括 CB, CNU,niab, MR, FITO, 01，BRMS, BRAS, Ni, Na, BN, NGA, MB, BnGMS, BrGMS, BoGMS, BnEMS,等許多系列；另一類是我們根據白菜和甘藍測序後拼接成的scaffold序列開發的，分別命名為BrSF和BoSF系列，具體的開發方法是先利用SSRHunter軟體在每個scaffold搜索SSR，然後用Primer3. 0軟體設計SSR引物。我們已經通過生物公司合成了公共和新開發的SSR引物共3085對，篩選結果表明，有15%引物的擴增產物在雙親間存在長度多態性差異。多態性篩選程序如下(I)從親本中各隨機選擇10株DNA等量混合，作為篩選引物的模板。(2) PCR 反應體系
權利要求
1.一種油菜抗裂角性狀主效基因位點的分子標記，其篩選步驟是 a)利用在抗裂角指數上有極顯著差異的油菜品種中雙11和73290雜交，雜種Fl代自交產生F2和F2:3代分離群體； b)採用CTAB法提取親本中雙11和73290及F2分離群體的葉片總DNA； c)合成油菜SSR引物，並對親本DNA進行PCR擴增，產物在變性聚丙烯醯胺凝膠中電泳，染色和顯影后對條帶的大小進行判別，篩選多態性引物； d)利用多態性引物對F2代分離群體進行基因型分析和遺傳圖譜的構建，結合其抗裂角指數的性狀數據進行QTL定位，檢測到油菜第9染色體具有一個QTL位點Psr.A9,與其性狀緊密連鎖的SSR標記為BrSF0007-39，該標記位於QTL位點Psr. A9的置信區間內，在中雙11號中擴增出大小為204 bp和228 bp的兩條帶，引物序列為 BrSF0007-39-F :5，-ACCAAACCAAACCAAACCAA-3，，即 SEQ ID NO:I, BrSF0007-39-R 5，-CGATCTTTTGGTGGAAGGAA-3，，即 SEQ ID NO:2。
2.根據權利要求I所述的油菜抗裂角性狀主效基因位點的分子標記，其特徵在於所述的QTL位點Psr. A9位於油菜第9染色體，對油菜抗裂角性狀的貢獻率為32. 7%,加性效應為0. 87，顯性效應為0. 97，屬於完全顯性遺傳。
3.權利要求I所述的一種油菜抗裂角性狀主效基因位點的SSR分子標記，其特徵在於分子標記的引物序列為 fcSF0007-39-F :5』 -ACCAAACCAAACCAAACCAA-3』，BrSF0007-39-R 5』 -CGATCTTTTGGTGGAAGGAA-3』。
4.權利要求I或2所述分子標記在油菜高抗裂角育種中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種油菜抗裂角性狀主效基因位點分子標記及應用，步驟包括1)利用在抗裂角性狀上有顯著差異的甘藍型油菜品種中雙11和73290雜交，後代自交獲得抗裂角性狀分離的F2和F2:3分離群體；2)利用SSR引物對親本DNA進行多態性的篩選，通過對F2代分離群體進行SSR分子標記基因型分析構建遺傳連鎖圖譜；3)通過對F2和F2:3分離群體進行田間實驗和考種獲得抗裂角性狀的表型數據；4)結合開發的高密度分子標記遺傳連鎖圖譜，以及分離群體的基因型和表型數據，利用QTLCart2.5軟體進行QTL檢測，檢測到甘藍型有愛A9連鎖群上控制油菜抗裂角的主效基因位點Psr.A9，與該主效基因位點緊密連鎖的分子標記BrSF0007-39，利用該標記進行輔助選擇可大大提高抗裂角育種的選擇效率。
文檔編號C12Q1/68GK102747080SQ20121024336
公開日2012年10月24日 申請日期2012年7月16日 優先權日2012年7月16日
發明者劉貴華, 華瑋, 師家勤, 楊慶, 王新發, 王漢中, 胡志勇, 黃順謀 申請人:中國農業科學院油料作物研究所